Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica

Riepilogo

La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O₂ misurato era all'interno dell'intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O₂ per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.

Abstract

La microrespirometria coulometrica è un metodo semplice ed economico per misurare il consumo di O₂ di piccoli organismi mantenendo un ambiente stabile. Un microrespirometro coulometrico è costituito da una camera ermetica in cui l'O 2 viene consumato e la CO₂ prodotta dall'organismo viene rimossa da un mezzo assorbente. La diminuzione di pressione risultante innesca la produzione elettrolitica di O 2 e la quantità di O₂ prodotta viene misurata registrando la quantità di carica utilizzata per generarlo. Nel presente studio, il metodo è stato adattato a Drosophila melanogaster testato in piccoli gruppi, con la sensibilità dell'apparato e le condizioni ambientali ottimizzate per un'elevata stabilità. La quantità di O₂ consumata dalle mosche selvatiche in questo apparato è coerente con quella misurata da studi precedenti. Il consumo di O₂ specifico per la massa da parte dei mutanti CASK, che sono più piccoli e noti per essere meno attivi, non era diverso dai controlli congeniti. Tuttavia, le piccole dimensioni dei mutanti CASK hanno portato a una significativa riduzione del consumo di O₂ su base per mosca. Pertanto, il microrespirometro è in grado di misurare il consumo di O₂ in D. melanogaster, è in grado di distinguere modeste differenze tra i genotipi e aggiunge uno strumento versatile per misurare i tassi metabolici.

Introduzione

La capacità di misurare il tasso metabolico è fondamentale per una comprensione completa di un organismo nel suo contesto ambientale. Ad esempio, è necessario misurare il tasso metabolico per comprendere il suo ruolo nella durata della vita¹, il ruolo della dieta nel metabolismo² o la soglia per lo stress ipossico³.

Esistono due approcci generali per misurare il tasso metabolico⁴. La calorimetria diretta misura il dispendio energetico direttamente misurando la produzione di calore. La calorimetria indiretta misura la produzione di energia con altri mezzi, spesso attraverso la misurazione respirometrica del consumo di O 2 (V _O2), della produzione di CO₂ o di entrambi. Sebbene la calorimetria diretta sia stata applicata a piccoli ectotermi, tra cui Drosophila melanogaster⁵, la respirometria è tecnicamente più semplice e più comunemente usata.

Diverse forme di respirometria sono state utilizzate con successo per misurare il tasso metabolico in D. melanogaster wildtype e mutante e hanno fornito informazioni sugli effetti metabolici della temperatura⁶, dell'ambiente sociale 3, della dieta ^{3,7 e dei} disturbi dello sviluppo neurologico⁸. Questi si dividono in due classi, che variano considerevolmente in termini di costi e complessità. La manometria è la più semplice e meno costosa ^9,10, in cui le mosche vengono poste in una camera sigillata che contiene un assorbente di CO 2 e che è collegata tramite un sottile capillare a un serbatoio di fluido. Man mano che l'O 2 viene consumato e la CO₂ assorbita, la pressione nella camera diminuisce e il fluido viene aspirato nel capillare. Il volume riempito di liquido del capillare è quindi proporzionale a V_O2. Versioni più elaborate, che compensano la forza esercitata dal fluido nel capillare, sono state utilizzate anche su D. melanogaster¹. La manometria ha il vantaggio di essere semplice ed economica, ma, poiché è sensibile alla pressione, richiede condizioni ambientali costanti. Inoltre, poiché l'O 2 consumato non viene sostituito, la pressione parziale di O₂ (P_O2) diminuisce gradualmente all'interno delle camere.

La respirometria con l'analisi dei gas viene regolarmente utilizzata anche per D. melanogaster. In questo caso, i gas vengono campionati a intervalli regolari da camere sigillate contenenti mosche e inviati a un analizzatore a infrarossi ^2,6,11. Questo tipo di apparecchio ha il vantaggio di essere disponibile in commercio, è meno sensibile alle condizioni ambientali e i gas vengono rinfrescati durante il campionamento in modo che il P_O2 rimanga stabile. Tuttavia, l'apparecchiatura può essere costosa e complessa da utilizzare.

Un microrespirometro coulometrico¹² di recente sviluppo fornisce un'alternativa economica, sensibile e stabile ai sistemi esistenti. In pratica, un organismo viene posto in una camera ermetica dove consuma O 2 e la CO₂ espirata viene rimossa da un materiale assorbente, con conseguente diminuzione netta della pressione della camera. Quando la pressione interna scende ad una soglia preimpostata (soglia ON), la corrente viene fatta passare attraverso un generatore elettrolitico di O₂ , riportando la pressione ad una seconda soglia (soglia OFF) arrestando l'elettrolisi. Il trasferimento di carica attraverso il generatore di O 2 è direttamente proporzionale alla quantità di O 2 necessaria per ripressurizzare la camera e può quindi essere utilizzato per misurare l'O₂ consumato dall'organismo⁴. Il metodo è altamente sensibile, misura con precisione V O2 e la sostituzione regolare di O₂ può mantenere P_O2 a un livello quasi costante per ore o giorni.

Il microrespirometro coulometrico utilizzato in questo studio impiega un sensore elettronico multimodale (pressione, temperatura e umidità). Il sensore è azionato da un microcontrollore che rileva piccole variazioni di pressione e attiva la generazione di O₂ quando viene raggiunta una soglia di bassa pressione¹². Questo apparecchio è assemblato da parti standard, può essere utilizzato con un'ampia varietà di camere e ambienti sperimentali ed è stato impiegato con successo per esaminare gli effetti della massa corporea e della temperatura sul coleottero Tenebrio molitor. Nel presente studio, il microrespirometro è stato adattato per misurare il consumo di O₂ in D. melanogaster, che ha circa l'1% della massa di T. molitor. La sensibilità dell'apparecchio è stata aumentata riducendo la soglia per l'attivazione della generazione di O₂ e la stabilità ambientale è stata migliorata conducendo esperimenti in un bagno d'acqua a temperatura controllata e mantenendo l'umidità all'interno delle camere al 100% o quasi.

La proteina CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte della famiglia delle guanilate chinasi associate alla membrana (MAGUK), è un'impalcatura molecolare in diversi complessi multi-proteici e le mutazioni in CASK sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico nell'uomo e in D. melanogaster^13,14. Un mutante vitale di D. melanogaster, CASK^Δ18, interrompe l'attività dei neuroni dopaminergici 15 e riduce i livelli di attività di oltre il 50% rispetto ai controlli congenici^14,16. A causa dei ridotti livelli di attività dei mutanti CASK e del ruolo delle catecolamine nella regolazione del metabolismo¹⁷ abbiamo ipotizzato che il loro tasso metabolico standard, e quindi il consumo di O₂, sarebbe drasticamente ridotto rispetto ai controlli.

Il consumo di O₂ è stato misurato in CASK^Δ18 e nei loro congeneri wildtype, w(ex33). Gruppi di mosche sono stati collocati in camere di respirometria, è stato misurato il consumo di O 2, il consumo di O₂ è stato calcolato ed espresso sia su base massa-specifica che per mosca. L'apparato ha registrato V_O2 nei moscerini wildtype che era coerente con gli studi precedenti e ha potuto differenziare tra il consumo di O₂ per mosca dei moscerini wildtype e dei moscerini mutanti CASK.

Protocollo

1. Allevamento e raccolta delle mosche

1. Mantenere le mosche a 25 °C in flaconcini stretti contenenti cibo standard per Drosophila .
   NOTA: La dimensione del campione per ciascun genotipo deve comprendere almeno nove repliche, ciascuna costituita da una singola camera respirometrica contenente 15-25 moscerini, configurati come descritto di seguito.
2. Trasferisci le mosche ogni 2-3 giorni.
3. Anestetizzare le mosche con CO₂, raccogliere gruppi di 15-25 maschi di ogni genotipo e mettere ogni gruppo in fiale di cibo fresco e non lievitato.
   NOTA: I maschi sono stati utilizzati per ridurre la variabilità dovuta allo stato riproduttivo. Il metodo si applica ad entrambi i sessi.
4. Lasciare che le mosche si riprendano a 25 °C per almeno 24 ore.
   NOTA: Al momento dell'esperimento, le mosche dovrebbero avere 1-4 giorni. La frequenza dei prelievi descritta al punto 1.3 può essere impostata per restringere la fascia di età delle mosche.

2. Installazione e montaggio della camera del respirometro

1. Accendi il bagnomaria e impostalo alla temperatura desiderata per l'esperimento.
   NOTA: Gli esperimenti seguenti sono stati condotti a 25 °C utilizzando provette Schlenk da 50 mL come camere. I componenti devono essere assemblati come mostrato nelle Figure 1A, 1B e 1C.
2. Pulire accuratamente i giunti in vetro smerigliato delle camere e dei tappi dei sensori spruzzando etanolo al 70% su un panno da laboratorio (non direttamente sul giunto) e rimuovendo polvere e grasso vecchio dal connettore del sensore (Figura 1A). Pulisci l'etanolo con una nuova salvietta da laboratorio.
3. Posizionare un pezzo di cotone di 1 cm imbevuto di acqua purificata sul fondo della camera per stabilizzare l'umidità.
   1. Aggiungere acqua a sufficienza (~0,5 ml) per formare una piccola pozza sul fondo del rotolo di cotone.
4. Asciugare l'acqua che si è riversata sul giunto della camera.
5. Trasferisci le mosche in tubi di polipropilene etichettati utilizzando un imbuto.
   1. Tappate il tubo con un rotolo di cotone.
      NOTA: Le provette sono costituite da una provetta in polipropilene da 5 mL, tagliata a 5,5 cm di lunghezza e perforata con un coltello caldo per consentire il libero scambio d'aria con la camera sperimentale. È noto che l'anestesia con CO₂ causa anomalie metaboliche, quindi le mosche vengono trasferite senza anestesia, il che richiede più attenzione per evitare di perdere le mosche.
6. Aggiungere un tubo ventilato con mosche in ogni camera del respirometro (sopra il cotone bagnato).
7. Riempire le cartucce di calce sodata (4-5 pellet per tubo) e posizionarle sulla parte superiore del tubo contenente le mosche all'interno della camera.
   NOTA: Le cartucce di calce sodata sono costituite da provette da centrifuga da 800 μL perforate 4-5 volte con un trapano elettrico.
8. Riempire i generatori di O₂ con una soluzione di solfato di rame saturo (CuSO₄) al di sotto del livello dei fori di sfiato
   NOTA: I generatori O₂ sono costituiti da provette da centrifuga con tappo a vite con 4 fori praticati sotto le filettature. Gli elettrodi in platino (Pt) e rame (Cu) sono saldati a un connettore a due pin, inseriti nei fori praticati nel cappuccio e fissati con resina epossidica. L'elettrolisi di CuSO₄ genera l'O₂ consumato dall'organismo sperimentale. CuSO₄ è tossico per gli invertebrati, evitare fuoriuscite o perdite e pulire immediatamente.
9. Collegare il generatore di O₂ pieno al connettore a due pin sulla spina del sensore.
   NOTA: Il catodo di rame deve essere collegato con l'uscita negativa del controller e l'anodo di platino al filo positivo. Le connessioni invertite causeranno il fallimento dell'esperimento.
10. Posizionare due piccoli tocchi di grasso siliconico trasparente sui lati opposti del giunto in vetro smerigliato della spina del sensore.
11. Inserire il tappo nella camera e ruotare il tappo (o la camera) con una pressione moderata per distribuire il grasso nel giunto.
    1. Rimuovere il grasso in eccesso con una salvietta da laboratorio.
12. Agganciare i morsetti Keck in plastica ai giunti per fissare i tappi nelle camere. La camera assemblata dovrebbe essere simile alla Figura 1C.
13. Ripetere i passaggi precedenti per il numero di camere utilizzate per l'esperimento del giorno.
    NOTA: Il numero di camere che è possibile registrare è limitato dal numero di camere, controller e ingressi USB disponibili per il computer. Per i presenti esperimenti, sette camere sono state normalmente gestite in parallelo. Le mosche sperimentali, come i mutanti, devono essere abbinate a controlli appropriati. Una camera allestita in modo identico ma senza mosche dovrebbe essere inclusa in ogni esperimento come controllo per le variazioni ambientali. Le camere contenenti diversi trattamenti (mutanti, wildtype, no-fly) dovrebbero essere ruotate tra un esperimento e l'altro.
14. Posizionare le camere assemblate in un rack nel bagno d'acqua con i rubinetti aperti (Figura 1E).
    NOTA: Per evitare variazioni circadiane, le camere sono state posizionate nel bagno tra le 9:30 e le 9:50 per tutti gli esperimenti qui descritti.
15. Lasciare aperti i rubinetti (tenere la maniglia parallela al rubinetto).
    NOTA: Fare attenzione a non far entrare l'acqua nei rubinetti.
16. Lasciare che le camere si equilibrino con i rubinetti aperti per circa 30 min.
    NOTA: Mentre la camera è in equilibrio, collegare l'elettronica e impostare l'acquisizione dati come descritto di seguito.

3. Configurazione dei controller e del computer

1. Assicurarsi che gli interruttori che forniscono corrente ai generatori O₂ siano in posizione OFF (lontano dal connettore; Figura 1D).
2. Collegare ciascuna scatola del controller a una porta USB (Universal Serial Bus) disponibile.
   NOTA: Costruzione e programmazione delle unità di controllo descritte altrove¹².
3. Collegare i controller alle camere del respirometro utilizzando cavi a 6 conduttori.
4. Verificare che i display OLED (Organic Light Emitting Diode) dei controller (Figura 1D) visualizzino i parametri ambientali.
5. Accendere brevemente i generatori O₂ utilizzando l'interruttore sul controller (Figura 1D).
   1. Se il valore di corrente aumenta da zero a un valore compreso tra 35 e 55 mA, il controller e la camera sono pronti per gli esperimenti.
6. Determinare quali porte COM vengono utilizzate dai controller, come descritto di seguito.,
   1. Fare clic sull'icona Start in Microsoft Windows.
   2. Fare clic sull'icona Impostazioni .
   3. Fare clic su Bluetooth e dispositivi.
   4. Assicurarsi che i controller e le relative porte COM vengano visualizzati nell'elenco dei dispositivi.
7. Apri PuTTY sul desktop e imposta un file di registro per ciascun canale del respirometro come descritto di seguito.
   NOTA: PuTTY è una shell sicura gratuita e un client telnet che viene utilizzato per trasferire i dati al computer tramite porte COM.
   1. Selezionare la porta COM per un controller digitando il numero della porta nella casella "Linea seriale" (Figura 2A).
   2. Fare clic su Registrazione.
   3. Selezionare Output stampabile in "Registrazione sessione" (Registrazione sessione) (Figura 2B).
   4. In Nome file di registro, fare clic su Sfoglia.
   5. Nella cartella scelta, creare un nome file contenente informazioni descrittive (ad esempio, data, specie, numero di porta COM).
   6. Fai clic su Salva.
   7. Fare clic su Apri. Si aprirà una finestra che mostra i dati delimitati da virgole in fase di registrazione (Figura 2C).
   8. Ripetere l'operazione per tutti gli altri controller in uso per l'esperimento. L'ingresso a ciascuna porta COM verrà visualizzato come una finestra separata (Figura 2D).

4. Esecuzione di esperimenti

1. Una volta che le camere si sono equilibrate per 30 minuti, sigillarle chiudendo i rubinetti.
2. Coprire il bagno e le camere con una scatola di polistirolo espanso per mantenere un ambiente stabile.
3. Lasciare agire per un'altra ora.
4. Attivare la corrente al generatore di O₂ di ciascuna camera utilizzando l'interruttore sulla scatola del controller.
5. Una volta attivati i generatori di O₂ , assicurarsi che la pressione aumenti fino alla pressione OFF preimpostata.
   NOTA: 1017 hPa, che è leggermente al di sopra della pressione atmosferica, è stata utilizzata come pressione "OFF" in questa serie di esperimenti. Il ritorno alla pressione ambiente indicherà una perdita di gas dalle camere. Inoltre, consente di utilizzare la stessa pressione in tutti gli esperimenti, indipendentemente dalla pressione barometrica ambientale. La pressione "ON" era di 1016 hPa, il che significa che la pressione doveva scendere solo di 1 hPa prima che il generatore di O₂ fosse attivato. Ciò ha fornito un'adeguata sensibilità per misurare il consumo di O₂ in Drosophila. Una volta che una camera è pressurizzata all'impostazione "OFF", la corrente dovrebbe scendere a zero.
6. Lascia che l'esperimento venga eseguito per 3 o più ore.
   NOTA: Un V_O2 più elevato a temperature elevate può consentire tempi di esperimento più brevi. Monitorare di tanto in tanto per assicurarsi che l'apparecchiatura funzioni, ma evitare attività eccessive vicino alle camere che potrebbero influire sulla stabilità della temperatura.

5. Esperimento di finitura

1. Spegnere i generatori O₂ su tutti i controller.
   NOTA: Evitare innanzitutto di far funzionare i generatori di O₂ mentre le camere sono aperte.
2. Aprire i rubinetti per aprire le camere.
3. Lasciare aperte le finestre PuTTY per altri 5-15 minuti per fornire una linea di base finale.
4. Chiudere la finestra PuTTY per ciascun controller, terminando le registrazioni.
   NOTA: Tutti gli esperimenti si sono conclusi tra le 16:50 e le 17:10.
5. Scollegare i sensori dai cavi.
6. Spostare le camere sulla griglia a secco.
7. Rimuovere i tappi dei sensori uno alla volta dalle camere.
8. Scollegare i generatori di O₂ e posizionarli nel rack per provette.
9. Rimuovere il grasso dalla spina del sensore e conservarlo nel rack.
10. Pulire il grasso dai giunti della camera e rimuovere i tubi con mosche e calce sodata.
11. L'anestetizzatore vola in ogni provetta con CO_{2 ,} tocca una barca di pesi e pesa su una microbilancia.
    1. Registra il peso e il numero di mosche per ogni tubo.
12. Scartare le mosche o metterle da parte per ulteriori procedure.
13. Scaricare la calce sodata dalle cartucce nel contenitore dei rifiuti.
14. Aprire il generatore di O₂ e gettare la soluzione CuSO₄ nel contenitore dei rifiuti.
    1. Sciacquare gli elettrodi e il tubo con acqua purificata.
    2. Posizionare le rastrelliere per provette per l'asciugatura.

6. Analisi dei dati di trasferimento degli addebiti

1. Importare i dati come testo delimitato da virgole in un foglio di calcolo, in cui ogni record comprende un foglio di lavoro separato.
2. Registrare i dati attuali e temporali per ogni impulso del generatore O₂ . A partire dal primo impulso dopo che la camera è stata pressurizzata, registrare l'ora di inizio e l'ora di fine (come numeri di riga) di ogni impulso corrente. Questo è il numero di riga quando la corrente supera lo zero (di solito a circa 45-50 mA) fino all'ultima riga che è sopra lo zero.
3. Crea una tabella sul foglio di lavoro per registrare i seguenti dati:
   1. L'ampiezza media della corrente durante l'impulso: = AVERAGE([prima riga di impulso]:[ultima riga di impulso]) per ogni impulso (dalla colonna corrente).
   2. Durata dell'impulso: ([Ultima riga di impulso] - [Prima riga di impulso[-una riga]])/1000 per ogni impulso (dalla colonna del tempo in millisecondi).
   3. Tempo totale dell'esperimento: [tempo all'inizio dell'ultimo impulso] - [tempo alla fine del primo impulso dopo la pressurizzazione della camera] (dalla colonna del tempo in minuti).
4. Quindi calcolare il trasferimento di carica (Q) per ogni impulso (durata media della corrente X)
5. Somma la carica di tutti gli impulsi per calcolare la carica totale (Q_tot).

7. Analisi del consumo di O₂

1. Impostare un nuovo foglio di calcolo per tutti i dati e immettere o calcolare quanto segue per ogni camera:
   1. Q_tot (carica totale)
   2. Talpe (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. mL O₂ (= moli × 22413 mL/mol)
   4. Tempo totale (dall'analisi dei dati di cui sopra)
   5. mL ^min-1 (= ml O₂ ÷ tempo totale)
   6. Peso in grammi (mosche anestetizzate e pesate misurate dopo l'esperimento)
   7. mL min-1 g-1 (= mL ^min-1 ÷ peso in grammi)
   8. mL/h/g (il precedente × 60)
   9. mg/mosca (= peso delle mosche ÷ numero di mosche)
   10. μL mosca-1 h-1 (= (mL ^min-1 × 3600) ÷ numero di mosche).
2. Tabulare i dati per ciascun trattamento (genotipo, ad es.)
3. Confronta i trattamenti utilizzando ANOVA, t-test o Mann-Whitney u-test ¹³.

Risultati

Le uscite di pressione e corrente del controller del respirometro sono mostrate per una camera in un esperimento nella Figura 3A. Il primo, lungo impulso di corrente ha pressurizzato la camera dalla pressione ambiente (circa 992 hPa) alla soglia OFF preimpostata di 1017 hPa. Man mano che le mosche consumavano O 2 e la CO 2 veniva assorbita, la pressione diminuiva lentamente fino a raggiungere la soglia ON di 1016 hPa, che attivava la corrente attraverso il generatore di O₂

Discussione

La procedura di cui sopra mostra la misurazione del consumo di O₂ in D. melanogaster utilizzando un microrespirometro coulometrico elettronico. I dati risultanti per il consumo di O₂ in D. melanogaster wild-type erano all'interno degli intervalli descritti nella maggior parte delle pubblicazioni precedenti utilizzando metodi diversi (Tabella 1), anche se leggermente inferiori a quelli riportati da altri ^3,6.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers