الفيزيولوجيا الكهربية للنشاط القشري الصفحي في المرموسيت المشترك

Summary

تتيح محركات الأقراص الصغيرة المصممة خصيصا استهداف المليمتر الفرعي لمواقع التسجيل القشرية باستخدام صفائف السيليكون الخطية.

Abstract

يوفر المرموسيت نموذجا مثاليا لفحص الدوائر القشرية الصفحية بسبب سطحه القشري الأملس ، مما يسهل التسجيلات باستخدام المصفوفات الخطية. نمت شعبية المارموسيت مؤخرا بسبب تنظيمه الوظيفي العصبي المماثل للقرود الأخرى ومزاياه التقنية للتسجيل والتصوير. ومع ذلك ، فإن الفيزيولوجيا العصبية في هذا النموذج تطرح بعض التحديات الفريدة بسبب صغر الحجم ونقص الدوران كمعالم تشريحية. باستخدام محركات الأقراص الصغيرة المصممة خصيصا ، يمكن للباحثين التعامل مع وضع الصفيف الخطي بدقة أقل من المليمتر والتسجيل بشكل موثوق في نفس الموقع المستهدف شبكيا عبر أيام التسجيل. يصف هذا البروتوكول البناء خطوة بخطوة لنظام تحديد المواقع بمحرك الأقراص الصغير وتقنية التسجيل الفسيولوجي العصبي مع صفائف الأقطاب الكهربائية الخطية السيليكونية. من خلال التحكم الدقيق في وضع القطب عبر جلسات التسجيل ، يمكن للباحثين اجتياز القشرة بسهولة لتحديد مجالات الاهتمام بناء على تنظيمهم الشبكي وخصائص ضبط الخلايا العصبية المسجلة. علاوة على ذلك ، باستخدام نظام قطب الصفيف الصفحي هذا ، من الممكن تطبيق تحليل كثافة المصدر الحالي (CSD) لتحديد عمق تسجيل الخلايا العصبية الفردية. يوضح هذا البروتوكول أيضا أمثلة على التسجيلات الصفائحية ، بما في ذلك أشكال موجات السنبلة المعزولة في Kilosort ، والتي تمتد عبر قنوات متعددة على المصفوفات.

Introduction

نمت شعبية المرموسيت الشائع (Callithrix jacchus) بسرعة كنموذج لدراسة وظائف المخ في السنوات الأخيرة. ترجع هذه الشعبية المتزايدة إلى إمكانية الوصول إلى القشرة الملساء للمارموسيت ، وأوجه التشابه في التنظيم الوظيفي العصبي مع البشر والرئيسيات الأخرى ، وصغر الحجم ومعدل التكاثر السريع¹. مع تزايد شعبية هذا الكائن النموذجي ، كان هناك تطور سريع في التقنيات الفسيولوجية العصبية المناسبة للاستخدام في دماغ المرموسيت. تستخدم طرق الفيزيولوجيا الكهربية على نطاق واسع في علم الأعصاب لدراسة نشاط الخلايا العصبية المفردة في قشرة كل من القوارض والرئيسيات ، مما يؤدي إلى دقة زمنية لا مثيل لها والوصول إلى الموقع. نظرا للحداثة النسبية لقرد المرموسيت كنموذج لعلم الأعصاب البصري ، لا يزال تحسين تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية المستيقظة يتطور. أظهرت الدراسات السابقة إنشاء بروتوكولات قوية للفيزيولوجيا الكهربية في مستحضرات التخدير² ، وأظهرت دراسات الفيزيولوجيا العصبية المبكرة التي تتصرف مستيقظا موثوقية ناخبات التنغستن أحادية القناة³. في السنوات الأخيرة ، أنشأ الباحثون استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة القائمة على السيليكون في الفيزيولوجيا العصبية المستيقظة⁴. ومع ذلك ، فإن يطرح تحديات استهداف فريدة بسبب صغر حجم دماغه ونقص المعالم التشريحية. يحدد هذا البروتوكول كيفية إنشاء واستخدام نظام تسجيل محرك أقراص صغير مناسب للمارموسيت الذي يسمح بتسجيل مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية مع صفائف خطية من السيليكون مع إنتاج الحد الأدنى من تلف الأنسجة.

يشكل العمل مع المارموسيت تحديا بسبب صغر حجم خرائط الريتينوتوبيا في القشرة البصرية مقارنة بالرئيسيات الأكبر. يمكن أن يؤدي التحول الطفيف للأقطاب الكهربائية بمقدار 1 مم فقط إلى تغييرات كبيرة في الخرائط. علاوة على ذلك ، غالبا ما يحتاج الباحثون إلى تغيير موضع الأقطاب الكهربائية بين جلسات التسجيل للحصول على نطاق أوسع من مواضع الشبكية في القشرة البصرية. لا تسمح المستحضرات شبه المزمنة الحالية بتعديل موضع القطب يوميا أو بدقة كافية لاستهداف مواقع محددة بمقاييس دون المليمتر⁵. مع وضع ذلك في الاعتبار ، يستخدم نظام الدفع الصغير المقترح مرحلة قطب كهربائي X-Y تقوم بتركيب محرك صغير خفيف الوزن إلى غرفة التسجيل وتسمح باستهداف المواقع القشرية دون المليمتر. تسمح مكونات المرحلة X-Y المتحركة بالحركة الرأسية والأفقية للمصفوفة الخطية من أجل اجتياز المناطق القشرية بشكل منهجي ، وهو أمر مطلوب لتحديد مناطق الاهتمام (عبر خصائص الشبكية والضبط). عبر جلسات التسجيل ، يمكن للباحثين أيضا ضبط مرحلة X-Y يدويا لتحويل المواقع المستهدفة داخل المنطقة. هذه ميزة رئيسية على التقنيات البديلة التي تستخدم مستحضرات التسجيل شبه المزمنة ، والتي لا تحتوي على آليات سهلة لاستهداف الأقطاب الكهربائية.

محرك الأقراص الصغير هو أداة متعددة الاستخدامات تتيح تركيب مصفوفات السيليكون المختلفة لخفضها إلى القشرة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام مسبار مخصص مع صفيفين خطيين من 32 قناة متباعدين 200 ميكرومتر للتحقيق في الدوائر الصفحية التي تمتد على عمق القشرة. عادة ما تأخذ معظم طرق فحص الدوائر العصبية عينات من الجهود الكهربائية أو الوحدات المفردة في المتوسط عبر جميع طبقات القشرة الدماغية. ومع ذلك ، فقد كشفت الأبحاث الحديثة عن نتائج مثيرة للاهتمام حول الدوائر الدقيقة الصفحية^{القشرية 6}. من خلال استخدام محرك الأقراص الصغير ، يمكن للباحثين استخدام مجسات رقائقية وإجراء تعديلات دقيقة على عمق التسجيل لضمان أخذ عينات شاملة عبر جميع الطبقات.

يمكن بناء هذا النظام بمكونات متاحة تجاريا ويمكن تعديله بسهولة لتقنيات أو مجسات تجريبية مختلفة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذا التحضير في القدرة على تغيير موضع تسجيل X-Y بدقة دون المليمتر والتحكم في عمق التسجيل داخل القشرة. يقدم هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لبناء تقنيات تسجيل محرك الأقراص الصغير والفيزيولوجيا العصبية في مرحلة X-Y.

Protocol

اتبعت الإجراءات التجريبية دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على بروتوكولات الإجراءات التجريبية والسلوكية من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة روتشستر.

1. بناء محرك الأقراص الصغير الذي يحتوي على القطب للتسجيل (الشكل 1)

ملاحظة: تسمح مراحل X-Y المصممة خصيصا والتي تحتوي على صفائف سيليكون خطية متعددة القنوات باستهداف مواقع التسجيل دون المليمتر.

1. اجمع كل أجزاء محرك الأقراص الصغير الموضحة في الشكل 1. استخدم بلاستيك أكريلونيتريل بوتادين ستايرين (ABS) الشفاف لطباعة الأجزاء المخصصة 3D. يتضمن ذلك الغلاف الواقي والقاعدة والمرحلة X والمرحلة Y. تصاميم لأجزاء 3D متوفرة على الانترنت (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). بالإضافة إلى ذلك ، اجمع القطب ، والمنصة البلاستيكية المستطيلة ، والشبكة ، والمناور الدقيق ، والأنابيب الفولاذية ، وستة مسامير من الفولاذ المقاوم للصدأ (حجم المسمار: 00).
   1. باستخدام أداة دوارة مع ملحق قطع عجلة الماس ، قم بقص قسم 4 مم × 3 مم × 3 مم من الشبكة البلاستيكية مع تباعد ثقوب 1 مم × 1 مم.
   2. استخدم الإيبوكسي لإصلاح قسم الشبكة الصغيرة المقطوعة في الجزء العلوي من المرحلة Y. بعد ذلك ، قم بتركيب محرك الأقراص الصغير فوق تلك الشبكة بمسمار. أضف الايبوكسي في قاعدته لتحقيق الاستقرار.
   3. نعلق منصة مستطيلة صغيرة 3D المطبوعة إلى أنبوب الصلب 28 G مع الايبوكسي. سيتم استخدام هذا في الخطوات المستقبلية لتثبيت قطب السيليكون.
   4. خيط أنبوب توجيه 23 G عبر الشبكة. بعد ذلك ، قم بربط الأنبوب الفولاذي المتصل بالمنصة البلاستيكية من خلال أنبوب التوجيه 23 G. ضع الأنبوب الفولاذي 28 G في إحدى فتحات محرك الأقراص الصغير.
   5. بعد ذلك ، قم بتجميع الأجزاء ثلاثية الأبعاد (القاعدة ، المرحلة X ، المرحلة Y) باستخدام مسامير سداسية من الفولاذ المقاوم للصدأ (الحجم: 00 ، الطول: 1/8 بوصة) لبناء قاعدة محرك الأقراص.
      1. أولا ، استخدم أداة التنصت اليدوية للاستفادة من فتحات البراغي المعدة مسبقا في كل من المرحلة الأساسية والمرحلة X. بعد ذلك ، ابدأ بإدخال أربعة براغي من خلال الفتحات الطويلة في المرحلة X وتثبيتها في فتحات البراغي المقابلة المعدة مسبقا في القاعدة.
      2. بمجرد تثبيت مرحلة X المتحركة في القاعدة ، أدخل مسمارين من خلال الفتحة الطويلة في المرحلة Y ، وقم بتثبيتهما في فتحات البراغي المعدة مسبقا في المرحلة X.
         ملاحظة: يجب أن تظل كل من المرحلة X والمرحلة Y قابلة للتحريك حتى يتم إحكام ربط البراغي بالكامل.
2. تأكد من أن محرك المناولة الدقيقة مزود بمنصة بلاستيكية لتوصيل موصل القطب ، بالإضافة إلى أنبوب بوليميد ممتد لتثبيت القطب. قم بتوصيل الموصل المكون من 64 سنا بالمنصة الموجودة على جهاز المعالجة الدقيقة باستخدام الشريط.
3. ضع بعناية القليل من الباسيتراسين (مرهم معقم) على الأنبوب البلاستيكي الموجود على جهاز المعالجة الدقيقة ، وقم بتوصيل القطب المتصل بالموصل المكون من 64 سنا عبر كابل شريط مرن.
4. استخدم محرك المناور الدقيق لتثبيت قطب السيليكون وموصله أثناء تمرير الأنبوب البلاستيكي من خلال فتحة في المرحلة Y. سيتم تعليق القطب تحت مرحلة المسبار ، في انتظار توصيله بالمنصة البلاستيكية المستطيلة (الخطوة 7 ، القسم 1).
5. افصل الموصل المكون من 64 سنا عن محرك المناولة الدقيقة ، واستخدم جل الغراء لتأمين الموصل بالمنصة على المرحلة X. يمكن إضافة إيبوكسي إضافي لتقوية رابطة الموصل بمجرد أن يثبته الغراء في مكانه. يترك طوال الليل حتى يجف.
6. افصل القطب بعناية عن الأنبوب البلاستيكي ، وقم بإزالة محرك المناولة الدقيقة من التجميع.
   ملاحظة: في هذه المرحلة، يتم تثبيت محرك الأقراص فقط مع مشبك التمساح الخاص ب HelpHands، ولا يكون القطب الكهربائي آمنا داخل بنية محرك الأقراص.
7. حرك مشبك التمساح بعناية لقلب محرك الأقراص لرؤية القطب غير الآمن. باستخدام ملقط طرف حاد ، ضع القطب على الحامل البلاستيكي أسفل المرحلة Y ، وقم بتثبيته بكمية صغيرة من المطاط الصناعي السيليكوني (السيلاستيك). انتظر لمدة 5 دقائق حتى تشفى المادة اللاصقة.
8. استخدم التحكم اللولبي على محرك الأقراص الصغير لسحب القطب.
9. ضع الغلاف الواقي فوق القطب على محرك الأقراص الصغير. هذا الغلاف الواقي هو نفس حجم غرف التسجيل المطبوعة حسب الطلب ويتناسب بشكل آمن مع قاعدة مجموعة محرك الأقراص.
10. باستخدام مفك براغي مسطح الرأس ، أحكم ربط البراغي الثلاثة الجانبية الموجودة على المكون الأساسي للمحرك الصغير لتثبيت الغلاف الواقي في مكانه. قم بتوصيل مرحلة الرأس المستخدمة للتسجيلات بالموصل المكون من 64 سنا.

2. طلاء Polytrode للأقطاب الكهربائية لتقليل المعاوقة الكلية (الشكل 2)

ملاحظة: للحصول على أفضل جودة تسجيل ، من المفيد طلاء صفائف أقطاب السيليكون بمحلول بولي (3،4-إيثيلين ديوكسي ثيوفين) (PEDOT). وقد ثبت أن هذه الطريقة تزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ^7,8.

1. لصنع محلول PEDOT ، اجمع 0.075 مل من 3،4-إيثيلين ديوكسي ثيوفين (EDOT) و 1.4 جم من بولي (الصوديوم 4-ستايرينسلفونات) (PSS) في 70 مل من الماء المقطر. دوامة هذا الحل لفترة وجيزة لضمان الحل الكامل للمكونات. امزج هذا المحلول في اليوم السابق للاستخدام للحصول على أفضل حل.
2. بعد تشغيل برنامج اختبار المعاوقة (انظر جدول المواد) ، قم بإعداد الإعدادات باستخدام إعداد القطب المختار. باستخدام القائمة المنسدلة العلوية أعلى يسار نافذة البرنامج ، حدد المحول المستخدم (N2T A32). باستخدام القائمة المنسدلة الثانية ، حدد القطب المستخدم (NLX-EIB-36). إذا لم يكن القطب مدرجا في القائمة المنسدلة ، فراجع الدليل لمعرفة كيفية تحديد قطب كهربائي جديد. تأكد من صحة عدد القنوات.
3. قم بتوصيل المسبار بنظام اختبار المعاوقة عبر الموصل ، وقم بخفض المسبار إلى محلول ملحي مؤرض للحصول على قراءة خط الأساس.
   1. في نظام اختبار المعاوقة ، اضغط على الزر اختبار المعاوقة على الجانب الأيسر ، وتأكد من الإعدادات الصحيحة (الإعدادات: تردد الاختبار: 1004 هرتز ، الدورات: 100 ، الإيقاف المؤقت: 0). ثم اضغط على زر اختبار المسبار في أسفل اليمين.
   2. ستظهر نافذة تقرير الفحص أثناء تشغيل اختبار المعاوقة ، وتخزين النتائج في جدول بيانات. احفظ هذه النتائج للرجوع إليها في المستقبل لكلا ساقي القطب (يتم تصوير تركيب القطب في دورق للاستخدام مع جهاز اختبار المعاوقة في الشكل 2D). في حالة استخدام مسبار بسيقان متعددة ، تأكد من تكرار الخطوة 3 لكل ساق.
4. قم بإزالة المسبار من المحلول الملحي عن طريق خفض القاعدة (أي مقبس المختبر) التي تحمل الدورق. استبدل سائل الدورق بالماء المقطر. ارفع مقبس المختبر لغمر القطب ، واشطف المحلول الملحي المتبقي ، ثم اخفض مقبس المختبر مرة أخرى.
5. استبدل الماء المقطر في الدورق بمحلول PEDOT ، وارفع مقبس المختبر حتى يتم غمر القطب في المحلول.
6. حدد زر DC Electroplate على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج ، وتأكد من استخدام الإعدادات الصحيحة (الإعدادات: Autoplate: 0.004 μA ، 350 هرتز ، المدة: 5 ، إيقاف مؤقت: 1). ثم اضغط على زر Autoplate في أسفل اليمين. مرة أخرى ، ستظهر نافذة تقرير المسبار مع نتائج الطلاء الكهربائي. احفظ هذه النتائج للرجوع إليها في المستقبل. في حالة استخدام مسبار بسيقان متعددة ، تأكد من تكرار هذه الخطوة لكل ساق.
7. قم بإزالة المسبار من محلول PEDOT عن طريق خفض مقبس المختبر ، وشطف المسبار بالماء المقطر كما تم إجراؤه سابقا (الخطوة 4). بعد الشطف ، املأ الدورق بمحلول ملحي ، وارفع مقبس المختبر حتى يتم غمر القطب.
8. اضغط على زر اختبار المعاوقة على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج ، وتأكد من استخدام الإعدادات الصحيحة (الإعدادات: تردد الاختبار: 1004 هرتز ، الدورات: 100 ، الإيقاف المؤقت: 0). اضغط على زر اختبار التحقيق في أسفل اليمين. احفظ هذه النتائج للرجوع إليها في المستقبل. في حالة استخدام مسبار بسيقان متعددة ، تأكد من تكرار هذه الخطوة لكل ساق.
   ملاحظة: قارن قيم ما بعد الطلاء الكهربائي بقيم الطلاء الكهربائي. يجب أن يكون هناك انخفاض في قيم المعاوقة.
9. مع الاستخدام المستمر ، قد تظهر المجسات زيادات في قيم المعاوقة بعد 6 أشهر. إذا كان هناك قلق بشأن قيم المعاوقة من إشارة التسجيل ، فأعد اختبار معاوقة المسبار باتباع الخطوة 3. إذا زادت قيم المعاوقة من القيم الأولية ، كرر الطلاء الكهربائي (الخطوة 6).

3. الوضع الجراحي لغطاء الرأس والغرف وحج القحف (الشكل 3A-C)

ملاحظة: في هذا العمل ، عند انتهاء الدراسة ، تم تخدير تحت إيزوفلوران وتلقى الحقن العضلي (IM) من الكيتامين ، تليها حقنة داخل الصفاق (IP) من يوثاسول. تم استخراج الدماغ بعد التروية عبر القلب مع محلول ملحي متبوعا بنسبة 10٪ فورمالين.

1. تدريب marmosets (على الأقل 1.5 سنة من العمر) للجلوس على كرسي الرئيسيات الصغيرة باتباع الطرق الموصوفة سابقا^3،9،10،11 2 أشهر قبل الجراحة.
2. في يوم الجراحة ، حث الأشخاص بالحقن العضلي (i.m) من الكيتامين (5-15 مجم / كجم) / dexdormitor (0.02-0.1 مجم / كجم) (والميدازولام عند 0.25 مجم / كجم كمرخي للعضلات) ، وتأكيد التخدير المناسب بناء على معدل ضربات القلب والتنفس ومنعكس قرصة إصبع القدم. تنبيب من أجل إعطاء الأيزوفلوران المستمر (0.5٪ -2٪ في الأكسجين بنسبة 100٪) طوال الجراحة مع مراقبة عناصرها الحيوية. استخدم مرهم الطبيب البيطري على العينين أثناء الجراحة لمنع الجفاف أثناء التخدير.
3. بعد أن يرتدي الجراحون معدات الوقاية الشخصية المعقمة ، قم بإعداد مجال جراحي معقم باستخدام ستائر معقمة لتغطية الأسطح ومجال الجراحة. باستخدام تقنيات التعقيم ، اطلب من الجراحين زرع غطاء رأس أكريليك مع أعمدة ومسامير من التيتانيوم لتثبيت الرأس باستخدام الطرق الموضحة بالتفصيل سابقا بواسطة Nummela et ^al.11.
4. أثناء جراحة الزرع ، خطط لمواضع غرفة التسجيل على مناطق الاهتمام (على سبيل المثال ، المناطق البصرية المنطقة الزمنية الوسطى [MT] ، والقشرة البصرية الأولية [V1]) بناء على الإحداثيات التجسيمية¹².
5. ضع سلك التأريض.
   1. ابدأ بحفر ثقب لدغ 1.1 مم في الجمجمة بالقرب من منطقة غرفة التسجيل المخطط لها. ثني سلك الفولاذ المقاوم للصدأ 36 G حوالي 0.075-1 مم من الطرف ، وحرك الجزء المثني من السلك بين الجمجمة والجافية في الجزء السفلي من ثقب الأزيز.
   2. في البداية أغلق السلك والثقب بشمع العظام ثم بالأسمنت والأكريليك عند وضع الغرف. تأكد من ترك جزء بالخارج بالقرب من الحجرة لإرفاقه للتأريض.
6. بعد وضع طبقة أساسية من الأسمنت اللاصق السريع لتغطية كامل مساحة موقع التسجيل وسلك التأريض ، قم بلصق غرف التسجيل (التي تتكون من أجزاء مطبوعة 3D مخصصة) بالجمجمة باستخدام الأسمنت اللاصق السريع ، وقم بتعزيزها بالأكريليك عند بناء غرسة الرأس.
7. ختم الغرف مع غطاء غرفة مطبوعة 3D التي تم تصميمها لتناسب بإحكام داخل الغرفة (ولا يمكن إزالتها من قبل زملاء القفص مع هذا الموضوع).
   1. قم بتوزيع كمية صغيرة من المطاط الصناعي السيليكوني (السيلاستيك) حول الحواف الداخلية للغرفة باستخدام أطراف الخلط المرفقة ، ثم أدخل غطاء الحجرة حتى يتدفق مع جدران الحجرة الخارجية.
   2. تم تصميم الغرف بفتحات وصول (قطرها 1 مم) على جانبي الحجرة لضمان إمكانية إزالة غطاء الحجرة بسهولة. استخدم السيلاستيك لإغلاق فتحات الوصول هذه ، مما ينتج عنه ختم حجرة محكم الإغلاق.
      ملاحظة: لإزالة أغطية الحجرة ، استخدم الملقط لإزالة السد السيلاستي لفتحات الوصول أولا لكسر الختم المحكم للغرفة. بعد ذلك ، يمكن استخدام دبوس للاستفادة من غطاء الغرفة خارج الغرفة.
8. استعادة من التخدير ، وعدم تركها دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على راقد القص. علاج بعد الجراحة بالمضادات الحيوية (حمض أموكسيسيلين-كلافولانيك بمعدل 13.75 ملغ/كغ) لمدة 7 أيام ومضادات الالتهاب (ميلوكسيكام بمعدل 0.1 ملغ/كغ) لمدة 3 أيام. أعط مسكنات الألم بطيئة الإطلاق قبل الشفاء لمدة 72 ساعة بعد الجراحة ، وقم بإيواء بشكل مستقل حتى الشفاء التام.
9. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الجراحة ، ابدأ في تدريب ضبط الرأس والسلوك البصري. ضع المرموسيت على كرسي الرئيسيات ، واسمح بالتأقلم مع مسند الرأس. بمجرد الراحة ، قم بتدريب marmoset على أداء العديد من المهام الأساسية ، بما في ذلك التثبيت البصري المركزي¹³ ، ومهمة saccade نحو شبكة Gabor المكتشفة محيطيا ، والتي تستخدم لقياس حدة البصر¹¹.
10. بعد التدريب السلوكي الكافي ، قم بإجراء حج القحف داخل غرفة التسجيل. في ظل تقنيات معقمة ، قم بإجراء عملية جراحية ثانية لإنشاء حج القحف (قطره 2-3 مم) في غرفة التسجيل فوق المنطقة ذات الاهتمام (على سبيل المثال ، المنطقة MT). ختم حج القحف مع تطبيق سميك من السيلاستيك من حوالي 1 مم أو عمق حج القحف لحماية الدماغ من العدوى وتقليل نمو التحبيب¹⁴. تأكد من أن الختم السيلاستيك له حواف تمسك بما لا يقل عن 2 مم أو أكثر من الأسمنت السني من جميع الجوانب. استبدل غطاء الحجرة كما هو موضح في الخطوة 7.
11. في حالة حدوث أي نزيف أو تسرب الختم السيلاستي سوائل صافية في الأيام التالية للجراحة ، فستحتاج الغرفة إلى التنظيف.
    1. إذا كان ختم السيلاستيك سليما ، فاستخدم تقنيات معقمة للتنظيف باستخدام 10٪ بيتادين ، واغسله بمحلول ملحي معقم قبل إزالة الختم. إذا لم يكن ختم السيلاستيك سليما ، فقم بتنظيفه فقط بمحلول ملحي معقم تحت تقنيات معقمة.
    2. بمجرد إزالة السيلاستيك ، اغسل الجافية بمحلول ملحي معقم عدة مرات ، وجففها باستخدام قضيب بطرف قطني. قم بتجفيف الحجرة جيدا باستخدام قضيب طرف قطني قبل وضع طبقة جديدة من السيلاستيك. عادة ، تستقر الغرفة وتبقى جافة مع ختم محكم بعد بضعة أيام إلى 1 أسبوع.
12. بمجرد استقرار حج القحف وعدم ظهور أي علامات للنزيف ، قم بإجراء كشط الجافية لإزالة الأنسجة الزائدة فوق الجافية. بعد ذلك ، ضع طبقة رقيقة (<1 مم) من السيلاستيك (رقيقة بما يكفي لتمكين مرور الأقطاب الكهربائية للتسجيلات) ، واستخدم مثقاب 1/4 لدغ لفتل السيلاستيك فوق جدران حج القحف ، كما هو موضح في الشكل 3C ، للشراء الميكانيكي.
    ملاحظة: سيسمح هذا أيضا بإزالة أسهل لأغراض التنظيف. يمكن أن يبقى السيلاستيك في مكانه طوال مدة الدراسة ويمكن ثقبه بأقطاب صفيف خطية للتسجيل.

4. إعداد تسجيل الفيزيولوجيا العصبية (الشكل 3D-F)

ملاحظة: ستختلف خطوات التعامل مع حسب المختبر والتجربة. الخطوات التالية خاصة بوضع محرك الأقراص الصغير واختراق الجافية للتسجيلات.

1. قم بإزالة الغطاء من حجرة التسجيل (الموضح في القسم 3 ، الخطوة 7.2). ضع الغطاء في 91٪ كحول الأيزوبروبيل لينقع أثناء التسجيل. تأكد من أن حواف الحجرة خالية من السيلاستيك. إذا تم ترك السيلاستيك على حواف الغرفة ، فلن يجلس محرك الأقراص الصغير بشكل صحيح.
2. تحتوي قاعدة محرك الأقراص الصغير على ثلاثة براغي لتشديده على الغرفة على. عادة ، يتم شد هذه البراغي في مكانها حول غلاف واقي بنفس حجم الحجرة للحفاظ على مسبار السيليكون بالداخل محميا من الاصطدام.
   1. أولا ، استخدم مفك البراغي لفك البراغي الثلاثة التي تحمل الغلاف الواقي فوق مسبار السيليكون ، وقم بإزالة الغلاف بعناية. قم بتوصيل محرك الأقراص الصغير بغرفة التسجيل ، مع الحرص على عدم ضرب أقطاب السيليكون على جدران الغرفة (الشكل 3D ، E).
   2. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من أن الأقطاب الكهربائية في وضع متراجع تماما قبل وضع محرك الأقراص على الحجرة ، بحيث تجلس فوق القشرة عند الموضع الأولي.
3. بمجرد وضعه ، استخدم مفك البراغي لإحكام ربط كل برغي على جانب محرك الأقراص الصغير (الشكل 3F). اختر أمرا لإحكام ربط البراغي ، واستخدمه في كل مرة للحفاظ على الاستقرار في الموقع. قد يرغب الباحثون أيضا في حساب عدد الدورات عند فك البراغي في البداية لتشديدها بمقدار مماثل. تحقق مما إذا كان المسبار مفكوكا ، وشده حسب الحاجة ، ولكن احرص على عدم تجريد الخيوط اللولبية في البلاستيك عن طريق الإفراط في الشد.
4. بمجرد تثبيت محرك الأقراص الصغير في الغرفة ، ضع جميع أسلاك التأريض اللازمة.
   ملاحظة: اترك مرحلة الرأس مدخلة في الموصل طوال الليل ، وأدخل فقط كابل الواجهة الطرفية التسلسلية (SPI) في مرحلة الرأس للتسجيلات لأنه من الصعب إدخال مرحلة الرأس في الموصل أثناء وجودها على.
5. قم بتوصيل كبل SPI بعناية في مرحلة الرأس (متصل بالفعل بالمسبار). تأكد من عدم ثني السلك. تضخيم ورقمنة جميع بيانات الفيزيولوجيا العصبية من مرحلة الرأس عند 30 كيلو هرتز باستخدام واجهة المستخدم الرسومية Open-Ephys (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). مرشح ترددات عالية لإشارة النطاق العريض من مرحلة الرأس عند 0.1 هرتز. صحيح لتحولات الطور من هذا الترشيح ، كما هو موضح سابقا¹⁵. بالنسبة للمصفوفات الخطية، قم بالمعالجة المسبقة للآثار الناتجة عن طريق الرجوع إلى المتوسط المشترك.
6. أدخل خريطة القناة لمصفوفة الأقطاب الكهربائية المعينة المستخدمة في نظام التسجيل بحيث يتم ترتيب القنوات المرسومة أثناء التسجيل حسب العمق في عرض إشارة التسجيل عالية التردد. سيتم استخدام هذا العرض عند التقدم وسحب القطب.

5. إجراء تجربة تسجيل الفيزيولوجيا العصبية (الشكل 4)

ملاحظة: هنا ، يتم وصف طريقة خفض صفائف الأقطاب الكهربائية في القشرة ؛ تم تحسين هذه الطريقة لتجنب التنقير المفرط للأنسجة الكامنة. توفر الزيادة في الضوضاء في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية مؤشرا جيدا على التنقير قبل اختراق السيلاستيك ودخول الدماغ. بمجرد دخول الدماغ ، إذا كان هناك الكثير من التنقير ، فقد يلاحظ الباحث وحدات تتحرك على المسبار حتى بدون التلاعب بمحرك الأقراص (الوحدات تتحرك تدريجيا عبر القنوات في العمق) ، أو بدلا من ذلك ، قد يلاحظ الباحث قمع النشاط العصبي ، خاصة في المواقع السطحية على المسبار. في هذه الظروف ، يتم سحب محرك الأقراص لتخفيف التنقير وتسهيل التسجيلات بشكل أفضل.

1. باستخدام التحكم اللولبي على محرك الأقراص الصغير ، قم بخفض مسبار السيليكون ، مع إجراء دورة واحدة (250 ميكرومتر) كل 1-2 ثانية حتى يتم ملاحظة الوحدات عند طرف المصفوفة.
   ملاحظة: يمكن ملاحظة زيادة طفيفة في الضوضاء أثناء تغلغل السيلاستيك الموضوعة فوق الجافية. سوف تقوم السيقان بغموض السيلاستيك قبل أن تظهر ، مما قد يزيد من الضوضاء على المسبار. يساعد النزول السريع حتى أول علامة على الوحدات في اختراق الطبقة السيلاستية.
2. بمجرد ملاحظة الخلايا العصبية الأولى ، اسحب دورة واحدة من محرك الأقراص الصغير (250 ميكرومتر) لتقليل سرعة الدخول حيث يبدأ القطب في الظهور عبر السيلاستيك والجافية إلى الأنسجة القشرية. إذا بدا أن القطب الكهربائي يستمر في التقدم إلى الأنسجة بمرور الوقت دون معالجة دقيقة ، فتراجع عن دورة إضافية لتخفيف الضغط من المسبار الذي يضغط على السيلاستيك والأنسجة الموجودة تحته.
   ملاحظة: يجب أن يكون من الممكن تتبع موقع الخلايا العصبية إذا تم تحميل خريطة القناة الصحيحة للمصفوفة الخطية (ستظهر القنوات مرتبة حسب عمقها بالنسبة للقشرة).
3. استمر في دفع المصفوفة إلى القشرة ببطء شديد ، مع التقدم بحوالي أربع إلى ست لفات (1-1.5 مم) على مدار 20-30 دقيقة حتى يتم توزيع الخلايا العصبية بالتساوي عبر طول المسبار.
4. اسحب المصفوفة ببطء بمقدار دورة إلى دورتين (0.25-0.5 مم) لتقليل الضغط على الأنسجة قبل بدء التسجيلات.
   ملاحظة: لا تقوم الخلايا العصبية عادة بتغيير موقع القناة على المصفوفة الخطية أثناء هذا التراجع ، مما يشير إلى أنها تعمل بشكل أساسي على تقليل الضغط على الأنسجة. بدون تراجع ، يمكن رؤية تحول مستمر في المصفوفة أثناء التسجيل حيث يرتاح النسيج ، مما يعطل استقرار التسجيل (الشكل 4C).
5. بعد التراجع ، انتظر 20 دقيقة قبل بدء التسجيلات. سيؤدي ذلك إلى الحد من مقدار الحركة التي تظهر في التسجيل. استخدم هذا الوقت للتحضير للتسجيل (أي معايرة تتبع العين وإعداد أنظمة عرض التحفيز).
6. حدد تسجيل في برنامج التسجيل.
7. عند اكتمال التجربة، حدد زر التسجيل مرة أخرى. سيؤدي هذا إلى إنشاء ملف التسجيل الكامل في الوجهة المحددة. تأكد من حفظ الملف بشكل صحيح قبل المتابعة.
8. ابدأ ببطء في سحب المصفوفة من القشرة بسرعة مماثلة كما كان من قبل (أربع إلى ست لفات على مدار 20-30 دقيقة). تخيل المسبار وهو يتراجع من خلال مشاهدة الخلايا العصبية تتحرك على طول المسبار. بعد التراجع بعدد الدورات منذ رؤية الخلايا العصبية لأول مرة وعندما لا يتم ملاحظة المزيد من الخلايا العصبية على المسبار ، استمر في التراجع بسرعة أكبر حتى العودة إلى وضع البداية المتراجع بالكامل.
9. لإزالة المسبار من غرفة التسجيل ، قم بتنفيذ الخطوات من 1 إلى 3 في القسم 4 بترتيب عكسي (على سبيل المثال ، قم أولا بتنفيذ الخطوة 3 ، متبوعة بالخطوة 2 ، ثم الخطوة 1).
10. بمجرد إزالة المسبار من حجرة التسجيل ، انقعه في محلول العدسات اللاصقة لمدة 20 دقيقة لإزالة أي نسيج أو دم من القطب. بعد ذلك ، ضع المسبار في الكحول لمدة 1 دقيقة لإزالة محلول العدسات اللاصقة ، واترك القطب يجف.
11. استخدم Kilosort2 لفرز بيانات الصفيف بعد التصفية الأولية من نظام التسجيل (كما هو موضح سابقا في القسم 4 ، الخطوة 5).
    1. قم بتسمية المخرجات يدويا من خوارزميات فرز السنبلة باستخدام واجهة المستخدم الرسومية "phy" (https://github/kwikteam/phy). صنف الوحدات ذات الأشكال الموجية الصغيرة أو غير المعقولة من الناحية الفسيولوجية على أنها ضوضاء ، واستبعدها.
    2. في حالة استخدام مجسات رقائقية ، اعرض أشكال موجات السنبلة عبر كل قناة لضمان تسمية الوحدات الفردية على القناة بشكل موجة الذروة (الشكل 5 أ). قم فقط بتضمين الوحدات التي تحتوي على مجموعات واضحة في مساحة PCA ، وأقل من 1٪ من انتهاكات الفاصل الزمني بين السنبلة ، وأشكال موجات السنبلة ثنائية الطور (والتي يجب توطينها في القنوات المجاورة على المصفوفة الخطية). يظهر مثال على وحدة واحدة في الشكل 5B ، والذي يعرض مجموعات واضحة في مساحة PCA (أعلى اليمين) والاستقرار بمرور الوقت (أسفل اليمين).

النتائج

يصف هذا البروتوكول كيفية بناء مرحلة قطب X-Y (الشكل 1) التي تسمح باستهداف المواقع دون المليمتر وتحافظ على تحديد المواقع بشكل موثوق عبر جلسات تسجيل منفصلة. يتم توضيح موثوقية تحديد المواقع X-Y في الشكل 6 ، والذي يوضح أن جلستي تسجيل أجريتا بفارق أسبوع أظهرتا تداخلا...

Discussion

تتوفر حاليا عدة طرق (على سبيل المثال ، مزمنة وشبه مزمنة وحادة) لإجراء تجارب الفيزيولوجيا العصبية في الرئيسيات غير البشرية. يشكل المرموسيت الشائع تحديات فريدة لتجارب الفيزيولوجيا العصبية نظرا لصغر حجمه ونقص الجير كمعالم تشريحية. وهذا يتطلب من الباحثين استخدام المعالم الفسيولوجية العصبية...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachement for dremmel	Dremmel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedence Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instuments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html