Elettrofisiologia dell'attività corticale laminare nell'uistitì comune

Riepilogo

I microazionamenti personalizzati consentono il targeting sub-millimetrico dei siti di registrazione corticale con array lineari di silicio.

Abstract

La scimmia uistitì fornisce un modello ideale per l'esame dei circuiti corticali laminari grazie alla sua superficie corticale liscia, che facilita le registrazioni con array lineari. L'uistitì è recentemente cresciuto in popolarità grazie alla sua organizzazione funzionale neurale simile a quella di altri primati e ai suoi vantaggi tecnici per la registrazione e l'imaging. Tuttavia, la neurofisiologia in questo modello pone alcune sfide uniche a causa delle piccole dimensioni e della mancanza di circonvoluzioni come punti di riferimento anatomici. Utilizzando microazionamenti personalizzati, i ricercatori possono manipolare il posizionamento dell'array lineare con una precisione sub-millimetrica e registrare in modo affidabile nella stessa posizione retinotopicamente mirata per tutti i giorni di registrazione. Questo protocollo descrive la costruzione passo-passo del sistema di posizionamento del micro-drive e la tecnica di registrazione neurofisiologica con array di elettrodi lineari al silicio. Con un controllo preciso del posizionamento degli elettrodi durante le sessioni di registrazione, i ricercatori possono facilmente attraversare la corteccia per identificare le aree di interesse in base alla loro organizzazione retinotopica e alle proprietà di sintonizzazione dei neuroni registrati. Inoltre, utilizzando questo sistema di elettrodi a matrice laminare, è possibile applicare un'analisi della densità della sorgente di corrente (CSD) per determinare la profondità di registrazione dei singoli neuroni. Questo protocollo dimostra anche esempi di registrazioni laminari, tra cui forme d'onda spike isolate in Kilosort, che si estendono su più canali sugli array.

Introduzione

L'uistitì comune (Callithrix jacchus) è diventato rapidamente popolare come modello per studiare le funzioni cerebrali negli ultimi anni. Questa crescente popolarità è dovuta all'accessibilità della corteccia liscia dell'uistitì, alle somiglianze nell'organizzazione funzionale neurale con gli esseri umani e altri primati, alle piccole dimensioni e al^{rapido tasso di} riproduzione. Con la crescita della popolarità di questo organismo modello, c'è stato un rapido sviluppo delle tecniche neurofisiologiche adatte all'uso nel cervello dell'uistitì. I metodi di elettrofisiologia sono ampiamente utilizzati nelle neuroscienze per studiare l'attività dei singoli neuroni nella corteccia sia dei roditori che dei primati, con conseguente risoluzione temporale e accesso alla posizione senza precedenti. A causa della relativa novità della scimmia uistitì come modello di neuroscienze visive, l'ottimizzazione delle tecniche di elettrofisiologia del comportamento sveglio è ancora in evoluzione. Studi precedenti hanno dimostrato l'istituzione di protocolli robusti per l'elettrofisiologia nei preparati anestetizzati² e studi di neurofisiologia precoce del comportamento sveglio hanno dimostrato l'affidabilità degli elettrodi di tungsteno^{monocanale 3}. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno stabilito l'uso di array di microelettrodi a base di silicio per la neurofisiologia del comportamento da sveglio⁴. Tuttavia, l'uistitì pone sfide uniche per il targeting a causa delle sue piccole dimensioni cerebrali e della mancanza di punti di riferimento anatomici. Questo protocollo delinea come costruire e utilizzare un sistema di registrazione a micro-drive adatto all'uistitì che consente la registrazione di grandi popolazioni di neuroni con array lineari di silicio producendo al contempo un danno tissutale minimo.

Lavorare con l'uistitì rappresenta una sfida a causa della scala più piccola delle mappe retinotopiche nella corteccia visiva rispetto ai primati più grandi. Un leggero spostamento degli elettrodi di appena 1 mm può comportare cambiamenti significativi nelle mappe. Inoltre, i ricercatori hanno spesso bisogno di modificare il posizionamento degli elettrodi tra le sessioni di registrazione per ottenere una gamma più ampia di posizioni retinotopiche nella corteccia visiva. Le attuali preparazioni semi-croniche non consentono la regolazione del posizionamento dell'elettrodo giornalmente o con sufficiente precisione per mirare a posizioni specifiche su scale sub-millimetriche⁵. Con questo in mente, il sistema di micro-drive proposto utilizza uno stadio di elettrodi X-Y che monta un micro-drive leggero in una camera di registrazione e consente il targeting sub-millimetrico dei siti corticali. I componenti mobili dello stadio X-Y consentono il movimento verticale e orizzontale dell'array lineare per attraversare sistematicamente le aree corticali, il che è necessario per identificare le aree di interesse (tramite retinotopia e proprietà di sintonizzazione). Durante le sessioni di registrazione, i ricercatori possono anche regolare manualmente la fase X-Y per spostare i siti mirati all'interno dell'area. Questo è un vantaggio chiave rispetto alle tecniche alternative che utilizzano preparati di registrazione semi-cronici, che non hanno facili meccanismi di puntamento degli elettrodi.

Il micro-drive è uno strumento versatile che consente di montare il fissaggio di vari array di silicio per l'abbassamento nella corteccia. In questo protocollo, è stata utilizzata una sonda personalizzata con due array lineari a 32 canali distanziati di 200 μm l'uno dall'altro per lo studio dei circuiti laminari che coprono la profondità corticale. La maggior parte dei metodi per sondare i circuiti neurali in genere campiona i potenziali elettrici o le singole unità mediate su tutti gli strati della corteccia cerebrale. Tuttavia, recenti ricerche hanno rivelato risultati intriganti sui microcircuiti laminari corticali⁶. Utilizzando il micro-drive, i ricercatori possono utilizzare sonde laminari e apportare regolazioni fini alla profondità di registrazione per garantire un campionamento completo su tutti gli strati.

Questo sistema può essere costruito con componenti disponibili in commercio ed è facilmente modificabile per diverse tecniche sperimentali o sonde. I principali vantaggi di questa preparazione sono la possibilità di cambiare la posizione di registrazione X-Y con precisione sub-millimetrica e di controllare la profondità della registrazione all'interno della corteccia. Questo protocollo presenta istruzioni passo-passo per la costruzione del micro-drive X-Y stage e delle tecniche di registrazione neurofisiologica.

Protocollo

Le procedure sperimentali hanno seguito la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I protocolli per le procedure sperimentali e comportamentali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Rochester.

1. Costruzione del micro-drive contenente l'elettrodo per la registrazione (Figura 1)

NOTA: Gli stadi X-Y costruiti su misura che contengono array di silicio lineare multicanale consentono il puntamento sub-millimetrico dei siti di registrazione.

1. Raccogli tutte le parti dell'unità micro descritte nella Figura 1. Usa la plastica acrilonitrile butadiene stirene (ABS) trasparente per stampare in 3D le parti personalizzate. Ciò include la guaina protettiva, la base, lo stadio X e lo stadio Y. I progetti per le parti 3D sono disponibili online (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). Inoltre, raccogliere l'elettrodo, la piattaforma rettangolare in plastica, la griglia, il micromanipolatore, il tubo d'acciaio e sei viti in acciaio inossidabile (dimensione della vite: 00).
   1. Utilizzando un utensile rotante con un accessorio per il taglio della mola diamantata, ritagliare una sezione di 4 mm x 3 mm x 3 mm della griglia di plastica con una distanza tra i fori di 1 mm x 1 mm.
   2. Utilizzare la resina epossidica per fissare la piccola sezione della griglia ritagliata alla parte superiore del tavolino Y. Quindi, montare il micro-drive su quella griglia con una vite. Aggiungi resina epossidica alla base per la stabilità.
   3. Attacca la piccola piattaforma rettangolare stampata in 3D a un tubo d'acciaio da 28 G con resina epossidica. Questo verrà utilizzato nei passaggi futuri per tenere l'elettrodo di silicio.
   4. Infilare un tubo guida da 23 G attraverso la griglia. Quindi, infilare il tubo d'acciaio attaccato alla piattaforma di plastica attraverso il tubo guida da 23 G. Posizionare il tubo d'acciaio da 28 G in una delle fessure del microdrive.
   5. Quindi, assemblare le parti 3D (base, stadio X, stadio Y) utilizzando viti esagonali in acciaio inossidabile (dimensioni: 00, lunghezza: 1/8 in) per costruire la base per l'unità.
      1. Innanzitutto, usa uno strumento per picchiettare a mano per maschiare i fori delle viti prefabbricati sia nella base che nello stadio X. Quindi, inizia inserendo quattro viti attraverso le lunghe fessure nello stadio X e fissandole ai fori delle viti corrispondenti prefabbricati nella base.
      2. Una volta fissato lo stadio X mobile alla base, inserire due viti attraverso la lunga fessura nello stadio Y e fissarle ai fori delle viti prefabbricati nello stadio X.
         NOTA: Sia il X stage che il Y stage devono rimanere mobili fino a quando le viti non sono completamente serrate.
2. Assicurarsi che l'azionamento del micromanipolatore sia dotato di una piattaforma in plastica per collegare il connettore dell'elettrodo e di un tubo in poliimmide esteso per contenere l'elettrodo. Fissare il connettore a 64 pin alla piattaforma sul micromanipolatore utilizzando del nastro adesivo.
3. Posizionare con cautela una piccola quantità di bacitracina (unguento sterile) sul tubo di plastica del micromanipolatore e collegare l'elettrodo collegato al connettore a 64 pin tramite un cavo a nastro flessibile.
4. Utilizzare l'azionamento del micromanipolatore per tenere l'elettrodo di silicio e il relativo connettore mentre si infila il tubo di plastica attraverso un foro nello stadio Y. L'elettrodo sarà appeso sotto il tavolino della sonda, in attesa di essere fissato alla piattaforma rettangolare di plastica (passaggio 7, sezione 1).
5. Staccare il connettore a 64 pin dall'azionamento del micromanipolatore e utilizzare gel di colla per fissare il connettore alla piattaforma sullo stadio X. È possibile aggiungere ulteriore resina epossidica per rafforzare il legame del connettore una volta che la colla lo tiene in posizione. Lasciare asciugare per una notte.
6. Staccare con cautela l'elettrodo dal tubo di plastica e rimuovere l'azionamento del micromanipolatore dal gruppo.
   NOTA: A questo punto, l'unità viene tenuta solo con la clip a coccodrillo di un Helping Hands e l'elettrodo non è fissato all'interno della struttura dell'unità.
7. Spostare con cautela la clip a coccodrillo per capovolgere l'unità e vedere l'elettrodo non fissato. Utilizzando una pinza a punta smussata, posizionare l'elettrodo sul supporto di plastica sotto lo stadio Y e fissarlo con una piccola quantità di elastomero siliconico (silastico). Attendere 5 minuti fino a quando l'adesivo non si è indurito.
8. Utilizzare il comando a vite sul microazionamento per ritrarre l'elettrodo.
9. Posizionare il manicotto protettivo sull'elettrodo sul microdrive. Questa custodia protettiva ha le stesse dimensioni delle camere di registrazione stampate su misura e si inserisce saldamente nella base del gruppo unità.
10. Utilizzando un cacciavite a testa piatta, serrare le tre viti laterali sul componente di base del microazionamento per fissare il manicotto protettivo in posizione. Collegare l'head-stage utilizzato per le registrazioni al connettore a 64 pin.

2. Placcatura in politrodo degli elettrodi per ridurre l'impedenza complessiva (Figura 2)

NOTA: Per ottenere la migliore qualità di registrazione, è utile placcare gli array di elettrodi di silicio con una soluzione di poli(3,4-etilendiossitiofene) (PEDOT). È stato dimostrato che questo metodo aumenta il rapporto segnale/rumore^{di 7,8}.

1. Per preparare la soluzione di PEDOT, unire 0,075 mL di 3,4-etilendiossitiofene (EDOT) e 1,4 g di poli(4-stirensolfonato di sodio) (PSS) in 70 mL di acqua distillata. Vorticare brevemente questa soluzione per garantire la completa dissoluzione dei componenti. Miscelare questa soluzione il giorno prima dell'uso per una migliore dissoluzione.
2. Dopo aver avviato il software del tester di impedenza (vedere la tabella dei materiali), preparare le impostazioni con la preparazione dell'elettrodo scelta. Utilizzando il menu a discesa in alto a sinistra della finestra del software, selezionare l'adattatore utilizzato (N2T A32). Utilizzando il secondo menu a discesa, selezionare l'elettrodo utilizzato (NLX-EIB-36). Se l'elettrodo non è elencato nel menu a discesa, consultare il manuale per informazioni su come definire un nuovo elettrodo. Assicurarsi che il numero di canali sia corretto.
3. Collegare la sonda al sistema di tester di impedenza tramite il connettore e abbassare la sonda nella soluzione salina con messa a terra per ottenere una lettura della linea di base.
   1. Nel sistema di tester di impedenza, premere il pulsante Test Impedenze sul lato sinistro e assicurarsi delle impostazioni corrette (Impostazioni: Frequenza di prova: 1,004 Hz, Cicli: 100, Pausa: 0). Quindi, premere il pulsante Sonda di prova in basso a destra.
   2. Durante l'esecuzione del tester di impedenza verrà visualizzata una finestra di report della sonda, che memorizza i risultati in un foglio di calcolo. Conservare questi risultati per riferimento futuro per entrambi i gambi dell'elettrodo (il montaggio dell'elettrodo in un becher per l'uso con il tester di impedenza è illustrato nella Figura 2D). Se si utilizza una sonda con più gambi, assicurarsi che il passaggio 3 venga ripetuto per ciascun gambo.
4. Rimuovere la sonda dalla soluzione fisiologica abbassando il piedistallo (cioè il martinetto da laboratorio) che tiene il becher. Sostituire il liquido del becher con acqua distillata. Sollevare il martinetto da laboratorio per immergere l'elettrodo, risciacquare la soluzione salina rimanente, quindi abbassare nuovamente il martinetto da laboratorio.
5. Sostituire l'acqua distillata nel becher con una soluzione PEDOT e sollevare il martinetto da laboratorio fino a quando l'elettrodo non è immerso nella soluzione.
6. Selezionare il pulsante DC Electroplate sul lato sinistro della finestra del software e assicurarsi che vengano utilizzate le impostazioni corrette (Impostazioni: Autoplate: 0.004 μA, 350 Hz, Durata: 5, Pausa: 1). Quindi, premere il pulsante Autoplate in basso a destra. Ancora una volta, apparirà una finestra di report della sonda con i risultati della galvanica. Salvare questi risultati per riferimento futuro. Se si utilizza una sonda con più gambi, assicurarsi che questo passaggio venga ripetuto per ciascun gambo.
7. Rimuovere la sonda dalla soluzione PEDOT abbassando il martinetto da laboratorio e sciacquare la sonda con acqua distillata come eseguito in precedenza (passaggio 4). Dopo il risciacquo, riempire il becher con soluzione salina e sollevare il martinetto da laboratorio fino a quando l'elettrodo non è immerso.
8. Premere il pulsante Impedenze di prova sul lato sinistro della finestra del software e assicurarsi che vengano utilizzate le impostazioni corrette (Impostazioni: Frequenza di test: 1.004 Hz, Cicli: 100, Pausa: 0). Premere il pulsante Test Probe in basso a destra. Salvare questi risultati per riferimento futuro. Se si utilizza una sonda con più gambi, assicurarsi che questo passaggio venga ripetuto per ciascun gambo.
   NOTA: Confrontare i valori post-galvanici con i valori pre-galvanici. Dovrebbe esserci una diminuzione dei valori di impedenza.
9. Con l'uso continuo, le sonde possono mostrare aumenti dei valori di impedenza dopo 6 mesi. In caso di dubbi sui valori di impedenza del segnale di registrazione, ripetere il test delle impedenze della sonda dopo il punto 3. Se i valori di impedenza sono aumentati rispetto ai valori iniziali, ripetere la galvanica (passaggio 6).

3. Posizionamento chirurgico della cuffia della testa, delle camere e della craniotomia (Figura 3A-C)

NOTA: In questo lavoro, al termine dello studio, l'animale è stato anestetizzato con isoflurano e ha ricevuto iniezioni intramuscolari (IM) di ketamina, seguite da un'iniezione intraperitoneale (IP) di euthasol. Il cervello è stato estratto dopo perfusione transcardica con soluzione fisiologica seguita da formalina al 10%.

1. Addestrare gli uistitì (almeno 1,5 anni di età) a sedersi su una piccola sedia per primati seguendo i metodi^{precedentemente} descritti 3,9,10,11 2 mesi prima dell'intervento chirurgico.
2. Il giorno dell'intervento, indurre i soggetti con un'iniezione intramuscolare (i.m.) di ketamina (5-15 mg/kg)/dexdormitor (0,02-0,1 mg/kg) (e midazolam a 0,25 mg/kg come miorilassante) e confermare la corretta anestesia in base alla frequenza cardiaca, alla respirazione e al riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Intubare gli animali per la somministrazione continua di isoflurano (0,5%-2% in ossigeno al 100%) durante l'intervento chirurgico monitorando i loro parametri vitali. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi durante l'intervento chirurgico per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
3. Dopo che i chirurghi hanno indossato i DPI sterili, preparare un campo operatorio sterile utilizzando teli sterili per coprire le superfici e il campo operatorio. Utilizzando tecniche asettiche, i chirurghi impiantano un cappuccio in acrilico con perni e viti in titanio per stabilizzare la testa utilizzando i metodi descritti in dettaglio in precedenza da Nummela et ^al.11.
4. Durante l'intervento di implantologia, pianificare il posizionamento della camera di registrazione sulle aree di interesse (ad esempio, aree visive, area temporale media [MT] e corteccia visiva primaria [V1]) in base alle coordinate stereotassiche¹².
5. Posizionare un cavo di messa a terra.
   1. Inizia praticando un foro di 1,1 mm nel cranio vicino all'area della camera di registrazione pianificata. Piegare un filo di acciaio inossidabile da 36 G a circa 0,075-1 mm dalla punta e far scorrere la parte piegata del filo tra il cranio e la dura sul fondo del foro della bava.
   2. Sigillare inizialmente il filo e il foro con cera ossea e poi con cemento e acrilico quando si posizionano le camere. Assicurarsi di lasciare una parte all'esterno vicino alla camera da collegare per la messa a terra.
6. Dopo aver posizionato uno strato di base di cemento adesivo rapido per coprire l'intera area del sito di registrazione e del cavo di messa a terra, far aderire le camere di registrazione (costituite da parti stampate in 3D personalizzate) al cranio utilizzando il cemento adesivo rapido e rinforzare con acrilico durante la costruzione dell'impianto della testa.
7. Sigillare le camere con un tappo della camera stampato in 3D che è progettato per adattarsi perfettamente all'interno della camera (e non può essere rimosso dai compagni di gabbia alloggiati in coppia con il soggetto).
   1. Erogare una piccola quantità di elastomero siliconico (silastico) attorno ai bordi interni della camera utilizzando i puntali di miscelazione inclusi, quindi inserire il tappo della camera fino a quando non è a filo con le pareti esterne della camera.
   2. Le camere sono progettate con fori di accesso (1 mm di diametro) su entrambi i lati della camera per garantire che il tappo della camera possa essere rimosso facilmente. Utilizzare silastic per sigillare questi fori di accesso, ottenendo una tenuta ermetica della camera.
      NOTA: Per rimuovere i tappi della camera, utilizzare una pinzetta per rimuovere prima la sigillatura silastica dei fori di accesso per rompere la chiusura ermetica della camera. Quindi, è possibile utilizzare un perno per far uscire il tappo della camera dalla camera.
8. Recuperare gli animali dall'anestesia e non lasciarli incustoditi fino a quando non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere il decubito sternale. Trattare gli animali post-chirurgicamente con antibiotici (amoxicillina-acido clavulanico a 13,75 mg/kg) per 7 giorni e antinfiammatori (meloxicam a 0,1 mg/kg) per 3 giorni. Somministrare farmaci antidolorifici a lento rilascio prima del recupero per durare 72 ore dopo l'intervento e alloggiare gli animali in modo indipendente fino al completo recupero.
9. Due o tre settimane dopo l'intervento chirurgico, inizia ad allenare il poggiatesta e il comportamento visivo. Posizionare l'uistitì su una sedia per primati e consentire l'acclimatazione al poggiatesta. Una volta a suo agio, addestra l'uistitì a svolgere diversi compiti di base, tra cui la fissazione visiva centrale¹³ e un compito saccadico verso un reticolo di Gabor rilevato perifericamente, che viene utilizzato per misurare la loro acuità visiva¹¹.
10. Dopo un sufficiente addestramento comportamentale, eseguire una craniotomia all'interno della camera di registrazione. Con tecniche sterili, eseguire un secondo intervento chirurgico per creare una craniotomia (2-3 mm di diametro) nella camera di registrazione sull'area di interesse (ad esempio, area MT). Sigillare la craniotomia con un'applicazione spessa di silastic di circa 1 mm o alla profondità della craniotomia per proteggere il cervello dalle infezioni e ridurre la crescita della granulazione¹⁴. Assicurarsi che la guarnizione silastica abbia i bordi che aderiscono ad almeno 2 mm o più di cemento dentale su tutti i lati. Riposizionare il tappo della camera come descritto al punto 7.
11. Se si verifica un'emorragia o la guarnizione silastica perde liquidi chiari nei giorni successivi all'intervento, la camera dovrà essere pulita.
    1. Se il sigillo silastico è intatto, utilizzare tecniche sterili per pulire con il 10% di betadine e lavare con soluzione fisiologica sterile prima di rimuovere il sigillo. Se il sigillo silattico non è intatto, pulirlo solo con soluzione fisiologica sterile con tecniche sterili.
    2. Una volta rimosso il silastico, sciacquare più volte la dura con soluzione fisiologica sterile e asciugare con un applicatore con punta di cotone. Asciugare ulteriormente accuratamente la camera utilizzando un applicatore con punta di cotone prima di applicare un nuovo strato di silastico. In genere, la camera si stabilizza e rimane asciutta con una chiusura ermetica dopo pochi giorni o 1 settimana.
12. Una volta che la craniotomia si è stabilizzata e non mostra segni di sanguinamento, eseguire un raschiamento durale per rimuovere il tessuto in eccesso sulla dura. Quindi, applicare uno strato sottile (<1 mm) di silastic (abbastanza sottile da consentire il passaggio degli elettrodi per le registrazioni) e utilizzare una punta da trapano da 1/4 per assorbire il silastic sulle pareti della craniotomia, come mostrato nella Figura 3C, per l'acquisto meccanico.
    NOTA: Ciò consentirà anche una rimozione più facile per scopi di pulizia. Il silastico può rimanere in posizione per tutta la durata dello studio e può essere perforato con elettrodi lineari per la registrazione.

4. Configurazione della registrazione neurofisiologica (Figura 3D-F)

NOTA: Le fasi di manipolazione degli animali variano a seconda del laboratorio e dell'esperimento. I seguenti passaggi sono specifici per il posizionamento del micro-drive e la penetrazione della dura per le registrazioni.

1. Rimuovere il tappo dalla camera di registrazione (descritto nella sezione 3, passaggio 7.2). Mettere il tappo in alcol isopropilico al 91% in ammollo durante la registrazione. Assicurarsi che i bordi della camera siano liberi da silastri. Se silastic viene lasciato sui bordi della camera, il microazionamento non si posizionerà correttamente.
2. La base del microazionamento è dotata di tre viti per il serraggio alla camera dell'animale. Normalmente, queste viti sono serrate in posizione attorno a un manicotto protettivo delle stesse dimensioni della camera per proteggere la sonda al silicio all'interno dall'impatto.
   1. Innanzitutto, utilizzare il cacciavite per allentare le tre viti che fissano il manicotto protettivo sulla sonda in silicone e rimuovere con cautela il manicotto. Collegare il microdrive alla camera di registrazione, facendo attenzione a non urtare gli elettrodi di silicio sulle pareti della camera (Figura 3D, E).
   2. Inoltre, assicurarsi che gli elettrodi siano in una posizione completamente retratta prima di posizionare l'unità sulla camera, in modo che si trovino ben al di sopra della corteccia durante il posizionamento iniziale.
3. Una volta posizionato, utilizzare il cacciavite per serrare ciascuna vite sul lato del microazionamento (Figura 3F). Scegli un ordine per serrare le viti e usalo ogni volta per mantenere la stabilità nella posizione. I ricercatori potrebbero anche voler contare il numero di giri quando inizialmente allentano le viti per stringerle di una quantità simile. Controllare se la sonda è allentata e serrarla secondo necessità, ma fare attenzione a non strappare le filettature delle viti nella plastica stringendole eccessivamente.
4. Una volta fissato il microazionamento alla camera, posizionare tutti i cavi di messa a terra necessari.
   NOTA: Lasciare lo stadio principale inserito nel connettore durante la notte e inserire il cavo SPI (Serial Peripheral Interface) nello stadio principale solo per le registrazioni, poiché è difficile inserire lo stadio principale nel connettore mentre è sull'animale.
5. Collegare con cautela il cavo SPI allo stadio di testa (già collegato alla sonda). Assicurarsi di non piegare il filo. Amplifica e digitalizza tutti i dati neurofisiologici dallo stadio head a 30 kHz utilizzando la GUI Open-Ephys (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). Filtrare passa-alto il segnale a banda larga dallo stadio di testa a 0,1 Hz. Correggere gli sfasamenti di questo filtraggio, come descritto in precedenza¹⁵. Per le matrici lineari, pre-elaborare le tracce risultanti mediante il riferimento alla media comune.
6. Immettere la mappa dei canali per il particolare array di elettrodi utilizzato nel sistema di registrazione, in modo che i canali tracciati durante la registrazione siano ordinati in base alla profondità nella vista del segnale di registrazione filtrato passa-alto. Questa vista verrà utilizzata durante l'avanzamento e la retrazione dell'elettrodo.

5. Esecuzione dell'esperimento di registrazione neurofisiologica (Figura 4)

NOTA: Qui viene descritto il metodo per inserire gli array di elettrodi nella corteccia; Questo metodo è stato ottimizzato per evitare eccessive fossette del tessuto sottostante. Un aumento del rumore nelle registrazioni elettrofisiologiche fornisce una buona indicazione di fossette prima di penetrare nel silasico ed entrare nel cervello. Una volta nel cervello, se c'è troppa fossetta, il ricercatore può notare che le unità si spostano sulla sonda anche senza la manipolazione dell'unità (unità che si muovono gradualmente attraverso i canali in profondità), o in alternativa, il ricercatore può notare la soppressione dell'attività neurale, in particolare nei siti superficiali della sonda. In queste condizioni, l'unità viene retratta per alleviare le fossette e facilitare registrazioni migliori.

1. Utilizzando il controllo a vite sul microazionamento, abbassare la sonda al silicio, effettuando un giro (250 μm) ogni 1-2 s fino a quando non si osservano unità sulla punta dell'array.
   NOTA: Si può osservare un lieve aumento del rumore durante la penetrazione del sillastico posto sopra la dura. I gambi increspano il silastic prima di fuoriuscire, il che può aumentare il rumore sulla sonda. Una discesa veloce fino al primo segno di unità aiuta la penetrazione dello strato silastico.
2. Una volta osservati i primi neuroni, ritrarre un giro del micro-drive (250 μm) per ridurre la velocità di ingresso mentre l'elettrodo inizia a spuntare attraverso il silasico e la dura nel tessuto corticale. Se l'elettrodo sembra continuare ad avanzare nel tessuto nel tempo senza micromanipolazione, ritrarre un ulteriore giro per alleviare la pressione della sonda che spinge sul silasico e sul tessuto sottostante.
   NOTA: Dovrebbe essere possibile tracciare la posizione dei neuroni se è stata caricata la mappa dei canali corretta per l'array lineare (i canali appariranno ordinati in base alla loro profondità rispetto alla corteccia).
3. Continuare a guidare l'array nella corteccia molto lentamente, avanzando di circa 4-6 giri (1-1,5 mm) per una durata di 20-30 minuti fino a quando i neuroni non sono distribuiti uniformemente su tutta la lunghezza della sonda.
4. Ritrarre lentamente l'array di uno o due giri (0,25-0,5 mm) per ridurre la pressione sul tessuto prima di iniziare le registrazioni.
   NOTA: I neuroni in genere non spostano la posizione del canale sull'array lineare durante questa retrazione, suggerendo che agisce principalmente per ridurre la pressione sul tessuto. Senza retrazione, durante la registrazione si può osservare un continuo spostamento dell'array mentre il tessuto si rilassa, interrompendo così la stabilità della registrazione (Figura 4C).
5. Dopo la ritrazione, attendere 20 minuti prima di avviare le registrazioni. Ciò limiterà la quantità di movimento visibile nella registrazione. Utilizzare questo tempo per prepararsi alla registrazione (ad esempio, calibrare il tracciamento oculare e preparare i sistemi di presentazione dello stimolo).
6. Seleziona Registra sul software di registrazione.
7. Al termine dell'esperimento, seleziona di nuovo il pulsante di registrazione. In questo modo verrà creato il file di registrazione completo nella destinazione selezionata. Assicurarsi che il file sia stato salvato correttamente prima di continuare.
8. Inizia lentamente a ritrarre l'array fuori dalla corteccia a una velocità simile a quella di prima (da quattro a sei giri in una durata di 20-30 minuti). Visualizza la sonda che si ritrae osservando i neuroni che si spostano lungo la sonda. Dopo aver ritratto per il numero di giri dalla prima volta che si vedono i neuroni e quando non si osservano più neuroni sulla sonda, continuare a ritrarre più rapidamente fino a tornare alla posizione di partenza completamente retratta.
9. Per rimuovere la sonda dalla camera di registrazione, eseguire i passaggi 1-3 della sezione 4 in ordine inverso (ovvero, eseguire prima il passaggio 3, seguito dal passaggio 2 e quindi dal passaggio 1).
10. Una volta che la sonda è stata rimossa dalla camera di registrazione, immergerla in una soluzione per lenti a contatto per 20 minuti per rimuovere eventuali tessuti o sangue dall'elettrodo. Successivamente, immergere la sonda in alcol per 1 minuto per rimuovere la soluzione per lenti a contatto e lasciare asciugare l'elettrodo.
11. Utilizzare Kilosort2 per ordinare i dati dell'array dopo il filtraggio iniziale dal sistema di registrazione (come descritto in precedenza nella sezione 4, passaggio 5).
    1. Etichettare manualmente gli output degli algoritmi di ordinamento dei picchi utilizzando la GUI "phy" (https://github/kwikteam/phy). Classificare le unità con forme d'onda minuscole o fisiologicamente non plausibili come rumore ed escluderle.
    2. Se si utilizzano sonde laminari, visualizzare le forme d'onda spike su ciascun canale per assicurarsi che le singole unità siano etichettate sul canale con la forma d'onda di picco (Figura 5A). Includi solo le unità che hanno cluster chiari nello spazio PCA, meno dell'1% di violazioni dell'intervallo inter-spike e forme d'onda spike bifasiche (che dovrebbero essere localizzate su canali adiacenti sull'array lineare). Un esempio di singola unità è mostrato nella Figura 5B, che mostra cluster chiari nello spazio PCA (in alto a destra) e stabilità nel tempo (in basso a destra).

Risultati

Questo protocollo descrive come costruire uno stadio a elettrodi X-Y (Figura 1) che consenta il targeting sub-millimetrico dei siti e mantenga un posizionamento affidabile in sessioni di registrazione separate. L'affidabilità del posizionamento X-Y è illustrata nella Figura 6, che dimostra che due sessioni di registrazione condotte a distanza di una settimana l'una dall'altra hanno mostrato una sovrapposizione del 70,8% nelle loro posizioni RF medie (

Discussione

Diversi metodi (ad esempio, cronico, semi-cronico, acuto) sono attualmente disponibili per eseguire esperimenti di neurofisiologia nei primati non umani. L'uistitì comune pone sfide uniche per gli esperimenti di neurofisiologia a causa delle sue piccole dimensioni e della mancanza di circonvoluzioni come punti di riferimento anatomici. Ciò richiede ai ricercatori di utilizzare punti di riferimento neurofisiologici come la retinotopia e le proprietà di sintonizzazione delle aree di interesse per identificare i bersagli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachment for dremel	Dremel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedance Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instruments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html