Electrofisiología de la actividad cortical laminar en el tití común

Resumen

Los microaccionamientos personalizados permiten la focalización submilimétrica de los sitios de registro cortical con matrices de silicio lineales.

Resumen

El mono tití proporciona un modelo ideal para examinar circuitos corticales laminares debido a su superficie cortical lisa, que facilita las grabaciones con matrices lineales. El tití ha crecido recientemente en popularidad debido a su organización funcional neuronal similar a la de otros primates y sus ventajas técnicas para el registro y la obtención de imágenes. Sin embargo, la neurofisiología en este modelo plantea algunos desafíos únicos debido al pequeño tamaño y la falta de circunvoluciones como puntos de referencia anatómicos. Mediante el uso de microunidades personalizadas, los investigadores pueden manipular la colocación de matrices lineales con una precisión submilimétrica y grabar de forma fiable en la misma ubicación retinotópica durante los días de grabación. Este protocolo describe la construcción paso a paso del sistema de posicionamiento de microaccionamiento y la técnica de registro neurofisiológico con guías de electrodos lineales de silicio. Con un control preciso de la colocación de los electrodos en las sesiones de grabación, los investigadores pueden atravesar fácilmente la corteza para identificar áreas de interés en función de su organización retinotópica y las propiedades de sintonización de las neuronas registradas. Además, utilizando este sistema de electrodos de matriz laminar, es posible aplicar un análisis de densidad de fuente de corriente (CSD) para determinar la profundidad de registro de las neuronas individuales. Este protocolo también muestra ejemplos de grabaciones laminares, incluidas las formas de onda de pico aisladas en Kilosort, que abarcan múltiples canales en las matrices.

Introducción

El tití común (Callithrix jacchus) ha crecido rápidamente en popularidad como modelo para estudiar la función cerebral en los últimos años. Esta creciente popularidad se debe a la accesibilidad de la corteza lisa del tití, las similitudes en la organización funcional neuronal con los humanos y otros primates, y el pequeño tamaño y la rápida tasa de reproducción¹. A medida que este organismo modelo ha crecido en popularidad, ha habido un rápido desarrollo de las técnicas neurofisiológicas adecuadas para su uso en el cerebro del tití. Los métodos de electrofisiología se utilizan ampliamente en neurociencia para estudiar la actividad de neuronas individuales en la corteza tanto de roedores como de primates, lo que da como resultado una resolución temporal y un acceso a la ubicación sin precedentes. Debido a la relativa novedad del mono tití como modelo de neurociencia visual, la optimización de las técnicas de electrofisiología que se comportan despiertos sigue evolucionando. Estudios previos han demostrado el establecimiento de protocolos robustos para la electrofisiología en preparaciones anestesiadas², y los estudios de neurofisiología que se comportan con el despertar temprano han demostrado la confiabilidad de los electrodos de tungsteno de un solo canal³. En los últimos años, los investigadores han establecido el uso de matrices de microelectrodos basadas en silicio para la neurofisiología del comportamiento despierto⁴. Sin embargo, el tití plantea desafíos únicos debido al pequeño tamaño de su cerebro y la falta de puntos de referencia anatómicos. Este protocolo describe cómo construir y utilizar un sistema de registro de micro-accionamiento adecuado para el tití que permite el registro de grandes poblaciones de neuronas con matrices lineales de silicio mientras produce un daño tisular mínimo.

Trabajar con el tití supone un reto debido a la menor escala de los mapas retinotópicos en la corteza visual en comparación con los primates más grandes. Un ligero desplazamiento de los electrodos de solo 1 mm puede provocar cambios significativos en los mapas. Además, los investigadores a menudo necesitan alterar la colocación de los electrodos entre las sesiones de grabación para obtener una gama más amplia de posiciones retinotópicas en la corteza visual. Las preparaciones semicrónicas actuales no permiten el ajuste de la posición del electrodo diariamente o con suficiente precisión para apuntar a ubicaciones específicas a escalas submilimétricas⁵. Con esto en mente, el sistema de microaccionamiento propuesto utiliza una etapa de electrodo X-Y que monta un microaccionamiento liviano en una cámara de registro y permite la focalización submilimétrica de sitios corticales. Los componentes móviles de la etapa X-Y permiten el movimiento vertical y horizontal de la matriz lineal para atravesar las áreas corticales de forma sistemática, lo que es necesario para identificar áreas de interés (a través de la retinotopía y las propiedades de ajuste). A lo largo de las sesiones de grabación, los investigadores también pueden ajustar manualmente la etapa X-Y para cambiar los sitios objetivo dentro del área. Esta es una ventaja clave sobre las técnicas alternativas que utilizan preparaciones de registro semicrónicas, que no tienen mecanismos fáciles de apuntar a los electrodos.

El microaccionamiento es una herramienta versátil que permite montar varias matrices de silicio para su descenso a la corteza. En este protocolo, se utilizó una sonda personalizada con dos matrices lineales de 32 canales espaciadas a 200 μm para la investigación de circuitos laminares que abarcan la profundidad cortical. La mayoría de los métodos para sondear los circuitos neuronales suelen muestrear los potenciales eléctricos o unidades individuales promediadas en todas las capas de la corteza cerebral. Sin embargo, investigaciones recientes han revelado hallazgos intrigantes sobre los microcircuitos laminares corticales⁶. Al utilizar el microaccionamiento, los investigadores pueden utilizar sondas laminares y realizar ajustes finos en la profundidad de grabación para garantizar un muestreo completo en todas las capas.

Este sistema se puede construir con componentes disponibles en el mercado y se modifica fácilmente para diferentes técnicas experimentales o sondas. Las principales ventajas de esta preparación son la capacidad de cambiar la posición de grabación X-Y con una precisión submilimétrica y controlar la profundidad de la grabación dentro de la corteza. Este protocolo presenta instrucciones paso a paso para la construcción de las técnicas de registro de neurofisiología y microaccionamiento de la etapa X-Y.

Protocolo

Los procedimientos experimentales siguieron la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los protocolos para los procedimientos experimentales y conductuales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester.

1. Construcción del microaccionamiento que contiene el electrodo para el registro (Figura 1)

NOTA: Las etapas X-Y personalizadas que contienen matrices de silicio lineal multicanal permiten una orientación submilimétrica de los sitios de grabación.

1. Reúna todas las piezas de la microunidad que se describen en la Figura 1. Utiliza plástico transparente de acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) para imprimir en 3D las piezas personalizadas. Esto incluye la funda protectora, la base, la etapa X y la etapa Y. Los diseños para piezas 3D están disponibles en línea (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). Además, reúna el electrodo, la plataforma rectangular de plástico, la rejilla, el micromanipulador, el tubo de acero y seis tornillos de acero inoxidable (tamaño del tornillo: 00).
   1. Con una herramienta rotativa con un accesorio de corte de disco de diamante, corte una sección de 4 mm x 3 mm x 3 mm de la rejilla de plástico con un espacio entre orificios de 1 mm x 1 mm.
   2. Use epoxi para fijar la pequeña sección de la rejilla recortada en la parte superior de la etapa Y. A continuación, coloque el microaccionamiento sobre esa rejilla con un tornillo. Agregue epoxi en su base para mayor estabilidad.
   3. Fije la pequeña plataforma rectangular impresa en 3D a un tubo de acero de 28 G con epoxi. Esto se utilizará en pasos futuros para sujetar el electrodo de silicio.
   4. Pase un tubo guía de 23 G a través de la rejilla. A continuación, pase el tubo de acero unido a la plataforma de plástico a través del tubo guía de 23 G. Coloque el tubo de acero de 28 G en una de las ranuras del microaccionamiento.
   5. A continuación, ensamble las piezas 3D (base, etapa X, etapa Y) con tornillos hexagonales de acero inoxidable (tamaño: 00, longitud: 1/8 pulg.) para construir la base de la unidad.
      1. Primero, use una herramienta de roscado manual para golpear los orificios de los tornillos prefabricados tanto en la base como en la etapa X. Luego, comience insertando cuatro tornillos a través de las ranuras largas en la etapa X y asegándolos a los orificios de tornillo correspondientes prefabricados en la base.
      2. Una vez que la etapa X móvil esté asegurada a la base, inserte dos tornillos a través de la ranura larga en la etapa Y y asegúrelos a los orificios de los tornillos prefabricados en la etapa X.
         NOTA: Tanto la etapa X como la etapa Y deben permanecer móviles hasta que los tornillos estén completamente apretados.
2. Asegúrese de que el accionamiento del micromanipulador esté equipado con una plataforma de plástico para sujetar el conector del electrodo, así como con un tubo de poliimida extendido para sujetar el electrodo. Conecte el conector de 64 pines a la plataforma del micromanipulador con cinta adhesiva.
3. Coloque con cuidado un poco de bacitracina (ungüento estéril) en el tubo de plástico del micromanipulador y conecte el electrodo conectado al conector de 64 pines a través de un cable plano flexible.
4. Utilice el accionamiento del micromanipulador para sujetar el electrodo de silicona y su conector mientras pasa el tubo de plástico a través de un orificio en la etapa Y. El electrodo estará colgando debajo de la platina de la sonda, a la espera de ser conectado a la plataforma rectangular de plástico (paso 7, sección 1).
5. Desconecte el conector de 64 pines de la unidad del micromanipulador y use gel de pegamento para asegurar el conector a la plataforma en la etapa X. Se puede agregar epoxi adicional para fortalecer la unión del conector una vez que el pegamento lo mantiene en su lugar. Dejar secar toda la noche.
6. Separe con cuidado el electrodo del tubo de plástico y retire la unidad del micromanipulador del conjunto.
   NOTA: En este punto, la unidad solo se sostiene con la pinza de cocodrilo de un Helping Hands, y el electrodo no está seguro dentro de la construcción de la unidad.
7. Mueva con cuidado la pinza de cocodrilo para voltear la unidad y ver el electrodo no asegurado. Con unas pinzas de punta roma, coloque el electrodo en el soporte de plástico debajo de la etapa Y y asegúrelo con una pequeña cantidad de elastómero de silicona (silástico). Espere 5 minutos hasta que el adhesivo se haya curado.
8. Utilice el control de tornillo en el microaccionamiento para retraer el electrodo.
9. Coloque la funda protectora sobre el electrodo en el microaccionamiento. Esta funda protectora tiene el mismo tamaño que las cámaras de grabación impresas a medida y encaja de forma segura en la base del conjunto de la unidad.
10. Con un destornillador de punta plana, apriete los tres tornillos laterales en el componente base del microaccionamiento para asegurar la funda protectora en su lugar. Conecte el cabezal utilizado para las grabaciones en el conector de 64 pines.

2. Recubrimiento de politrodo de electrodos para reducir la impedancia general (Figura 2)

NOTA: Para obtener la mejor calidad de grabación, es útil electrovar las guías de electrodos de silicio con una solución de poli(3,4-etilendioxitiofeno) (PEDOT). Se ha demostrado que este método aumenta la relación señal-ruido ^7,8.

1. Para hacer la solución de PEDOT, combine 0,075 ml de 3,4-etilendioxitiofeno (EDOT) y 1,4 g de poli(4-estirenosulfonato de sodio) (PSS) en 70 ml de agua destilada. Realice una breve descarga de esta solución para garantizar la disolución completa de los componentes. Mezcle esta solución el día antes de usarla para obtener la mejor disolución.
2. Después de iniciar el software del probador de impedancia (consulte la Tabla de materiales), prepare los ajustes con la preparación del electrodo elegido. Usando el menú desplegable superior en la parte superior izquierda de la ventana del software, seleccione el adaptador que se está utilizando (N2T A32). Usando el segundo menú desplegable, seleccione el electrodo que se está utilizando (NLX-EIB-36). Si el electrodo no aparece en el menú desplegable, consulte el manual para saber cómo definir un nuevo electrodo. Asegúrese de que el número de canales sea correcto.
3. Conecte la sonda al sistema de prueba de impedancia a través del conector y baje la sonda a una solución salina conectada a tierra para obtener una lectura de referencia.
   1. En el sistema de prueba de impedancia, presione el botón Probar impedancias en el lado izquierdo y asegúrese de que la configuración sea correcta (Configuración: Frecuencia de prueba: 1,004 Hz, Ciclos: 100, Pausa: 0). Luego, presione el botón Sonda de prueba en la parte inferior derecha.
   2. Aparecerá una ventana de informe de sondeo a medida que se ejecuta el probador de impedancia, almacenando los resultados en una hoja de cálculo. Guarde estos resultados para referencia futura para ambos vástagos del electrodo (el montaje del electrodo en un vaso de precipitados para su uso con el probador de impedancia se muestra en la Figura 2D). Si utiliza una sonda con varios vástagos, asegúrese de repetir el paso 3 para cada vástago.
4. Retire la sonda de la solución salina bajando el pedestal (es decir, el gato de laboratorio) que sostiene el vaso de precipitados. Reemplace el líquido del vaso de precipitados con agua destilada. Levante el conector de laboratorio para sumergir el electrodo, enjuague la solución salina restante y luego vuelva a bajar el conector de laboratorio.
5. Reemplace el agua destilada en el vaso de precipitados con solución PEDOT y levante el gato de laboratorio hasta que el electrodo esté sumergido en la solución.
6. Seleccione el botón Galvanizado de CC en el lado izquierdo de la ventana del software y asegúrese de que se utilizan los ajustes correctos (Ajustes: Autoplateado: 0,004 μA, 350 Hz, Duración: 5, Pausa: 1). Luego, presione el botón Autoplate en la parte inferior derecha. Una vez más, aparecerá una ventana de informe de sonda con los resultados de la galvanoplastia. Guarde estos resultados para futuras consultas. Si utiliza una sonda con varios vástagos, asegúrese de repetir este paso para cada vástago.
7. Retire la sonda de la solución PEDOT bajando el gato de laboratorio y enjuague la sonda con agua destilada como se realizó anteriormente (paso 4). Después de enjuagar, llene el vaso de precipitados con solución salina y levante el gato de laboratorio hasta que el electrodo esté sumergido.
8. Presione el botón Impedancias de prueba en el lado izquierdo de la ventana del software y asegúrese de que se utilicen los ajustes correctos (Configuración: Frecuencia de prueba: 1,004 Hz, Ciclos: 100, Pausa: 0). Presione el botón Sonda de prueba en la parte inferior derecha. Guarde estos resultados para futuras consultas. Si utiliza una sonda con varios vástagos, asegúrese de repetir este paso para cada vástago.
   NOTA: Compare los valores posteriores a la galvanoplastia con los valores pregalvanizados. Debería haber una disminución en los valores de impedancia.
9. Con el uso continuo, las sondas pueden mostrar aumentos en los valores de impedancia después de 6 meses. Si hay alguna duda sobre los valores de impedancia de la señal de grabación, vuelva a probar las impedancias de la sonda siguiendo el paso 3. Si los valores de impedancia han aumentado con respecto a los valores iniciales, repita la galvanoplastia (paso 6).

3. Colocación quirúrgica de la tapa cefálica, las cámaras y la craneotomía (Figura 3A-C)

NOTA: En este trabajo, al final del estudio, el animal fue anestesiado bajo isoflurano y recibió inyecciones intramusculares (IM) de ketamina, seguidas de una inyección intraperitoneal (IP) de eutasol. El cerebro se extrajo después de una perfusión transcardíaca con solución salina seguida de formalina al 10%.

1. Entrene a los titíes (de al menos 1,5 años de edad) para que se sienten en una silla pequeña de primates siguiendo los métodos descritos anteriormente 3,9,10,11 2 meses antes de la cirugía.
2. El día de la cirugía, inducir a los sujetos con una inyección intramuscular (i.m.) de ketamina (5-15 mg/kg)/dexdormitor (0,02-0,1 mg/kg) (y midazolam a 0,25 mg/kg como relajante muscular), y confirmar la anestesia adecuada en función de la frecuencia cardíaca, la respiración y el reflejo de pellizco de los dedos de los pies. Intubar a los animales para la administración continua de isoflurano (0,5%-2% en oxígeno al 100%) durante toda la cirugía mientras se controlan sus signos vitales. Use ungüento veterinario en los ojos durante la cirugía para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
3. Después de que los cirujanos se hayan puesto el EPP estéril, prepare un campo quirúrgico estéril utilizando paños estériles para cubrir las superficies y el campo operatorio. Utilizando técnicas asépticas, los cirujanos implantan una tapa acrílica con postes y tornillos de titanio para estabilizar la cabeza utilizando métodos descritos en detalle anteriormente por Nummela et ^al.11.
4. Durante la cirugía de implante, planifique la colocación de la cámara de registro sobre las áreas de interés (p. ej., áreas visuales, área temporal media [MT] y corteza visual primaria [V1]) en función de las coordenadas estereotáxicas¹².
5. Coloque un cable de conexión a tierra.
   1. Comience perforando un orificio de 1,1 mm en el cráneo cerca del área de la cámara de grabación planificada. Dobla un alambre de acero inoxidable de 36 G a unos 0,075-1 mm de la punta y desliza la parte doblada del alambre entre el cráneo y la duramadre en el fondo del orificio de la fresa.
   2. Inicialmente selle el alambre y el orificio con cera para huesos y luego con cemento y acrílico al colocar las cámaras. Asegúrese de dejar una parte afuera cerca de la cámara para conectarla a tierra.
6. Después de colocar una capa base de cemento adhesivo rápido para cubrir toda el área del sitio de grabación y el cable de conexión a tierra, adhiera las cámaras de grabación (que consisten en piezas personalizadas impresas en 3D) al cráneo usando el cemento adhesivo rápido y refuerce con acrílico al construir el implante de la cabeza.
7. Selle las cámaras con una tapa de cámara impresa en 3D que esté diseñada para encajar firmemente dentro de la cámara (y no pueda ser quitada por compañeros de jaula alojados en pareja con el sujeto).
   1. Dispense una pequeña cantidad de elastómero de silicona (silástico) alrededor de los bordes internos de la cámara utilizando las puntas mezcladoras incluidas y luego inserte la tapa de la cámara hasta que quede al ras con las paredes exteriores de la cámara.
   2. Las cámaras están diseñadas con orificios de acceso (1 mm de diámetro) a cada lado de la cámara para garantizar que la tapa de la cámara se pueda quitar fácilmente. Use silastic para sellar estos orificios de acceso, lo que da como resultado un sello hermético de la cámara.
      NOTA: Para quitar las tapas de la cámara, use pinzas para quitar el sellado silástico de los orificios de acceso primero para romper el sello hermético de la cámara. Luego, se puede usar un pasador para sacar la tapa de la cámara de la cámara.
8. Recupere a los animales de la anestesia y no los deje desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Tratar a los animales postquirúrgicamente con antibióticos (amoxicilina-ácido clavulánico a 13,75 mg/kg) durante 7 días y antiinflamatorios (meloxicam a 0,1 mg/kg) durante 3 días. Administre analgésicos de liberación lenta antes de la recuperación para que duren 72 h después de la operación, y aloje a los animales de forma independiente hasta la recuperación completa.
9. Dos o tres semanas después de la cirugía, comience a entrenar el reposacabezas y el comportamiento visual. Coloque el tití en una silla para primates y permita que se aclimate al reposacabezas. Una vez que se sienta cómodo, entrene al tití para que realice varias tareas básicas, incluida la fijación visual central¹³ y una tarea sacádica hacia una rejilla Gabor detectada periféricamente, que se utiliza para medir su agudeza visual¹¹.
10. Después de un entrenamiento conductual suficiente, realice una craneotomía dentro de la cámara de registro. Bajo técnicas estériles, realizar una segunda cirugía para crear una craneotomía (2-3 mm de diámetro) en la cámara de registro sobre el área de interés (p. ej., área MT). Sellar la craneotomía con una aplicación gruesa de silástico de aproximadamente 1 mm o la profundidad de la craneotomía para proteger el cerebro de infecciones y reducir el crecimiento de la granulación¹⁴. Asegúrese de que el sello de silicona tenga bordes que se adhieran al menos a 2 mm o más del cemento dental en todos los lados. Vuelva a colocar la tapa de la cámara como se describe en el paso 7.
11. Si se produce algún sangrado o el sello de silástica pierde líquidos claros en los días posteriores a la cirugía, será necesario limpiar la cámara.
    1. Si el sello de silástico está intacto, use técnicas estériles para limpiar con betadine al 10% y lávese con solución salina estéril antes de quitar el sello. Si el sello silástico no está intacto, solo límpielo con solución salina estéril bajo técnicas estériles.
    2. Una vez que se retira el silástico, enjuague la duramadre con solución salina estéril varias veces y séquela con un aplicador de punta de algodón. Seque bien la cámara con un aplicador de punta de algodón antes de aplicar una nueva capa de silastic. Por lo general, la cámara se estabiliza y permanece seca con un sello hermético después de unos días a 1 semana.
12. Una vez que la craneotomía se haya estabilizado y no muestre signos de sangrado, realice un raspado dural para eliminar el exceso de tejido sobre la duramadre. Luego, aplique una capa delgada (<1 mm) de silástico (lo suficientemente delgado como para permitir el paso de los electrodos para los registros) y use una broca de 1/4 de fresa para absorber el silástico sobre las paredes de la craneotomía, como se muestra en la Figura 3C, para la compra mecánica.
    NOTA: Esto también permitirá una extracción más fácil para fines de limpieza. El silástico puede permanecer en su lugar durante la duración del estudio y se puede perforar con electrodos de matriz lineal para su registro.

4. Configuración del registro de neurofisiología (Figura 3D-F)

NOTA: Los pasos de manejo de animales variarán según el laboratorio y el experimento. Los siguientes pasos son específicos para la colocación del microdisco y la penetración de la duramadre para las grabaciones.

1. Retire la tapa de la cámara de grabación (descrita en la sección 3, paso 7.2). Coloque la tapa en alcohol isopropílico al 91% para remojarla durante la grabación. Asegúrese de que los bordes de la cámara estén libres de silastic. Si se deja silástica en los bordes de la cámara, el microaccionamiento no se asentará correctamente.
2. La base del microaccionamiento tiene tres tornillos para apretarla a la cámara del animal. Normalmente, esos tornillos se aprietan en su lugar alrededor de una funda protectora que es del mismo tamaño que la cámara para mantener la sonda de silicona en el interior protegida de los golpes.
   1. Primero, use el destornillador para aflojar los tres tornillos que sujetan el manguito protector sobre la sonda de silicona y retire con cuidado el manguito. Conecte el microaccionamiento a la cámara de registro, teniendo cuidado de no golpear los electrodos de silicona en las paredes de la cámara (Figura 3D, E).
   2. Además, asegúrese de que los electrodos estén en una posición completamente retraída antes de colocar la unidad en la cámara, de modo que se asienten muy por encima de la corteza en la colocación inicial.
3. Una vez colocado, use el destornillador para apretar cada tornillo en el costado del microaccionamiento (Figura 3F). Elija un orden para apretar los tornillos y utilícelo cada vez para mantener la estabilidad en la ubicación. Es posible que los investigadores también quieran contar el número de vueltas al aflojar inicialmente los tornillos para apretarlos en una cantidad similar. Compruebe si la sonda está suelta y apriétela según sea necesario, pero tenga cuidado de no pelar las roscas de los tornillos en el plástico apretando demasiado.
4. Una vez que el microaccionamiento esté asegurado a la cámara, coloque todos los cables de conexión a tierra necesarios.
   NOTA: Deje la platina de la cabeza insertada en el conector durante la noche e inserte el cable de la interfaz periférica serie (SPI) en la platina de la cabeza para las grabaciones, ya que es difícil insertar la platina de la cabeza en el conector mientras está en el animal.
5. Enchufe con cuidado el cable SPI en la platina del cabezal (ya conectada a la sonda). Asegúrese de no doblar el cable. Amplifique y digitalice todos los datos neurofisiológicos de la etapa de la cabeza a 30 kHz utilizando la interfaz gráfica de usuario Open-Ephys (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). Filtre la señal de banda ancha de paso alto desde la etapa principal a 0,1 Hz. Corrija los cambios de fase de este filtrado, como se describió anteriormente¹⁵. En el caso de las matrices lineales, preprocese los seguimientos resultantes mediante la referencia de promedio común.
6. Introduzca el mapa de canales para la guía de electrodos concreta que se utiliza en el sistema de grabación, de modo que los canales trazados durante la grabación se ordenen por profundidad en la vista de señal de grabación con filtro de paso alto. Esta vista se utilizará al avanzar y retraer el electrodo.

5. Realización del experimento de registro neurofisiológico (Figura 4)

NOTA: Aquí, se describe el método para bajar las guías de electrodos en la corteza; Este método se ha optimizado para evitar la formación excesiva de hoyuelos en el tejido subyacente. Un aumento del ruido en los registros electrofisiológicos proporciona una buena indicación de hoyuelos antes de penetrar en el silástico y entrar en el cerebro. Una vez en el cerebro, si hay demasiados hoyuelos, el investigador puede notar que las unidades se desplazan en la sonda incluso sin la manipulación de la unidad (unidades que se mueven gradualmente a través de los canales en profundidad), o alternativamente, el investigador puede notar la supresión de la actividad neuronal, particularmente en los sitios superficiales de la sonda. En esas condiciones, la unidad se retrae para aliviar los hoyuelos y facilitar mejores grabaciones.

1. Usando el control de tornillo en el microaccionamiento, baje la sonda de silicio, haciendo una vuelta (250 μm) cada 1-2 s hasta que se observen unidades en la punta de la matriz.
   NOTA: Se puede observar un pequeño aumento del ruido durante la penetración del silástico colocado sobre la duramadre. Los vástagos harán hoyuelos en el silástico antes de salir, lo que puede aumentar el ruido en la sonda. Un descenso rápido hasta la primera señal de unidades ayuda a la penetración de la capa silástica.
2. Una vez que se observan las primeras neuronas, retraiga una vuelta del micromotor (250 μm) para reducir la velocidad de entrada a medida que el electrodo comienza a atravesar el silástico y la duramadre en el tejido cortical. Si el electrodo parece continuar avanzando hacia el tejido con el tiempo sin micromanipulación, retraiga un giro adicional para aliviar la presión de la sonda que empuja el silástico y el tejido debajo de él.
   NOTA: Debería ser posible rastrear la ubicación de las neuronas si se ha cargado el mapa de canales correcto para la matriz lineal (los canales aparecerán ordenados por su profundidad en relación con la corteza).
3. Continúe conduciendo la matriz hacia la corteza muy lentamente, avanzando aproximadamente de cuatro a seis vueltas (1-1,5 mm) durante un período de 20-30 minutos hasta que las neuronas se distribuyan uniformemente a lo largo de la sonda.
4. Retraiga lentamente la matriz una o dos vueltas (0,25-0,5 mm) para reducir la presión sobre el tejido antes de comenzar las grabaciones.
   NOTA: Las neuronas no suelen cambiar la ubicación del canal en la matriz lineal durante esta retracción, lo que sugiere que actúa principalmente para reducir la presión sobre el tejido. Sin retracción, se puede observar un cambio continuo de la matriz durante el registro a medida que el tejido se relaja, lo que altera la estabilidad del registro (Figura 4C).
5. Después de retractarse, espere 20 minutos antes de comenzar las grabaciones. Esto limitará la cantidad de movimiento que se ve en la grabación. Utilice este tiempo para prepararse para la grabación (es decir, calibrar el seguimiento ocular y preparar los sistemas de presentación de estímulos).
6. Seleccione Grabar en el software de grabación.
7. Una vez finalizado el experimento, vuelva a seleccionar el botón de grabación. Esto creará el archivo de grabación completo en el destino seleccionado. Asegúrese de que el archivo se haya guardado correctamente antes de continuar.
8. Comience lentamente a retraer la matriz fuera de la corteza a una velocidad similar a la anterior (de cuatro a seis vueltas en una duración de 20 a 30 minutos). Visualice la retracción de la sonda observando cómo las neuronas se desplazan a lo largo de la sonda. Después de retraerse por el número de vueltas desde que vio las neuronas por primera vez y cuando no se observan más neuronas en la sonda, continúe retrayéndose más rápidamente hasta volver a la posición inicial completamente retraída.
9. Para retirar la sonda de la cámara de registro, realice los pasos 1 a 3 de la sección 4 en orden inverso (es decir, realice primero el paso 3, seguido del paso 2 y, a continuación, el paso 1).
10. Una vez que se haya retirado la sonda de la cámara de registro, sumérjala en solución para lentes de contacto durante 20 minutos para eliminar cualquier tejido o sangre del electrodo. Después, coloque la sonda en alcohol durante 1 minuto para retirar la solución para lentes de contacto y deje que el electrodo se seque.
11. Utilice Kilosort2 para ordenar los datos de la matriz después del filtrado inicial del sistema de grabación (como se describió anteriormente en la sección 4, paso 5).
    1. Etiquete manualmente las salidas de los algoritmos de clasificación de picos utilizando la GUI "phy" (https://github/kwikteam/phy). Clasifique las unidades con formas de onda diminutas o fisiológicamente inverosímiles como ruido y exclúyalas.
    2. Si utiliza sondas laminares, vea las formas de onda de pico en cada canal para asegurarse de que las unidades individuales estén etiquetadas en el canal con la forma de onda de pico (Figura 5A). Incluya únicamente las unidades que tengan clústeres claros en el espacio PCA, menos del 1 % de violaciones del intervalo entre picos y formas de onda de picos bifásicas (que deben localizarse en canales adyacentes en la matriz lineal). En la Figura 5B se muestra un ejemplo de una sola unidad, que muestra clústeres claros en el espacio PCA (arriba a la derecha) y estabilidad a lo largo del tiempo (abajo a la derecha).

Resultados

Este protocolo describe cómo construir una etapa de electrodo X-Y (Figura 1) que permite la focalización submilimétrica de los sitios y mantiene un posicionamiento confiable en sesiones de grabación separadas. La fiabilidad del posicionamiento X-Y se ilustra en la Figura 6, que demuestra que dos sesiones de grabación realizadas con una semana de diferencia mostraron una superposición del 70,8% en sus ubicaciones medias de RF (Figura 6A...

Discusión

Actualmente se dispone de varios métodos (por ejemplo, crónicos, semicrónicos, agudos) para realizar experimentos de neurofisiología en primates no humanos. El tití común plantea desafíos únicos para los experimentos de neurofisiología debido a su pequeño tamaño y a la falta de circunvoluciones como puntos de referencia anatómicos. Esto requiere que los investigadores utilicen puntos de referencia neurofisiológicos, como la retinotopía y las propiedades de ajuste de las áreas de interés, para identificar ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachment for dremel	Dremel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedance Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instruments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html