使用库仑显微呼吸法测量黑腹果蝇的 O2 消耗量

摘要

库仑呼吸法是测量小生物代谢率的理想方法。在本研究中，当适用于黑腹果蝇时，测得的 O₂ 消耗量在先前研究报告的野生型黑腹果蝇的范围内。体型较小且活性较低的 CASK 突变体的每只苍蝇消耗 O₂ 显著低于野生型。

摘要

库仑显微呼吸法是一种简单、廉价的方法，用于测量小生物体的 O₂ 消耗量，同时保持稳定的环境。库仑显微呼吸计由一个密闭室组成，其中消耗 O 2，并通过吸收介质去除生物体产生的 CO₂。 由此产生的压力降低会触发电解 O 2 的产生，并且通过记录用于产生 O₂ 的电荷量来测量产生的 O₂ 的量。在本研究中，该方法已适用于在小组中测试的黑腹果蝇，该仪器的灵敏度和环境条件经过优化以实现高稳定性。该装置中野生型苍蝇消耗的O₂量与先前研究测量的量一致。CASK突变体的质量特异性O₂消耗量较小且已知活性较低，与同源对照没有区别。然而，小尺寸的CASK突变体导致每只苍蝇的O₂消耗量显着减少。因此，显微呼吸计能够测量黑腹果蝇的 O₂ 消耗量，可以区分基因型之间的适度差异，并增加了测量代谢率的多功能工具。

引言

测量代谢率的能力对于全面了解生物体的环境背景至关重要。例如，有必要测量代谢率，以了解其在寿命^{中的作用 1}、饮食在新陈代谢中的作用² 或缺氧应激的阈值³。

测量代谢率有两种一般方法⁴.直接量热法通过测量产热法直接测量能量消耗。间接量热法通过其他方式测量能量产生，通常通过呼吸测量 O 2 消耗量 （V_O2）、CO₂ 产生量或两者兼而有之。虽然直接量热法已应用于小型变温动物，包括黑腹果蝇 ⁵，但呼吸测定法在技术上更简单且更常用。

几种形式的呼吸测量法已成功用于测量野生型和突变型黑腹果蝇的代谢率，并深入了解温度⁶、社会环境 3、饮食 ^{3、7 和神经}发育障碍的代谢影响⁸。它们分为两类，它们在成本和复杂性方面差异很大。测压法是最简单和最便宜的 ^9,10，其中将苍蝇放入一个密封室中，该室含有 CO₂ 吸收剂，并通过细毛细管连接到储液器。随着 O 2 的消耗和 CO₂ 的吸收，腔室中的压力降低，流体被吸入毛细管。因此，毛细管的充满液体的体积与 V_O2 成正比。更精细的版本，补偿了毛细血管中液体施加的力，也被用于黑腹果蝇¹。测压法的优点是简单且价格低廉，但由于它对压力敏感，因此需要恒定的环境条件。此外，由于消耗的 O 2 没有被替换，因此 O₂ （P_O2） 的分压在腔室内逐渐降低。

使用气体分析的呼吸测定法也经常用于黑腹果蝇。在这种情况下，定期从含有苍蝇的密封室中对气体进行采样，并发送到红外分析仪^2,6,11。这种类型的设备具有以下优点:它可以在市场上买到，对环境条件不太敏感，并且在采样过程中刷新气体，使P_O2保持稳定。然而，这些设备可能既昂贵又操作复杂。

最近开发的库仑显微呼吸计¹² 为现有系统提供了一种廉价、灵敏且稳定的替代方案。在实践中，将生物体放入密闭室中，在那里它消耗 O 2，呼出的 CO₂ 被吸收材料去除，导致室压净降低。当内部压力降低到预设阈值（ON阈值）时，电流通过电解O₂发生器，将压力返回到第二个阈值（OFF阈值），从而停止电解。O 2 发生器上的电荷转移与重新加压腔室所需的 O 2 量成正比，因此可用于测量生物体^消耗的 O ₂ 4。该方法灵敏度高，可精确测量 V O2，定期更换 O₂ 可将 P_O2 维持在几乎恒定的水平数小时或数天。

本研究中使用的库仑显微呼吸计采用多模态（压力、温度和湿度）电子传感器。该传感器由微控制器操作，该微控制器可检测压力的微小变化，并在达到低压阈值¹² 时激活 O₂ 生成。该装置由现成的零件组装而成，可用于各种腔室和实验环境，并已成功用于检查体重和温度对甲虫Tenebrio molitor的影响。在本研究中，微量呼吸计已用于测量黑腹果蝇的 O₂ 消耗量，其质量约为 T. molitor 的 1%。通过降低激活 O₂ 生成的阈值来提高设备的灵敏度，并通过在温控水浴中进行实验并将腔室内的湿度保持在 100% 或接近 100% 来增强环境稳定性。

CASK（钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶）蛋白是膜相关鸟苷酸激酶 （MAGUK） 家族的一部分，是不同多蛋白复合物中的分子支架，CASK 中的突变与人类和黑腹果蝇的神经发育障碍有关 ^13,14。与同源对照组相比，活的黑腹果蝇突变体 CASK^Δ18 会破坏多巴胺能神经元的活性 15，并将活性水平降低 50% 以上^14,16。由于 CASK 突变体的活性水平降低以及儿茶酚胺在调节代谢中的作用¹⁷，我们假设与对照组相比，它们的标准代谢率以及 O₂ 消耗量将显着降低。

在 CASK^Δ18 及其野生型同源物 w（ex33） 中测量 O₂ 消耗量。将成组的苍蝇放入呼吸测量室，测量 O 2 消耗量，计算 O₂ 消耗量，并在质量特异性和每只苍蝇的基础上表示。该装置记录了野生型果蝇中的V_O2，这与以前的研究一致，并且可以区分野生型和CASK突变果蝇的每只苍蝇O₂消耗量。

研究方案

1. 苍蝇饲养和收集

1. 将苍蝇保持在25°C的狭窄小瓶中，装有标准 果蝇 食物。
   注:每种基因型的样本量应至少包括九个重复，每个重复由一个包含15-25只苍蝇的呼吸计室组成，如下所述。
2. 每 2-3 天转移一次苍蝇。
3. 用 CO₂ 麻醉苍蝇，收集每种基因型的 15-25 只雄性，并将每组放入新鲜的、未发酵的食品瓶中。
   注:男性用于减少由于生殖状况引起的变异性。该方法适用于男女。
4. 让苍蝇在25°C下恢复至少24小时。
   注意:在实验时，苍蝇应该是1-4天大。可以设置步骤1.3中描述的收集频率以缩小苍蝇的年龄范围。

2. 呼吸计室的设置和组装

1. 打开水浴并将其设置为实验所需的温度。
   注:以下实验在25°C下使用50mL舒伦克管作为腔室进行。组件的组装如图 1A、1B 和 1C 所示。
2. 通过将70%乙醇喷洒在实验室擦拭布上（而不是直接喷洒在接头上）并擦去传感器插头上的灰尘和旧油脂，彻底清洁腔室和传感器塞的毛玻璃接头（图1A）。用新鲜的实验室湿巾擦去乙醇。
3. 将浸泡在纯净水中的 1 厘米棉卷放入腔室底部以稳定湿度。
   1. 加入足够的水（~0.5 mL），在棉卷底部形成一个小水池。
4. 擦去溅到腔室接缝上的任何水。
5. 使用漏斗将苍蝇转移到标记的聚丙烯管中。
   1. 用棉卷塞住管子。
      注:试管由5mL聚丙烯试管组成，长度修剪至5.5cm，并用热刀穿孔，以便与实验室自由交换空气。众所周知，CO₂ 麻醉会导致代谢异常，因此苍蝇在没有麻醉的情况下转移，这需要更加小心以避免失去苍蝇。
6. 将一根带有苍蝇的通风管添加到每个呼吸计室（在湿棉布上）。
7. 填充碱石灰盒（每管 4-5 个颗粒）并将它们放在腔室内装有苍蝇的管子顶部。
   注:碱石灰滤芯由 800 μL 离心管组成，用电钻打孔 4-5 次。
8. 在排气孔水平以下用饱和硫酸铜 （CuSO₄） 溶液填充 O₂ 发生器
   注意: O₂ 发生器由螺旋盖离心管组成，螺纹下方钻有 4 个孔。铂 （Pt） 和铜 （Cu） 电极焊接到两针连接器上，插入盖子上钻孔的孔中，并用环氧树脂固定。CuSO₄ 的电解产生实验生物体消耗的 O₂ 。CuSO₄ 对无脊椎动物有毒，避免溢出或泄漏并立即清理。
9. 将填充的 O₂ 发生器连接到传感器插头上的两针连接器。
   注意: 铜阴极必须与控制器的负输出连接，铂阳极必须连接到正极。接反会导致实验失败。
10. 将两小块透明硅脂放在传感器插头毛玻璃接头的相对两侧。
11. 将塞子插入腔室并以适度的压力旋转塞子（或腔室），以将润滑脂散布在接头中。
    1. 用实验室湿巾擦去多余的油脂。
12. 卡扣塑料 Keck 夹在接头上，以将塞子固定在腔室中。组装好的腔室应如图 1C 所示。
13. 对当天实验使用的腔室数量重复上述步骤。
    注意: 可记录的腔室数量受可用腔室、控制器和计算机 USB 输入的数量限制。在本实验中，通常有七个腔室并行运行。实验性苍蝇（如突变体）应与适当的对照相匹配。每个实验中应包括一个设置相同但没有苍蝇的腔室，作为环境变化的对照。含有不同处理（突变型，野生型，禁蝇）的腔室应在实验之间轮换。
14. 将组装好的腔室放入水浴中的架子中，旋塞阀打开（图1E）。
    注意:为避免昼夜节律变化，在上午9:30至9:50之间将腔室放入浴中，用于此处描述的所有实验。
15. 保持旋塞阀打开（保持手柄与旋塞阀平行）。
    注意: 小心不要让水进入旋塞阀。
16. 让腔室平衡，旋塞阀打开约 30 分钟。
    注意: 当腔室平衡时，连接电子设备并设置数据采集，如下所述。

3. 设置控制器和计算机

1. 确保向 O₂ 发电机供电的开关处于关闭位置（远离连接器; 图1D）。
2. 将每个控制器盒插入可用的通用串行总线 （USB） 端口。
   注:控制器单元的构造和编程在别处描述¹².
3. 使用 6 芯电缆将控制器连接到呼吸计室。
4. 检查控制器的有机发光二极管（OLED）显示器（图1D）是否显示环境参数。
5. 使用控制器上的开关短暂打开 O₂ 发生器（图 1D）。
   1. 如果电流值从零增加到 35 到 55 mA 之间，则控制器和腔室已准备好进行实验。
6. 确定控制器正在使用的 COM 端口，如下所述。
   1. 单击 Microsoft Windows 中的 "开始 "图标。
   2. 单击 设置 图标。
   3. 单击 蓝牙 和 设备。
   4. 确保控制器及其 COM 端口显示在设备列表中。
7. 在桌面上打开 PuTTY，并为呼吸计的每个通道设置日志文件，如下所述。
   注意:PuTTY 是一个免费的安全 shell 和 telnet 客户端，用于通过 COM 端口将数据传输到计算机。
   1. 通过在"串行线路"框中键入端口号来选择控制器的COM端口（图2A）。
   2. 单击 "Logging"（日志记录）。
   3. 在"会话日志记录"中选择可打印输出（图2B）。
   4. 在"日志文件名"下，单击 "浏览"。
   5. 在所选文件夹中，创建一个包含描述性信息（例如，日期、物种、COM 端口号）的文件名。
   6. 点击 保存。
   7. 单击 "打开"。将打开一个窗口，显示正在记录的逗号分隔数据（图 2C）。
   8. 对用于实验的所有其他控制器重复上述步骤。每个COM端口的输入将显示为一个单独的窗口（图2D）。

4. 运行实验

1. 一旦腔室平衡30分钟，通过关闭旋塞阀来密封它们。
2. 用聚苯乙烯泡沫盒盖住浴缸和房间，以保持稳定的环境。
3. 再平衡一个小时。
4. 使用控制器盒上的开关打开每个腔室的 O₂ 发生器的电流。
5. 一旦 O₂ 发生器被激活，确保压力增加到预设的 OFF 压力。
   注:1017 hPa，略高于大气压，在本系列实验中用作"关闭"压力。恢复到环境压力将表明气体从腔室泄漏。此外，无论环境气压如何，它都允许在实验中使用相同的压力。"ON"压力为 1016 hPa，这意味着在 O₂ 发生器启动之前，压力只需要下降 1 hPa。这为测量果蝇中的 O₂ 消耗量提供了足够的灵敏度。一旦腔室被加压到"OFF"设置，电流应降至零。
6. 让实验运行3小时或更长时间。
   注意:在高温下较高的V_{O 2} 可以缩短实验时间。偶尔进行监测以确保设备正常运行，但避免在腔室附近进行可能影响温度稳定性的过度活动。

5.精加工实验

1. 关闭所有控制器上的 O₂ 发电机。
   注意: 首先要避免在腔室打开时运行 O₂ 发生器。
2. 打开旋塞阀以打开腔室。
3. 让 PuTTY 窗口再打开 5-15 分钟以提供最终基线。
4. 关闭每个控制器的 PuTTY 窗口，结束录制。
   注意:所有实验在下午 4:50 至 5:10 之间结束。
5. 断开传感器与电缆的连接。
6. 将腔室移至干架。
7. 从腔室中一次拔下一个传感器插头。
8. 断开 O₂ 发生器并将它们放入管架中。
9. 擦去传感器插头上的油脂并将其放在机架中。
10. 清除腔室接头上的油脂，并用苍蝇和碱石灰去除管子。
11. 用 CO 2 麻醉每根管中的苍蝇_， 轻敲重量船并在微量天平上称重。
    1. 记录每个试管的重量和苍蝇数量。
12. 丢弃苍蝇或将它们放在一边进行其他程序。
13. 将筒中的碱石灰倒入废物容器中。
14. 打开 O₂ 发生器并将 CuSO₄ 溶液丢弃到废物容器中。
    1. 用纯净水冲洗电极和管子。
    2. 放置管架进行干燥。

6. 电荷转移数据分析

1. 将数据作为逗号分隔的文本导入电子表格，每条记录由一个单独的工作表组成。
2. 记录 O₂ 发生器每个脉冲的电流和时间数据。从腔室加压后的第一个脉冲开始，记录每个当前脉冲的开始时间和结束时间（作为行号）。这是当电流高于零（通常约为 45-50 mA）到高于零的最后一行时的行号。
3. 在工作表上制作一个表格以记录以下数据:
   1. 脉冲期间的平均电流幅度:= AVERAGE（[第一行脉冲]:[最后一行脉冲]）对于每个脉冲（来自电流列）。
   2. 脉冲持续时间:（[最后一行脉冲] - [第一行脉冲[-一行]]）/每个脉冲为 1000（从以毫秒为单位的时间列）。
   3. 总实验时间:[最后一个脉冲开始的时间] - [腔室加压后第一个脉冲结束时的时间]（从分钟列开始）。
4. 然后计算每个脉冲的电荷转移 （Q）（平均电流 X 持续时间）
5. 将所有脉冲的电荷相加以计算总电荷 （Q_tot）。

7. O₂ 消耗量分析

1. 为所有数据设置一个新的电子表格，并为每个腔室输入或计算以下内容:
   1. Q_tot （总费用）
   2. 摩尔 （= Q ÷ 96485 × 4）
   3. mL O₂ （= 摩尔× 22413 mL/mol）
   4. 总时间（来自上面的数据分析）
   5. mL ^min-1 （= ml O₂ ÷总时间）
   6. 重量（克）（实验后麻醉并称重测量的苍蝇）
   7. mL min-1 g-1 （= mL ^min-1 ÷重量（克）
   8. mL/h/g（以上×60）
   9. mg/苍蝇（= 苍蝇重量÷苍蝇数量）
   10. μL 苍蝇-1 h-1（=（mL ^min-1 × 3600） ÷苍蝇数量）。
2. 将每种处理的数据制成表格（例如基因型）
3. 使用方差分析、t 检验或 Mann-Whitney u 检验 ¹³ 比较治疗。

结果

呼吸计控制器的压力和电流输出显示在图3A中一个实验中的一个腔室。第一个长电流脉冲将腔室从环境压力（约 992 hPa）加压到预设的 OFF 阈值 1017 hPa。当苍蝇消耗 O 2 和 CO 2 被吸收时，压力缓慢下降，直到达到 1016 hPa 的 ON 阈值，从而激活通过 O₂ 发生器的电流。在所示示例中，每个脉冲的平均幅度为 50.1 mA，持续时间为 16.1 s，每个脉冲产生约 0.81 库?...

讨论

上述程序演示了使用电子库仑显微呼吸计测量 D. melanogaster 中 O₂ 消耗量。野生型黑腹果蝇中 O₂ 消耗量的最终数据在大多数先前出版物中使用不同方法描述的范围内（表 1），尽管略低于其他人报告的数据 ^3,6。

关键步骤满足了该方法的两个绝对要求:气密密封和环境稳定性。保持气密环境很?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers