Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Resumo

A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O₂ estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O₂ pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.

Resumo

A microrrespirometria coulométrica é um método simples e barato para medir o consumo de O₂ de pequenos organismos, mantendo um ambiente estável. Um microrrespirômetro coulométrico consiste em uma câmara hermética na qual o O 2 é consumido e o CO₂ produzido pelo organismo é removido por um meio absorvente. A diminuição de pressão resultante desencadeia a produção eletrolítica de O 2, e a quantidade de O₂ produzida é medida registrando-se a quantidade de carga usada para gerá-la. No presente estudo, o método foi adaptado para Drosophila melanogaster testado em pequenos grupos, com a sensibilidade do aparelho e as condições ambientais otimizadas para alta estabilidade. A quantidade de O₂ consumida por moscas selvagens neste aparelho é consistente com a medida por estudos anteriores. O consumo de_O2 específico em massa pelos mutantes CARSK, que são menores e sabidamente menos ativos, não foi diferente dos controles congênicos. No entanto, o pequeno tamanho dos mutantes CASK resultou em uma redução significativa no consumo de O₂ por mosca. Portanto, o microrrespirômetro é capaz de medir o consumo de O₂ em D. melanogaster, pode distinguir diferenças modestas entre genótipos e adiciona uma ferramenta versátil para medir taxas metabólicas.

Introdução

A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida¹, o papel da dieta no metabolismo² ou o limiar para o estresse hipóxico³.

Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica⁴. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométrica do consumo de O 2 (V_O2), produção de CO₂ ou ambos. Embora a calorimetria direta tenha sido aplicada a pequenos ectotérmicos, incluindo Drosophila melanogaster⁵, a respirometria é tecnicamente mais simples e mais comumente usada.

Várias formas de respirometria têm sido usadas com sucesso para medir a taxa metabólica em D. melanogaster selvagem e mutante e têm fornecido informações sobre os efeitos metabólicos da temperatura⁶, ambiente social 3, dieta ^{3,7 e distúrbios} do neurodesenvolvimento⁸. Estes dividem-se em duas classes, que variam consideravelmente em custo e complexidade. A manometria é a mais simples e barata ^9,10, na qual as moscas são colocadas em uma câmara selada que contém um absorvente de CO₂ e que é conectada através de um capilar fino a um reservatório de fluido. À medida que o O 2 é consumido e o CO₂ absorvido, a pressão na câmara diminui e o fluido é atraído para o capilar. O volume preenchido por líquido do capilar é, portanto, proporcional ao V_O2. Versões mais elaboradas, que compensam a força exercida pelo fluido no capilar, também têm sido utilizadas em D. melanogaster¹. A manometria tem as vantagens de ser simples e barata, mas, por ser sensível à pressão, requer condições ambientais constantes. Além disso, como o O 2 consumido não é substituído, a pressão parcial de O₂ (P_O2) diminui gradualmente dentro das câmaras.

A respirometria usando análise de gases também é regularmente usada para D. melanogaster. Neste caso, os gases são amostrados em intervalos regulares a partir de câmaras seladas contendo moscas e enviados para um analisador infravermelho ^2,6,11. Esse tipo de aparelho tem as vantagens de estar disponível comercialmente, ser menos sensível às condições ambientais e os gases serem refrescados durante a amostragem para que o P_O2 permaneça estável. No entanto, o equipamento pode ser caro e complexo de operar.

Um microrrespirômetro coulométrico¹² recentemente desenvolvido fornece uma alternativa barata, sensível e estável aos sistemas existentes. Na prática, um organismo é colocado em uma câmara hermética onde consome O 2 e o CO₂ exalado é removido por um material absorvente, resultando em uma diminuição líquida na pressão da câmara. Quando a pressão interna diminui para um limiar pré-estabelecido (ON-threshold), a corrente é passada através de um gerador eletrolítico O₂, retornando a pressão para um segundo limiar (OFF-threshold) parando a eletrólise. A transferência de carga através do gerador de O 2 é diretamente proporcional à quantidade de O 2 necessária para repressurizar a câmara e, portanto, pode ser usada para medir o O₂ consumido pelo organismo⁴. O método é altamente sensível, mede V O2 com precisão, e a reposição regular de O₂ pode manter P_O2 em um nível quase constante por horas ou dias.

O microrrespirômetro coulométrico utilizado neste estudo emprega um sensor eletrônico multimodal (pressão, temperatura e umidade). O sensor é operado por um microcontrolador que detecta pequenas mudanças de pressão e ativa a geração de O₂ quando um limiar de baixa pressão é atingido¹². Este aparelho é montado a partir de peças de prateleira, pode ser usado com uma grande variedade de câmaras e ambientes experimentais, e tem sido empregado com sucesso para examinar os efeitos da massa corporal e temperatura sobre o besouro Tenebrio molitor. No presente estudo, o microrrespirômetro foi adaptado para medir o consumo de O₂ em D. melanogaster, que possui aproximadamente 1% da massa de T. molitor. A sensibilidade do aparelho foi aumentada pela redução do limiar de ativação da geração de O₂ , e a estabilidade ambiental foi melhorada pela realização de experimentos em banho-maria com temperatura controlada e pela manutenção da umidade no interior das câmaras em ou perto de 100%.

A proteína CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte da família das guanilato quinases associadas à membrana (MAGUK), é um arcabouço molecular em diferentes complexos multiproteicos, e mutações no CASK estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento em humanos e em D. melanogaster^13,14. Um mutante viável de D. melanogaster, CASK^Δ18, interrompe a atividade de neurônios dopaminérgicos 15 e reduz os níveis de atividade em mais de 50% em comparação com controles congênicos^14,16. Devido aos níveis reduzidos de atividade dos mutantes CASK e ao papel das catecolaminas na regulação do metabolismo¹⁷, levantamos a hipótese de que sua taxa metabólica padrão e, portanto, o consumo de O₂, seriam drasticamente reduzidos em comparação com os controles.

O consumo de O₂ foi medido em CASK^Δ18 e seus congêneres selvagens, w(ex33). Grupos de moscas foram colocados em câmaras de respirometria, o consumo de O 2 foi medido, o consumo de O₂ foi calculado e expresso em uma base específica de massa e por mosca. O aparelho registrou V_O2 em moscas selvagens que foi consistente com estudos anteriores, e poderia diferenciar entre o consumo por mosca O₂ de moscas selvagens e mutantes CARK.

Protocolo

1. Criação e coleta de moscas

1. Manter as moscas a 25 °C em frascos para injetáveis estreitos contendo alimentos padrão de Drosophila .
   NOTA: O tamanho da amostra para cada genótipo deve incluir pelo menos nove repetições, cada uma consistindo de uma única câmara respiratória contendo 15-25 moscas, configuradas conforme descrito abaixo.
2. Transfira as moscas a cada 2-3 dias.
3. Anestesiar moscas com CO₂, coletar grupos de 15-25 machos de cada genótipo e colocar cada grupo em frascos de alimentos frescos e não fermentados.
   NOTA: Os machos foram usados para reduzir a variabilidade devido ao status reprodutivo. O método aplica-se a ambos os sexos.
4. Permitir que as moscas se recuperem a 25 °C por pelo menos 24 h.
   NOTA: No momento do experimento, as moscas devem ter 1-4 dias de idade. A frequência de coletas descrita no passo 1.3 pode ser definida para reduzir a faixa etária das moscas.

2. Instalação e montagem da câmara do respirômetro

1. Ligue o banho-maria e coloque-o na temperatura desejada para o experimento.
   NOTA: Os experimentos abaixo foram conduzidos a 25 °C utilizando tubos de Schlenk de 50 mL como câmaras. Os componentes devem ser montados conforme mostrado nas Figuras 1A, 1B e 1C.
2. Limpe completamente as juntas de vidro moído das câmaras e plugues do sensor pulverizando etanol 70% em um lenço de laboratório (não diretamente na junta) e limpando a poeira e a graxa velha do plugue do sensor (Figura 1A). Limpe o etanol com um toalhete de laboratório fresco.
3. Coloque 1 cm de rolo de algodão embebido em água purificada no fundo da câmara para estabilizar a umidade.
   1. Adicione água suficiente (~0,5 mL) para formar uma pequena piscina no fundo do rolo de algodão.
4. Limpe qualquer água que tenha derramado na junta da câmara.
5. Transfira as moscas para tubos de polipropileno marcados usando um funil.
   1. Conecte o tubo com um rolo de algodão.
      OBS: Os tubos consistem em um tubo de ensaio de polipropileno de 5 mL, aparado até 5,5 cm de comprimento e perfurado com uma faca quente para permitir a livre troca de ar com a câmara experimental. A anestesia com CO₂ é conhecida por causar anormalidades metabólicas, de modo que as moscas são transferidas sem anestesia, o que requer mais cuidados para evitar a perda das moscas.
6. Adicione um tubo ventilado com moscas em cada câmara do respirômetro (em cima do algodão úmido).
7. Encha cartuchos de cal sodada (4-5 pellets por tubo) e coloque-os na parte superior do tubo contendo moscas dentro da câmara.
   NOTA: Os cartuchos de cal sodada consistem em tubos de centrífuga de 800 μL perfurados 4-5 vezes com uma furadeira elétrica.
8. Encha os geradores O₂ com solução saturada de sulfato de cobre (CuSO₄) abaixo do nível dos orifícios de ventilação
   OBS: Os₂ geradores consistem em tubos centrífugos com tampa de rosca com 4 furos perfurados abaixo das roscas. Os eletrodos de platina (Pt) e cobre () são soldados a um conector de dois pinos, inseridos em furos perfurados na tampa e afixados com epóxi. A eletrólise do CuSO₄ gera o O₂ consumido pelo organismo experimental. CuSO₄ é tóxico para invertebrados, evitar derramamentos ou vazamentos e limpar imediatamente.
9. Conecte o gerador O₂ preenchido ao conector de dois pinos no plugue do sensor.
   NOTA: O cátodo de cobre deve ligar-se com a saída negativa do controlador e o ânodo de platina ao fio positivo. Conexões invertidas causarão a falha do experimento.
10. Coloque dois pequenos pinças de graxa de silicone transparente em lados opostos da junta de vidro fosco do plugue do sensor.
11. Insira o plugue na câmara e gire o plugue (ou câmara) com pressão moderada para espalhar a graxa na junta.
    1. Limpe o excesso de gordura com um lenço de laboratório.
12. Encaixe as fixações de plástico Keck nas juntas para fixar plugues nas câmaras. A câmara montada deve se parecer com a Figura 1C.
13. Repita as etapas acima para o número de câmaras usadas para o experimento do dia.
    NOTA: O número de câmaras que podem ser gravadas é limitado pelo número de câmaras, controladores e entradas USB disponíveis para o computador. Para os experimentos atuais, sete câmaras foram normalmente executadas em paralelo. Moscas experimentais, como mutantes, devem ser combinadas com controles apropriados. Uma câmara montada de forma idêntica, mas sem moscas, deve ser incluída em cada experimento como controle da variação ambiental. Câmaras contendo diferentes tratamentos (mutante, selvagem, no-fly) devem ser rotacionadas entre os experimentos.
14. Coloque as câmaras montadas em um rack no banho-maria com torneiras abertas (Figura 1E).
    OBS: Para evitar variação circadiana, câmaras foram colocadas no banho entre 9:30 e 9:50 horas para todos os experimentos aqui descritos.
15. Deixe as torneiras abertas (Mantenha a alça paralela à torneira).
    OBS: Cuidado para não permitir a entrada de água nas torneiras.
16. Deixe as câmaras se equilibrarem com torneiras abertas por cerca de 30 min.
    NOTA: Enquanto a câmara estiver equilibrada, conecte a eletrônica e configure a aquisição de dados conforme descrito abaixo.

3. Configuração de controladores e computador

1. Certifique-se de que os interruptores que fornecem corrente para os geradores O₂ estão na posição OFF (longe do conector; Figura 1D).
2. Conecte cada caixa do controlador a uma porta USB (barramento serial universal) disponível.
   NOTA: Construção e programação das unidades controladoras descritas em¹².
3. Conecte controladores a câmaras de respirômetro usando cabos de 6 condutores.
4. Verifique se os displays OLED (organic light emitting diode) dos controladores (Figura 1D) estão exibindo parâmetros ambientais.
5. Ligue brevemente os geradores O₂ usando o interruptor do controlador (Figura 1D).
   1. Se o valor da corrente aumentar de zero para entre 35 e 55 mA, o controlador e a câmara estão prontos para experimentos.
6. Determine quais portas COM estão sendo usadas pelos controladores, conforme descrito abaixo.,
   1. Clique no ícone Iniciar no Microsoft Windows.
   2. Clique no ícone Configurações .
   3. Clique em Bluetooth e dispositivos.
   4. Verifique se os controladores e suas portas COM aparecem na lista de dispositivos.
7. Abra o PuTTY na área de trabalho e configure um arquivo de log para cada canal do respirômetro, conforme descrito abaixo.
   NOTA: PuTTY é um shell seguro gratuito e cliente telnet que é usado para transferir dados para o computador através de portas COM.
   1. Selecione a porta COM para um controlador digitando o número da porta na caixa "Linha serial" (Figura 2A).
   2. Clique em Registro.
   3. Selecione Saída imprimível em "Log de sessão" (Figura 2B).
   4. Em Nome do Arquivo de Log, clique em Procurar.
   5. Na pasta da escolha, crie um nome de arquivo contendo informações descritivas (por exemplo, data, espécie, número da porta COM).
   6. Clique em Salvar.
   7. Clique em Abrir. Uma janela será aberta mostrando dados delimitados por vírgulas sendo registrados (Figura 2C).
   8. Repita para todos os outros controladores em uso para o experimento. A entrada para cada porta COM aparecerá como uma janela separada (Figura 2D).

4. Experimentos em execução

1. Uma vez que as câmaras tenham se equilibrado por 30 min, vele-as fechando torneiras.
2. Cubra o banho e as câmaras com uma caixa de espuma de poliestireno para manter um ambiente estável.
3. Deixe equilibrar por mais uma hora.
4. Ligue a corrente para o gerador O₂ de cada câmara usando o interruptor na caixa do controlador.
5. Uma vez que os geradores de O₂ estejam ativados, certifique-se de que a pressão aumente para a pressão OFF pré-definida.
   NOTA: 1017 hPa, que está ligeiramente acima da pressão atmosférica, foi usada como pressão "OFF" nesta série de experimentos. O retorno à pressão ambiente indicará vazamento de gás das câmaras. Além disso, permite que a mesma pressão seja usada em todos os experimentos, independentemente da pressão barométrica ambiente. A pressão "ON" era de 1016 hPa, o que significa que a pressão só precisava cair 1 hPa antes que o gerador de O₂ fosse ativado. Isso proporcionou sensibilidade adequada para medir o consumo de O₂ em Drosophila. Uma vez que uma câmara é pressurizada para a configuração "OFF", a corrente deve cair para zero.
6. Deixe o experimento correr por 3 ou mais h.
   NOTA:_O2 V mais alto em temperaturas elevadas pode permitir tempos de experimento mais curtos. Monitore ocasionalmente para garantir que o equipamento esteja funcionando, mas evite atividades excessivas perto das câmaras que possam afetar a estabilidade da temperatura.

5. Experimento de acabamento

1. Desligue os geradores O₂ em todos os controladores.
   NOTA: Faça primeiro para evitar o funcionamento dos geradores O₂ enquanto as câmaras estão abertas.
2. Abra as torneiras para desselar as câmaras.
3. Deixe as janelas do PuTTY abertas por mais 5-15 minutos para fornecer uma linha de base final.
4. Feche a janela PuTTY para cada controlador, encerrando as gravações.
   OBS: Todos os experimentos foram encerrados entre 16h50 e 17h10.
5. Desconecte os sensores dos cabos.
6. Mova as câmaras para o rack seco.
7. Remova os plugues do sensor, um de cada vez, das câmaras.
8. Desconecte os geradores O₂ e coloque-os no rack tubular.
9. Limpe a graxa do plugue do sensor e mantenha-a no rack.
10. Limpe a graxa das juntas da câmara e remova os tubos com moscas e cal sodada.
11. Anestesiar moscas em cada tubo com CO_2, bater em um barco de peso e pesar em uma microbalança.
    1. Registre o peso e o número de moscas para cada tubo.
12. Descarte moscas ou reserve-as para procedimentos adicionais.
13. Despeje cal sodada dos cartuchos no recipiente de resíduos.
14. Abra o gerador O₂ e descarte a solução CuSO₄ no recipiente de resíduos.
    1. Enxágue eletrodos e tubo com água purificada.
    2. Coloque as cremalheiras tubulares para secagem.

6. Análise dos dados de transferência de encargos

1. Importe Dados como texto delimitado por vírgulas para uma planilha, com cada registro compreendendo uma planilha separada.
2. Registre os dados de corrente e tempo para cada pulso do gerador de O₂ . Começando com o primeiro pulso após a câmara ter sido pressurizada, registre a hora de início e a hora de término (como números de linha) de cada pulso de corrente. Esse é o número da linha quando a corrente vai acima de zero (geralmente para cerca de 45-50 mA) para a última linha que está acima de zero.
3. Crie uma tabela na planilha para registrar os seguintes dados:
   1. A amplitude média da corrente durante o pulso: = MÉDIA([primeira linha de pulso]:[última fileira de pulso]) para cada pulso (da coluna de corrente).
   2. Duração do pulso: ([Última linha de pulso] - [primeira fileira de pulso[-uma linha]])/1000 para cada pulso (a partir do tempo em milissegundos da coluna).
   3. Tempo total do experimento: [tempo no início do último pulso] - [tempo no final do primeiro pulso após câmara pressurizada] (a partir do tempo em minutos da coluna).
4. Em seguida, calcule a transferência de carga (Q) para cada pulso (corrente média X duração)
5. Somar a carga de todos os pulsos para calcular a Carga Total (Q_tot).

7. Análise do consumo de O₂

1. Configure uma nova planilha para todos os dados e insira ou calcule o seguinte para cada câmara:
   1. Q_tot (carga total)
   2. Toupeiras (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL O₂ (= moles × 22413 mL/mol)
   4. Tempo total (a partir da análise dos dados acima)
   5. mL ^min-1 (= ml O₂ ÷ tempo total)
   6. Peso em gramas (moscas anestesiadas e pesadas medidas após o experimento)
   7. mL min-1 ^g-1 (= mL ^min-1 ÷ peso em gramas)
   8. mL/h/g (o acima × 60)
   9. mg/mosca (= peso das moscas ÷ número de moscas)
   10. μL mosca-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ número de moscas).
2. Tabular os dados de cada tratamento (genótipo, por exemplo)
3. Comparar os tratamentos usando ANOVA, teste t ou teste u de Mann-Whitney ¹³.

Resultados

As saídas de pressão e corrente do controlador do respirômetro são mostradas para uma câmara em um experimento na Figura 3A. O primeiro pulso de corrente longa pressurizou a câmara da pressão ambiente (aproximadamente 992 hPa) até o limiar OFF pré-estabelecido de 1017 hPa. À medida que as moscas consumiam O 2 e CO 2 era absorvido, a pressão diminuía lentamente até atingir o limiar de ON de 1016 hPa, que ativava a corrente através do gerador de O₂.

Discussão

O procedimento acima demonstra a medição do consumo de O₂ em D. Melanogaster usando um microrrespirômetro coulométrico eletrônico. Os dados resultantes para o consumo de O₂ em D. melanogaster selvagem estavam dentro dos intervalos descritos na maioria das publicações anteriores usando diversos métodos (Tabela 1), embora um pouco menores do que os relatados por outros ^3,6.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers