Электрофизиология активности ламинарной коры у обыкновенной мартышки

Резюме

Специально разработанные микроприводы позволяют субмиллиметровое нацеливание на кортикальные участки регистрации с помощью линейных кремниевых матриц.

Аннотация

Мартышка представляет собой идеальную модель для исследования ламинарных корковых цепей благодаря своей гладкой корковой поверхности, что облегчает записи с помощью линейных массивов. Популярность мартышки в последнее время возросла из-за схожей с другими приматами нейронно-функциональной организации и технических преимуществ для записи и визуализации. Тем не менее, нейрофизиология в этой модели создает некоторые уникальные проблемы из-за небольшого размера и отсутствия извилин в качестве анатомических ориентиров. Используя специально разработанные микроприводы, исследователи могут манипулировать размещением линейных решеток с субмиллиметровой точностью и надежно записывать данные в одном и том же ретинотопическом целевом месте в течение нескольких дней записи. В данном протоколе описывается пошаговое построение системы позиционирования микропривода и методика нейрофизиологической регистрации с помощью кремниевых линейных электродных решеток. Благодаря точному контролю расположения электродов во время сеансов записи, исследователи могут легко перемещаться по коре головного мозга, чтобы определить интересующие области на основе их ретинотопической организации и настроечных свойств записанных нейронов. Кроме того, с помощью этой системы ламинарных электродов можно применить анализ плотности источника тока (CSD) для определения глубины записи отдельных нейронов. Этот протокол также демонстрирует примеры ламинарных записей, в том числе спайковые волны, изолированные в Kilosort, которые охватывают несколько каналов на массивах.

Введение

Обыкновенная мартышка (Callithrix jacchus) в последние годы быстро завоевала популярность в качестве модели для изучения функций мозга. Эта растущая популярность обусловлена доступностью гладкой коры головного мозга мартышки, сходством в нейронной функциональной организации с людьми и другими приматами, а также небольшим размером и^{быстрой скоростью} размножения. По мере того, как популярность этого модельного организма росла, происходило быстрое развитие нейрофизиологических методов, пригодных для использования в мозге мартышки. Методы электрофизиологии широко используются в неврологии для изучения активности отдельных нейронов в коре головного мозга как грызунов, так и приматов, что приводит к беспрецедентному временному разрешению и доступу к местоположению. Из-за относительной новизны мартышки как модели визуальной нейробиологии, оптимизация методов электрофизиологии, ведущей себя в бодрствующем состоянии, все еще развивается. Предыдущие исследования показали создание надежных протоколов электрофизиологии в анестезируемых препаратах², а ранние исследования нейрофизиологии, ведущие себя в состоянии бодрствования, показали надежность одноканальных вольфрамовых электрод³. В последние годы исследователи установили использование кремниевых микроэлектродных решеток для нейрофизиологии поведения в бодрствующем^{состоянии.} Тем не менее, мартышка представляет собой уникальную проблему нацеливания из-за своего маленького размера мозга и отсутствия анатомических ориентиров. В этом протоколе описывается, как сконструировать и использовать микродисковую систему записи, подходящую для мартышки, которая позволяет записывать большие популяции нейронов с помощью кремниевых линейных массивов, производя при этом минимальное повреждение тканей.

Работа с мартышками представляет собой сложную задачу из-за меньшего масштаба ретинотопических карт в зрительной коре по сравнению с более крупными приматами. Небольшое смещение электродов всего на 1 мм может привести к значительным изменениям в картах. Более того, исследователям часто приходится изменять расположение электродов между сеансами записи, чтобы получить более широкий диапазон ретинотопических позиций в зрительной коре. Современные полухронические препараты не позволяют регулировать положение электродов ежедневно или с достаточной точностью для нацеливания на определенные участки в субмиллиметровых масштабах⁵. Имея это в виду, предлагаемая система микроприводов использует электродный каскад X-Y, который крепит легкий микропривод к записывающей камере и позволяет осуществлять субмиллиметровое нацеливание на участки коры головного мозга. Подвижные компоненты X-Y каскада позволяют осуществлять вертикальное и горизонтальное перемещение линейной решетки для систематического перемещения по корковым областям, что необходимо для идентификации интересующих областей (с помощью ретинотопии и настроек). Во время сеансов записи исследователи также могут вручную настроить стадию X-Y, чтобы сместить целевые участки в пределах области. Это ключевое преимущество по сравнению с альтернативными методами, использующими полухронические препараты для записи, которые не имеют простых механизмов наведения электродов.

Микропривод является универсальным инструментом, который позволяет монтировать различные кремниевые матрицы для опускания в кору головного мозга. В этом протоколе специальный зонд с двумя 32-канальными линейными решетками, расположенными на расстоянии 200 мкм друг от друга, использовался для исследования ламинарных цепей, охватывающих кортикальную глубину. Большинство методов зондирования нейронных цепей, как правило, отбирают электрические потенциалы или единичные единицы, усредненные по всем слоям коры головного мозга. Тем не менее, недавние исследования выявили интригующие результаты о кортикальных ламинарных микросхемах⁶. Используя микропривод, исследователи могут использовать ламинарные зонды и точно регулировать глубину записи, чтобы обеспечить всестороннюю выборку по всем слоям.

Эта система может быть построена из коммерчески доступных компонентов и легко модифицируется для различных экспериментальных методов или зондов. Ключевыми преимуществами этого препарата являются возможность изменять положение записи X-Y с субмиллиметровой точностью и контролировать глубину записи в коре головного мозга. В этом протоколе представлена пошаговая инструкция по построению микропривода стадии X-Y и техник нейрофизиологической записи.

протокол

Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Протоколы экспериментальных и поведенческих процедур были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при Университете Рочестера.

1. Конструкция микропривода, содержащего электрод для записи (рис. 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленные по индивидуальному заказу каскады X-Y, содержащие многоканальные линейные кремниевые матрицы, позволяют осуществлять субмиллиметровое наведение на места записи.

1. Соберите все детали микропривода, показанные на рисунке 1. Используйте прозрачный акрилонитрил-бутадиен-стирольный (АБС) пластик для 3D-печати нестандартных деталей. К ним относятся защитная втулка, основание, ступень X и ступень Y. Проекты 3D-деталей доступны в Интернете (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). Дополнительно соберите электрод, пластиковую прямоугольную платформу, решетку, микроманипулятор, стальную трубку и шесть винтов из нержавеющей стали (размер винта: 00).
   1. С помощью ротационного инструмента с алмазным кругом вырежьте отрезок пластиковой сетки размером 4 мм x 3 мм x 3 мм с расстоянием между отверстиями 1 мм x 1 мм.
   2. Используйте эпоксидную смолу, чтобы прикрепить небольшую секцию сетки с вырезом к верхней части Y-образного столика. Затем наденьте микропривод на эту решетку с помощью винта. Добавьте эпоксидную смолу в основание для устойчивости.
   3. Прикрепите маленькую прямоугольную платформу, напечатанную на 3D-принтере, к стальной трубке 28 G с эпоксидной смолой. Это будет использоваться в будущих шагах для удержания кремниевого электрода.
   4. Проденьте направляющую трубку 23 G через сетку. Затем проденьте стальную трубку, прикрепленную к пластиковой платформе, через направляющую трубку 23 G. Вставьте стальную трубку 28 G в один из слотов микропривода.
   5. Затем соберите 3D-детали (основание, X-образная ступень, Y-образная ступень) с помощью винтов с шестигранной головкой из нержавеющей стали (размер: 00, длина: 1/8 дюйма), чтобы создать основание для привода.
      1. Во-первых, используйте ручной инструмент для нарезания резьбы, чтобы нарезать предварительно сделанные отверстия для винтов как в основании, так и в X-образной ступени. Затем начните с того, что вставьте четыре винта в длинные пазы в ступени X и закрепите их в соответствующих отверстиях для винтов, предварительно сделанных в основании.
      2. После того, как подвижная ступень X будет закреплена на основании, вставьте два винта через длинный паз в ступени Y и закрепите их в предварительно сделанных отверстиях для винтов в ступени X.
         ПРИМЕЧАНИЕ: И X, и Y должны оставаться подвижными до тех пор, пока винты не будут полностью затянуты.
2. Убедитесь, что привод микроманипулятора оснащен пластиковой платформой для крепления разъема электрода, а также удлиненной полиимидной трубкой для удержания электрода. Прикрепите 64-контактный разъем к платформе на микроманипуляторе с помощью скотча.
3. Осторожно нанесите каплю бацитрацина (стерильной мази) на пластиковую трубку микроманипулятора и прикрепите электрод, подключенный к 64-контактному разъему, с помощью гибкого шлейфа.
4. Используйте привод микроманипулятора, чтобы удерживать кремниевый электрод и его разъем, продевая пластиковую трубку в отверстие в Y-образном каскаде. Электрод будет висеть под столиком зонда, ожидая, когда его прикрепят к пластиковой прямоугольной платформе (шаг 7, раздел 1).
5. Отсоедините 64-контактный разъем от привода микроманипулятора и с помощью клеевого геля закрепите разъем на платформе на X-сцене. Дополнительная эпоксидная смола может быть добавлена для укрепления соединения соединителя после того, как клей удерживает его на месте. Оставьте на ночь для высыхания.
6. Аккуратно отсоедините электрод от пластиковой трубки, и снимите привод микроманипулятора с узла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе привод удерживается только зажимом типа «Руки помощи», и электрод не закреплен в конструкции привода.
7. Осторожно переместите зажим типа «крокодил», чтобы перевернуть привод и увидеть незакрепленный электрод. С помощью щипцов с тупым наконечником поместите электрод на пластиковый держатель ниже Y-образной ступени и закрепите его небольшим количеством силиконового эластомера (силастика). Подождите 5 минут, пока клей не затвердеет.
8. Используйте винтовой регулятор на микроприводе, чтобы втянуть электрод.
9. Наденьте защитную гильзу на электрод микропривода. Этот защитный чехол имеет тот же размер, что и записывающие камеры, изготовленные по индивидуальному заказу, и надежно прилегает к основанию привода в сборе.
10. С помощью плоской отвертки затяните три боковых винта на базовом компоненте микропривода, чтобы закрепить защитную втулку на месте. Подключите головной каскад, используемый для записи, к 64-контактному разъему.

2. Политодное покрытие электродов для снижения общего импеданса (рис. 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для наилучшего качества записи полезно покрыть кремниевые электродные решетки раствором поли(3,4-этилендиокситиофена) (PEDOT). Показано, что этот метод увеличивает отношение сигнал/шум ^7,8.

1. Для приготовления раствора PEDOT смешайте 0,075 мл 3,4-этилендиокситиофена (EDOT) и 1,4 г поли(4-стиролсульфоната натрия) (PSS) в 70 мл дистиллированной воды. Встряхните этот раствор кратковременно, чтобы обеспечить полное растворение компонентов. Перемешайте этот раствор за сутки до использования для лучшего растворения.
2. После запуска программного обеспечения для измерения импеданса (см. Таблицу материалов) подготовьте настройки с выбранной подготовкой электрода. Используя верхнее раскрывающееся меню в левом верхнем углу окна программного обеспечения, выберите используемый адаптер (N2T A32). Во втором раскрывающемся меню выберите используемый электрод (NLX-EIB-36). Если электрод не указан в раскрывающемся меню, обратитесь к руководству, чтобы узнать, как определить новый электрод. Убедитесь, что количество каналов правильное.
3. Подключите зонд к системе измерения импеданса через разъем и опустите зонд в заземленный физиологический раствор, чтобы получить базовые показания.
   1. В системе измерения импеданса нажмите кнопку Test Impedance (Проверить импедансы ) с левой стороны и убедитесь в правильности настроек (Настройки: Частота тестирования: 1,004 Гц, Циклы: 100, Пауза: 0). Затем нажмите кнопку «Тестовый щуп » в правом нижнем углу.
   2. Во время работы тестера импеданса будет появляться окно отчета о зонде, в котором результаты будут сохранены в электронной таблице. Сохраните эти результаты для дальнейшего использования для обоих хвостовиков электрода (установка электрода в стакан для использования с тестером импеданса изображена на рисунке 2D). При использовании датчика с несколькими хвостовиками убедитесь, что шаг 3 повторяется для каждого хвостовика.
4. Извлеките зонд из солевого раствора, опустив подставку (например, лабораторный домкрат), удерживающую стакан. Замените жидкость стакана дистиллированной водой. Поднимите лабораторный разъем, чтобы погрузить электрод, смойте оставшийся физиологический раствор, а затем снова опустите лабораторный разъем.
5. Замените дистиллированную воду в стакане раствором PEDOT и поднимайте лабораторный разъем до тех пор, пока электрод не погрузится в раствор.
6. Нажмите кнопку DC Electroplate в левой части окна программного обеспечения и убедитесь, что используются правильные настройки (Настройки: Autoplate: 0,004 мкА, 350 Гц, Длительность: 5, Пауза: 1). Затем нажмите кнопку Autoplate в правом нижнем углу. В очередной раз появится окно отчета зонда с результатами гальванического покрытия. Сохраните эти результаты для использования в будущем. При использовании датчика с несколькими хвостовиками убедитесь, что этот шаг повторяется для каждого хвостовика.
7. Извлеките зонд из раствора PEDOT, опустив лабораторный домкрат, и промойте зонд дистиллированной водой, как было выполнено ранее (шаг 4). После промывки наполните стакан солевым раствором и поднимайте лабораторный разъем до тех пор, пока электрод не погрузится в воду.
8. Нажмите кнопку Test Impedances (Тестовый импеданс) в левой части окна программного обеспечения и убедитесь, что используются правильные настройки (Настройки: Частота тестирования: 1 004 Гц, Циклы: 100, Пауза: 0). Нажмите кнопку Test Probe в правом нижнем углу. Сохраните эти результаты для использования в будущем. При использовании датчика с несколькими хвостовиками убедитесь, что этот шаг повторяется для каждого хвостовика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните значения после гальванического покрытия со значениями до гальванического покрытия. Должно произойти уменьшение значений импеданса.
9. При постоянном использовании датчики могут показывать увеличение значений импеданса через 6 месяцев. Если есть сомнения по поводу значений импеданса регистрируемого сигнала, повторно проверьте импедансы пробника после шага 3. Если значения импеданса увеличились по сравнению с начальными значениями, повторите гальваническое покрытие (шаг 6).

3. Хирургическое размещение головного колпачка, камер и трепанация черепа (рис. 3A-C)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе по окончании исследования животное было обезболено изофлураном и получало внутримышечные (в/м) инъекции кетамина с последующей внутрибрюшинной (ВП) инъекцией эвазола. Мозг извлекали после транскардиальной перфузии физиологическим раствором с последующим введением 10% формалина.

1. Приучите мартышек (не менее 1,5 лет) сидеть в маленьком кресле приматов по ранее описанным методам^за 3,9,10,11 за 2 месяца до операции.
2. В день операции индуцируйте пациентов внутримышечной (внутримышечной) инъекцией кетамина (5-15 мг/кг)/дексдормитора (0,02-0,1 мг/кг) (и мидазолама в дозе 0,25 мг/кг в качестве миорелаксанта) и подтвердите надлежащую анестезию на основе частоты сердечных сокращений, дыхания и рефлекса защемления пальцев ног. Интубируйте животных для непрерывного введения изофлурана (0,5%-2% в 100% кислороде) во время операции с одновременным мониторингом их жизненно важных функций. Наносите ветеринарную мазь на глаза во время операции, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
3. После того, как хирурги наденут стерильные СИЗ, подготовьте стерильное операционное поле, используя стерильные простыни, чтобы покрыть поверхности и операционное поле. Используя асептические методы, хирурги должны имплантировать акриловый колпачок с титановыми штифтами и винтами для стабилизации головы с помощью методов, подробно описанных ранее Nummela et ^al.11.
4. Во время операции по имплантации спланируйте расположение регистрирующих камер над интересующими областями (например, зрительными областями, средней височной областью [MT] и первичной зрительной корой [V1]) на основе стереотаксических координат¹².
5. Проложите провод заземления.
   1. Начните с того, что просверлите отверстие для заусенцев диаметром 1,1 мм в черепе рядом с областью планируемой записывающей камеры. Согните проволоку из нержавеющей стали 36 G на расстоянии примерно 0,075-1 мм от кончика и проденьте изогнутую часть проволоки между черепом и твердой мозговой оболочкой в нижней части отверстия для заусенцев.
   2. Первоначально заклейте проволоку и отверстие костным воском, а затем цементом и акрилом при размещении камер. Убедитесь, что вы оставили часть снаружи рядом с камерой для присоединения для заземления.
6. После нанесения базового слоя быстроклеящегося цемента, чтобы покрыть всю площадь места записи и заземляющего провода, приклейте записывающие камеры (состоящие из нестандартных деталей, напечатанных на 3D-принтере) к черепу с помощью быстроклеящегося цемента и укрепите акрилом при создании головного имплантата.
7. Запечатайте камеры с помощью напечатанной на 3D-принтере крышки камеры, которая плотно прилегает к камере (и не может быть снята соседями по клетке, находящимися в паре с объектом).
   1. Нанесите небольшое количество силиконового эластомера (силастика) по внутренним краям камеры с помощью прилагаемых наконечников для смешивания, а затем вставьте крышку камеры до тех пор, пока она не вровень с внешними стенками камеры.
   2. Камеры имеют отверстия для доступа (диаметром 1 мм) с обеих сторон камеры, чтобы обеспечить легкое снятие крышки камеры. Используйте силастик для герметизации этих отверстий доступа, в результате чего получается герметичное уплотнение камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы снять крышки камеры, сначала используйте пинцет, чтобы удалить силастик, уплотняющий отверстия для доступа, чтобы нарушить герметичное уплотнение камеры. Затем с помощью штифта можно вытащить крышку камеры из патронника.
8. Выводите животных из наркоза и не оставляйте их без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания положения на грудине. Послеоперационное лечение животных антибиотиками (амоксициллин-клавулановая кислота в дозе 13,75 мг/кг) в течение 7 дней и противовоспалительными средствами (мелоксикам в дозе 0,1 мг/кг) в течение 3 дней. Дайте обезболивающее лекарство с медленным высвобождением до выздоровления, чтобы оно длилось 72 часа после операции, и содержате животных самостоятельно до полного выздоровления.
9. Через две-три недели после операции начинайте тренировать фиксацию головы и визуальное поведение. Поместите мартышку в кресло примата и дайте ей привыкнуть к подголовнику. Освоившись, приучите мартышку выполнять несколько основных задач, включая центральную зрительную фиксацию¹³ и саккаду в сторону периферически обнаруженной решетки Габора, которая используется для измерения остроты зрения¹¹.
10. После достаточной поведенческой подготовки выполните трепанацию черепа в записывающей камере. При стерильных методах проводят повторную операцию по созданию трепанации черепа (2-3 мм в диаметре) в регистрирующей камере над интересующей областью (например, областью МТ). Загерметизируйте череп толстым слоем силастика около 1 мм или глубиной краниотомии, чтобы защитить мозг от инфекции и уменьшить рост грануляций¹⁴. Убедитесь, что края силастической пломби захватывают не менее 2 мм или более стоматологического цемента со всех сторон. Установите на место крышку камеры, как описано в шаге 7.
11. Если в течение нескольких дней после операции произойдет какое-либо кровотечение или из силастического уплотнения вытечет прозрачная жидкость, камеру необходимо будет очистить.
    1. Если силастическое уплотнение не повреждено, используйте стерильные методы для очистки 10% бетадином и промойте стерильным физиологическим раствором перед снятием пломбы. Если силастическое уплотнение не повреждено, очистите его стерильным физиологическим раствором только стерильными методами.
    2. После удаления силастика промойте твердую мозговую оболочку стерильным физиологическим раствором несколько раз и высушите аппликатором с ватным наконечником. Далее тщательно высушите камеру с помощью аппликатора с ватным наконечником перед нанесением нового слоя силастика. Как правило, камера стабилизируется и остается сухой с плотным уплотнением от нескольких дней до 1 недели.
12. Как только трепанация черепа стабилизируется и признаки кровотечения исчезнет, выполните соскоб твердой мозговой оболочки, чтобы удалить лишнюю ткань над твердой мозговой оболочкой. Затем нанесите тонкий слой (<1 мм) силастика (достаточно тонкий, чтобы обеспечить прохождение электродов для записи) и используйте сверло с жерновами 1/4, чтобы впитать силастик вверх по стенкам трепанации черепа, как показано на рисунке 3C, для механической покупки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также облегчит снятие для очистки. Силастик может оставаться на месте в течение всего исследования и может быть проколот линейными матричными электродами для регистрации.

4. Настройка нейрофизиологической записи (рис. 3D-F)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы обращения с животными будут варьироваться в зависимости от лаборатории и эксперимента. Следующие шаги относятся к размещению микропривода и проникновению твердой мозговой оболочки для записи.

1. Снимите колпачок с записывающей камеры (описано в разделе 3, шаг 7.2). Поместите колпачок в 91% изопропиловый спирт, чтобы он впитался во время записи. Убедитесь, что края камеры очищены от силастика. Если на краях камеры оставить силастик, микропривод будет сидеть неправильно.
2. Основание микропривода имеет три винта для его крепления к камере на животном. Обычно эти винты затягиваются вокруг защитной втулки того же размера, что и камера, чтобы защитить кремниевый зонд внутри от удара.
   1. Сначала с помощью отвертки ослабьте три винта, удерживающие защитную втулку над кремниевым щупом, и осторожно снимите втулку. Прикрепите микропривод к записывающей камере, стараясь не ударять кремниевые электроды о стенки камеры (рис. 3D, E).
   2. Кроме того, перед размещением привода в камере убедитесь, что электроды находятся в полностью втянутом положении, чтобы они находились значительно выше коры головного мозга при первоначальном размещении.
3. После установки используйте отвертку, чтобы затянуть каждый винт сбоку микропривода (Рисунок 3F). Выберите порядок закручивания винтов и используйте его каждый раз, чтобы поддерживать стабильность в локации. Исследователи также могут захотеть подсчитать количество оборотов при первоначальном ослаблении винтов, чтобы затянуть их на аналогичную величину. Проверьте, не ослаблен ли щуп, и затяните его по мере необходимости, но будьте осторожны, чтобы не сорвать резьбу винтов в пластике из-за чрезмерной затяжки.
4. После того, как микропривод будет закреплен в камере, проложите все необходимые провода заземления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте головной столик вставленным в разъем на ночь и вставляйте кабель последовательного периферийного интерфейса (SPI) в головной столик только для записи, потому что трудно вставить головной столик в разъем, пока он находится на животном.
5. Осторожно подключите кабель SPI к головному столику (уже подключенному к пробнику). Следите за тем, чтобы проволока не перегибалась. Усиливайте и оцифровывайте все нейрофизиологические данные головного столика на частоте 30 кГц с помощью графического интерфейса Open-Ephys GUI (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). Фильтр высоких частот широкополосного сигнала от головного столика с частотой 0,1 Гц. Корректируют фазовые сдвиги от этой фильтрации, как описано ранее¹⁵. Для линейных массивов выполните предварительную обработку результирующих трассировок с помощью ссылок на общее среднее значение.
6. Введите карту каналов для конкретной электродной решетки, используемой в системе записи, чтобы каналы, построенные во время записи, были упорядочены по глубине в представлении сигнала записи с фильтрацией высоких частот. Этот вид будет использоваться при продвижении и втягивании электрода.

5. Проведение эксперимента по регистрации нейрофизиологии (рис. 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан метод опускания электродных решеток в кору головного мозга; Этот метод был оптимизирован для того, чтобы избежать чрезмерных ямочек на подлежащих тканях. Увеличение шума в электрофизиологических записях является хорошим признаком ямочек до проникновения в силастик и попадания в мозг. Оказавшись в мозге, если ямочек слишком много, исследователь может заметить смещение единиц на зонде даже без манипуляций с приводом (единицы, постепенно перемещающиеся по каналам в глубину), или, в качестве альтернативы, исследователь может заметить подавление нейронной активности, особенно в поверхностных участках зонда. В таких условиях дисковод втягивается, чтобы устранить ямочки и обеспечить более качественную запись.

1. С помощью винтового регулятора на микроприводе опустите кремниевый зонд, делая один оборот (250 мкм) каждые 1-2 с до тех пор, пока на кончике матрицы не появятся единицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может наблюдаться незначительное увеличение шума при проникновении силастика, размещенного над твердой мозговой оболочкой. Хвостовики будут вдавливать силастик перед тем, как проскочить, что может увеличить шум на зонде. Быстрый спуск до первых признаков юнитов способствует проникновению силастового слоя.
2. После того, как первые нейроны будут обнаружены, оттяните один оборот микропривода (250 мкм), чтобы уменьшить скорость входа, когда электрод начнет просачиваться через силастик и твердую мозговую оболочку в кортикальную ткань. Если кажется, что электрод продолжает продвигаться в ткань с течением времени без микроманипуляций, оттяните еще один оборот, чтобы ослабить давление от зонда, давящего на силастик и ткань под ним.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Должно быть возможно отследить расположение нейронов, если загружена правильная карта каналов для линейного массива (каналы будут упорядочены по их глубине относительно коры головного мозга).
3. Продолжайте вводить массив в кору головного мозга очень медленно, продвигаясь примерно на четыре-шесть оборотов (1-1,5 мм) в течение 20-30 минут, пока нейроны не будут равномерно распределены по всей длине зонда.
4. Медленно втяните решетку на один-два оборота (0,25-0,5 мм), чтобы уменьшить давление на ткани перед началом записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны, как правило, не смещают расположение канала на линейном массиве во время этой ретракции, что позволяет предположить, что он в первую очередь действует для уменьшения давления на ткани. Без втягивания во время записи можно наблюдать непрерывное смещение решетки, поскольку ткань расслабляется, тем самым нарушая стабильность записи (рис. 4C).
5. После втягивания подождите 20 минут, прежде чем начинать запись. Это ограничит количество движений, видимых в записи. Используйте это время для подготовки к записи (т.е. откалибруйте отслеживание движений глаз и подготовьте системы представления стимулов).
6. Выберите Запись в программном обеспечении для записи.
7. Когда эксперимент будет завершен, снова нажмите кнопку записи. При этом будет создан полный файл записи в выбранном месте назначения. Прежде чем продолжить, убедитесь, что файл сохранен правильно.
8. Медленно начинайте втягивать массив из коры головного мозга с той же скоростью, что и раньше (от четырех до шести оборотов в течение 20-30 минут). Визуализируйте втягивание зонда, наблюдая за перемещением нейронов вдоль зонда. После втягивания на несколько витков с момента первого обнаружения нейронов и когда на зонде больше нет нейронов, продолжайте втягиваться быстрее, пока не вернетесь в полностью втянутое исходное положение.
9. Чтобы извлечь зонд из записывающей камеры, выполните шаги 1-3 в секции 4 в обратном порядке (т.е. сначала выполните шаг 3, затем шаг 2, а затем шаг 1).
10. После извлечения зонда из записывающей камеры замочите его в растворе для контактных линз на 20 минут, чтобы удалить ткань или кровь с электрода. После этого поместите зонд в спирт на 1 минуту, чтобы удалить раствор для контактных линз, и дайте электроду высохнуть.
11. Используйте Kilosort2 для пиковой сортировки данных массива после первоначальной фильтрации из системы записи (как описано ранее в разделе 4, шаг 5).
    1. Вручную пометьте выходные данные алгоритмов сортировки спайков с помощью графического интерфейса "phy" (https://github/kwikteam/phy). Классифицируйте устройства с крошечными или физиологически неправдоподобными сигналами как шум и исключайте их.
    2. При использовании ламинарных пробников просмотрите пиковые осциллограммы по каждому каналу, чтобы убедиться, что отдельные единицы сигнала помечены на канале пиковым сигналом (рис. 5A). Включайте только те блоки, которые имеют четкие кластеры в пространстве PCA, менее 1% нарушений межпиковых интервалов и двухфазные пиковые сигналы (которые должны быть локализованы в соседних каналах линейного массива). На рисунке 5B показан пример одного блока, на котором показаны четкие кластеры в пространстве PCA (вверху справа) и стабильность с течением времени (внизу справа).

Результаты

В этом протоколе описывается, как построить электродный столик X-Y (рис. 1), который позволяет осуществлять субмиллиметровое наведение на участки и поддерживать надежное позиционирование в отдельных сеансах записи. Надежность позиционирования по осям X-Y проиллюстрирова...

Обсуждение

В настоящее время существует несколько методов (например, хронический, полухронический, острый) для проведения нейрофизиологических экспериментов на нечеловекообразных приматах. Обыкновенная мартышка представляет собой уникальную проблему для нейрофизиологических экспериментов и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachment for dremel	Dremel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedance Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instruments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html