Elektrophysiologie der laminaren kortikalen Aktivität beim Weißbüschelaffen

Zusammenfassung

Speziell angefertigte Mikroantriebe ermöglichen das Submillimeter-Targeting von kortikalen Aufzeichnungsstellen mit linearen Siliziumarrays.

Zusammenfassung

Der Weißbüschelaffe bietet aufgrund seiner glatten kortikalen Oberfläche ein ideales Modell für die Untersuchung laminarer kortikaler Schaltkreise, was Aufnahmen mit linearen Arrays erleichtert. Der Weißbüschelaffe hat in letzter Zeit aufgrund seiner ähnlichen neuronalen funktionellen Organisation wie andere Primaten und seiner technischen Vorteile für die Aufnahme und Bildgebung an Popularität gewonnen. Die Neurophysiologie in diesem Modell stellt jedoch aufgrund der geringen Größe und des Fehlens von Gyri als anatomische Orientierungspunkte einige einzigartige Herausforderungen dar. Mit speziell angefertigten Mikrolaufwerken können Forscher die lineare Array-Platzierung auf Submillimeter-Präzision manipulieren und über Aufzeichnungstage hinweg zuverlässig an derselben retinotopisch anvisierten Stelle aufzeichnen. Dieses Protokoll beschreibt den schrittweisen Aufbau des Mikroantriebspositionierungssystems und die neurophysiologische Aufzeichnungstechnik mit linearen Silizium-Elektrodenarrays. Mit der präzisen Kontrolle der Elektrodenplatzierung über die Aufnahmesitzungen hinweg können Forscher den Kortex leicht durchqueren, um interessante Bereiche basierend auf ihrer retinotopen Organisation und den Abstimmungseigenschaften der aufgezeichneten Neuronen zu identifizieren. Darüber hinaus ist es mit diesem Laminar-Array-Elektrodensystem möglich, eine Stromquellendichteanalyse (CSD) anzuwenden, um die Aufzeichnungstiefe einzelner Neuronen zu bestimmen. Dieses Protokoll zeigt auch Beispiele für laminare Aufzeichnungen, einschließlich in Kilosort isolierter Spike-Wellenformen, die sich über mehrere Kanäle auf den Arrays erstrecken.

Einleitung

Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) hat in den letzten Jahren als Modell zur Untersuchung der Gehirnfunktion schnell an Popularität gewonnen. Diese wachsende Popularität ist auf die Zugänglichkeit des glatten Kortex des Weißbüschelaffen, die Ähnlichkeiten in der neuronalen Funktionsorganisation mit Menschen und anderen Primaten sowie die geringe Größe und schnelle Fortpflanzungsrate^{zurückzuführen 1}. Da dieser Modellorganismus immer beliebter wurde, gab es eine rasche Entwicklung der neurophysiologischen Techniken, die für den Einsatz im Weißbüschelaffengehirn geeignet sind. Elektrophysiologische Methoden werden in den Neurowissenschaften häufig eingesetzt, um die Aktivität einzelner Neuronen im Kortex von Nagetieren und Primaten zu untersuchen, was zu einer beispiellosen zeitlichen Auflösung und einem beispiellosen Standortzugang führt. Aufgrund der relativen Neuheit des Weißbüschelaffen als Modell der visuellen Neurowissenschaften entwickelt sich die Optimierung der Wach-Elektrophysiologie-Techniken noch weiter. Frühere Studien haben die Etablierung robuster Protokolle für die Elektrophysiologie in anästhesierten Präparaten gezeigt², und frühe Wachverhaltens-Neurophysiologie-Studien haben die Zuverlässigkeit von Einkanal-Wolframmestoden gezeigt³. In den letzten Jahren haben Forscher die Verwendung von Mikroelektrodenarrays auf Siliziumbasis für die Neurophysiologie im Wachzustand etabliert⁴. Der Weißbüschelaffe stellt jedoch aufgrund seiner geringen Gehirngröße und des Fehlens anatomischer Orientierungspunkte einzigartige Herausforderungen bei der Zielerfassung dar. Dieses Protokoll beschreibt, wie ein für Weißbüschelaffen geeignetes Mikrolaufwerk-Aufzeichnungssystem konstruiert und verwendet wird, das die Aufzeichnung großer Neuronenpopulationen mit linearen Silizium-Arrays bei minimaler Gewebeschädigung ermöglicht.

Die Arbeit mit Weißbüschelaffen stellt eine Herausforderung dar, da die retinotopischen Karten im visuellen Kortex im Vergleich zu größeren Primaten kleiner sind. Eine leichte Verschiebung der Elektroden um nur 1 mm kann zu erheblichen Veränderungen in den Kennfeldern führen. Darüber hinaus müssen Forscher häufig die Platzierung der Elektroden zwischen den Aufnahmesitzungen ändern, um ein breiteres Spektrum an retinotopischen Positionen im visuellen Kortex zu erhalten. Aktuelle semi-chronische Präparate ermöglichen es nicht, die Elektrodenpositionierung täglich oder mit ausreichender Präzision anzupassen, um bestimmte Stellen im Submillimeterbereich anzuvisieren⁵. Vor diesem Hintergrund verwendet das vorgeschlagene Mikroantriebssystem einen X-Y-Elektrodentisch, der einen leichten Mikroantrieb an einer Aufnahmekammer montiert und das Submillimeter-Targeting von kortikalen Stellen ermöglicht. Die beweglichen X-Y-Tischkomponenten ermöglichen eine vertikale und horizontale Bewegung des linearen Arrays, um die kortikalen Bereiche systematisch zu durchlaufen, was zur Identifizierung von Interessengebieten erforderlich ist (über Retinotopie und Tuning-Eigenschaften). Während der Aufnahmesitzungen können die Forscher den X-Y-Tisch auch manuell anpassen, um die Zielstellen innerhalb des Bereichs zu verschieben. Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber alternativen Techniken mit semi-chronischen Aufnahmepräparaten, die keine einfachen Elektroden-Targeting-Mechanismen haben.

Der Micro-Drive ist ein vielseitiges Werkzeug, das die Befestigung verschiedener Silizium-Arrays ermöglicht, um sie in den Kortex abzusenken. In diesem Protokoll wurde eine benutzerdefinierte Sonde mit zwei 32-Kanal-Lineararrays im Abstand von 200 μm für die Untersuchung laminarer Schaltkreise verwendet, die die kortikale Tiefe überspannen. Die meisten Methoden zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise werden typischerweise die elektrischen Potentiale oder einzelne Einheiten abgetastet, die über alle Schichten der Großhirnrinde gemittelt werden. Jüngste Forschungen haben jedoch faszinierende Erkenntnisse über kortikale laminare Mikroschaltkreise zutage gefördert⁶. Durch die Verwendung des Mikroantriebs können Forscher laminare Sonden verwenden und Feineinstellungen an der Aufzeichnungstiefe vornehmen, um eine umfassende Abtastung über alle Schichten hinweg zu gewährleisten.

Dieses System kann mit kommerziell erhältlichen Komponenten aufgebaut werden und kann leicht für verschiedene experimentelle Techniken oder Sonden modifiziert werden. Die Hauptvorteile dieses Präparats sind die Möglichkeit, die X-Y-Aufnahmeposition submillimetergenau zu ändern und die Tiefe der Aufnahme innerhalb des Kortex zu steuern. Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den Aufbau des X-Y-Stadiums, des Mikroantriebs und der neurophysiologischen Aufnahmetechniken.

Protokoll

Die experimentellen Verfahren folgten dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Protokolle für die experimentellen und verhaltensbezogenen Verfahren wurden vom University of Rochester Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Aufbau des Mikrolaufwerks mit der Elektrode für die Aufzeichnung (Abbildung 1)

HINWEIS: Speziell angefertigte X-Y-Tische mit linearen Mehrkanal-Silizium-Arrays ermöglichen eine Submillimeter-Ausrichtung der Aufnahmestellen.

1. Sammeln Sie alle in Abbildung 1 beschriebenen Mikrolaufwerksteile. Verwenden Sie klaren Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS)-Kunststoff, um die kundenspezifischen Teile in 3D zu drucken. Dazu gehören die Schutzhülle, die Basis, die X-Stufe und die Y-Stufe. Entwürfe für 3D-Teile sind online verfügbar (https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html). Sammeln Sie zusätzlich die Elektrode, die rechteckige Kunststoffplattform, das Gitter, den Mikromanipulator, das Stahlrohr und sechs Edelstahlschrauben (Schraubengröße: 00).
   1. Schneiden Sie mit einem Rotationswerkzeug mit Diamantscheibenaufsatz einen 4 mm x 3 mm x 3 mm großen Abschnitt des Kunststoffgitters mit einem Lochabstand von 1 mm x 1 mm aus.
   2. Verwenden Sie Epoxidharz, um den kleinen ausgeschnittenen Gitterabschnitt oben am Y-Tisch zu befestigen. Montieren Sie dann das Mikrolaufwerk mit einer Schraube über diesem Gitter. Fügen Sie Epoxidharz an der Basis hinzu, um Stabilität zu gewährleisten.
   3. Befestigen Sie die kleine 3D-gedruckte rechteckige Plattform an einem 28 G Stahlrohr mit Epoxidharz. Dies wird in zukünftigen Schritten verwendet, um die Siliziumelektrode zu halten.
   4. Fädeln Sie ein 23 G Führungsrohr durch das Gitter. Fädeln Sie dann das an der Kunststoffplattform befestigte Stahlrohr durch das 23-G-Führungsrohr. Setzen Sie das 28-G-Stahlrohr in einen der Steckplätze des Mikrolaufwerks ein.
   5. Montieren Sie dann die 3D-Teile (Basis, X-Stufe, Y-Stufe) mit Edelstahl-Sechskantschrauben (Größe: 00, Länge: 1/8 Zoll), um die Basis für den Antrieb zu bauen.
      1. Verwenden Sie zunächst ein Handgewindeschneidwerkzeug, um die vorgefertigten Schraubenlöcher sowohl in der Basis als auch in der X-Stufe zu bohren. Führen Sie dann zunächst vier Schrauben durch die langen Schlitze in der X-Stufe und befestigen Sie sie an den entsprechenden Schraubenlöchern, die in der Basis vorgefertigt sind.
      2. Sobald die bewegliche X-Stufe an der Basis befestigt ist, stecken Sie zwei Schrauben durch den langen Schlitz in der Y-Stufe und befestigen Sie sie an den vorgefertigten Schraubenlöchern in der X-Stufe.
         HINWEIS: Sowohl die X-Stufe als auch die Y-Stufe sollten beweglich bleiben, bis die Schrauben vollständig angezogen sind.
2. Stellen Sie sicher, dass der Antrieb des Mikromanipulators mit einer Kunststoffplattform zur Befestigung des Elektrodenanschlusses sowie einem verlängerten Polyimidrohr zur Aufnahme der Elektrode ausgestattet ist. Befestigen Sie den 64-poligen Stecker mit Klebeband an der Plattform des Mikromanipulators.
3. Geben Sie vorsichtig einen Tupfer Bacitracin (sterile Salbe) auf das Kunststoffrohr des Mikromanipulators und befestigen Sie die Elektrode, die mit dem 64-poligen Stecker verbunden ist, über ein flexibles Flachbandkabel.
4. Verwenden Sie den Mikromanipulatorantrieb, um die Siliziumelektrode und ihren Stecker zu halten, während Sie das Kunststoffrohr durch ein Loch in der Y-Stufe fädeln. Die Elektrode hängt unter dem Tisch der Sonde und wartet darauf, an der rechteckigen Kunststoffplattform befestigt zu werden (Schritt 7, Abschnitt 1).
5. Trennen Sie den 64-poligen Stecker vom Mikromanipulatorantrieb und befestigen Sie den Stecker mit Klebegel an der Plattform auf der X-Stufe. Zusätzliches Epoxidharz kann hinzugefügt werden, um die Verbindung des Verbinders zu verstärken, sobald der Kleber ihn an Ort und Stelle hält. Über Nacht trocknen lassen.
6. Lösen Sie die Elektrode vorsichtig vom Kunststoffrohr und entfernen Sie den Mikromanipulatorantrieb aus der Baugruppe.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wird das Laufwerk nur mit der Krokodilklemme eines Helping Hands gehalten, und die Elektrode ist nicht sicher in der Antriebskonstruktion.
7. Bewegen Sie vorsichtig die Krokodilklemme, um das Laufwerk umzudrehen und die ungesicherte Elektrode zu sehen. Legen Sie die Elektrode mit einer Zange mit stumpfer Spitze auf die Kunststoffhalterung unterhalb des Y-Tisches und befestigen Sie sie mit einer kleinen Menge Silikonelastomer (Silastic). Warten Sie 5 Minuten, bis der Klebstoff ausgehärtet ist.
8. Verwenden Sie die Schraubsteuerung am Mikroantrieb, um die Elektrode zurückzuziehen.
9. Legen Sie die Schutzhülle über die Elektrode am Mikroantrieb. Diese Schutzhülle hat die gleiche Größe wie die individuell bedruckten Aufnahmekammern und passt sicher in den Boden der Antriebseinheit.
10. Ziehen Sie mit einem Schlitzschraubendreher die drei seitlich angeordneten Schrauben an der Basiskomponente des Mikrolaufwerks fest, um die Schutzhülle zu sichern. Schließen Sie die für die Aufnahmen verwendete Kopfstufe an den 64-poligen Anschluss an.

2. Polytrodenbeschichtung von Elektroden zur Reduzierung der Gesamtimpedanz (Abbildung 2)

HINWEIS: Für die beste Aufnahmequalität ist es sinnvoll, die Silizium-Elektrodenarrays mit einer Poly(3,4-ethylendioxythiophen)-Lösung (PEDOT) zu elektroden. Es hat sich gezeigt, dass diese Methode das Signal-Rausch-Verhältnis^{erhöht 7,8}.

1. Um die PEDOT-Lösung herzustellen, kombinieren Sie 0,075 ml 3,4-Ethylendioxythiophen (EDOT) und 1,4 g Poly(natrium-4-styrolsulfonat) (PSS) in 70 ml destilliertem Wasser. Drehen Sie diese Lösung kurz, um die vollständige Auflösung der Komponenten zu gewährleisten. Mischen Sie diese Lösung am Tag vor dem Gebrauch, um die beste Auflösung zu erzielen.
2. Bereiten Sie nach dem Start der Impedanztester-Software (siehe Materialtabelle) die Einstellungen mit der gewählten Elektrodenvorbereitung vor. Wählen Sie über das obere Dropdown-Menü oben links im Softwarefenster den verwendeten Adapter (N2T A32) aus. Wählen Sie im zweiten Dropdown-Menü die verwendete Elektrode aus (NLX-EIB-36). Wenn die Elektrode nicht im Pulldown-Menü aufgeführt ist, lesen Sie im Handbuch nach, wie Sie eine neue Elektrode definieren. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Kanäle korrekt ist.
3. Verbinden Sie die Sonde über den Stecker mit dem Impedanztestersystem und senken Sie die Sonde in geerdete Kochsalzlösung, um einen Basiswert zu erhalten.
   1. Drücken Sie im Impedanztestersystem die Taste Testimpedanzen auf der linken Seite und stellen Sie die richtigen Einstellungen sicher (Einstellungen: Testfrequenz: 1.004 Hz, Zyklen: 100, Pause: 0). Drücken Sie dann die Taste Testspitze unten rechts.
   2. Während der Ausführung des Impedanztesters wird ein Testberichtsfenster angezeigt, in dem die Ergebnisse in einer Tabelle gespeichert werden. Speichern Sie diese Ergebnisse zur späteren Referenz für beide Schäfte der Elektrode (die Montage der Elektrode in einem Becherglas zur Verwendung mit dem Impedanztester ist in Abbildung 2D dargestellt). Wenn Sie eine Sonde mit mehreren Schäften verwenden, stellen Sie sicher, dass Schritt 3 für jeden Schaft wiederholt wird.
4. Entfernen Sie die Sonde aus der Kochsalzlösung, indem Sie den Sockel (d. h. den Laborheber) absenken, der das Becherglas hält. Ersetzen Sie die Becherflüssigkeit durch destilliertes Wasser. Heben Sie die Laborbuchse an, um die Elektrode einzutauchen, spülen Sie die restliche Kochsalzlösung ab und senken Sie die Laborbuchse dann wieder ab.
5. Ersetzen Sie das destillierte Wasser im Becherglas durch PEDOT-Lösung und heben Sie den Laborheber an, bis die Elektrode in die Lösung eingetaucht ist.
6. Wählen Sie die Schaltfläche DC Electroplate auf der linken Seite des Softwarefensters und stellen Sie sicher, dass die richtigen Einstellungen verwendet werden (Einstellungen: Autoplate: 0,004 μA, 350 Hz, Dauer: 5, Pause: 1). Drücken Sie dann die Autoplate-Taste unten rechts. Wieder erscheint ein Sondenberichtsfenster mit den Ergebnissen der Galvanik. Speichern Sie diese Ergebnisse zum späteren Nachschlagen. Wenn Sie eine Sonde mit mehreren Schäften verwenden, stellen Sie sicher, dass dieser Schritt für jeden Schaft wiederholt wird.
7. Entfernen Sie die Sonde aus der PEDOT-Lösung, indem Sie den Laborheber absenken, und spülen Sie die Sonde wie zuvor (Schritt 4) mit destilliertem Wasser ab. Füllen Sie nach dem Spülen das Becherglas mit Kochsalzlösung und heben Sie den Laborheber an, bis die Elektrode untergetaucht ist.
8. Drücken Sie die Taste Testimpedanzen auf der linken Seite des Softwarefensters und stellen Sie sicher, dass die richtigen Einstellungen verwendet werden (Einstellungen: Testfrequenz: 1.004 Hz, Zyklen: 100, Pause: 0). Drücken Sie die Taste Testspitze unten rechts. Speichern Sie diese Ergebnisse zum späteren Nachschlagen. Wenn Sie eine Sonde mit mehreren Schäften verwenden, stellen Sie sicher, dass dieser Schritt für jeden Schaft wiederholt wird.
   HINWEIS: Vergleichen Sie die Werte nach der Galvanisierung mit den Werten vor der Galvanisierung. Die Impedanzwerte sollten abnehmen.
9. Bei kontinuierlichem Gebrauch können die Sonden nach 6 Monaten einen Anstieg der Impedanzwerte aufweisen. Wenn Bedenken hinsichtlich der Impedanzwerte des Aufzeichnungssignals bestehen, testen Sie die Sondenimpedanzen gemäß Schritt 3 erneut. Wenn sich die Impedanzwerte gegenüber den Ausgangswerten erhöht haben, wiederholen Sie die Galvanik (Schritt 6).

3. Chirurgische Platzierung der Kopfkappe, der Kammern und der Kraniotomie (Abbildung 3A-C)

HINWEIS: In dieser Arbeit wurde das Tier am Ende der Studie unter Isofluran betäubt und erhielt intramuskuläre (IM) Injektionen von Ketamin, gefolgt von einer intraperitonealen (IP) Injektion von Euthasol. Das Gehirn wurde nach transkardialer Perfusion mit Kochsalzlösung gefolgt von 10% Formalin extrahiert.

1. Trainieren Sie die Weißbüschelaffen (mindestens 1,5 Jahre alt) 3,9,10,11 2 Monate vor der Operation auf einem kleinen Primatenstuhl nach den zuvor beschriebenen Methoden.
2. Am Tag der Operation induzieren Sie die Probanden mit einer intramuskulären (i.m.) Injektion von Ketamin (5-15 mg/kg)/Dexdormitor (0,02-0,1 mg/kg) (und Midazolam mit 0,25 mg/kg als Muskelrelaxans) und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie basierend auf Herzfrequenz, Atmung und Zehenklemmreflex. Intubieren Sie die Tiere für die kontinuierliche Verabreichung von Isofluran (0,5 % bis 2 % in 100 % Sauerstoff) während der gesamten Operation und überwachen Sie ihre Vitalwerte. Verwenden Sie während der Operation Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
3. Nachdem die Chirurgen sterile PSA angelegt haben, bereiten Sie ein steriles Operationsfeld mit sterilen Abdecktüchern vor, um die Oberflächen und das Operationsfeld abzudecken. Lassen Sie die Chirurgen mit aseptischen Techniken eine Acrylkopfkappe mit Titanstiften und Schrauben implantieren, um den Kopf mit Methoden zu stabilisieren, die zuvor von Nummela et ^al.11 ausführlich beschrieben wurden.
4. Planen Sie während der Implantatoperation die Platzierungen der Aufnahmekammern über den interessierenden Bereichen (z. B. visuelle Bereiche, mittlerer temporaler Bereich [MT] und primärer visueller Kortex [V1]) basierend auf stereotaktischen Koordinaten¹².
5. Legen Sie ein Erdungskabel an.
   1. Bohren Sie zunächst ein 1,1 mm Bohrloch in den Schädel in der Nähe des Bereichs der geplanten Aufnahmekammer. Biegen Sie einen 36-G-Edelstahldraht etwa 0,075-1 mm von der Spitze entfernt und schieben Sie den gebogenen Teil des Drahtes zwischen Schädel und Dura in den Boden des Bohrlochs.
   2. Versiegeln Sie den Draht und das Loch zunächst mit Knochenwachs und dann mit Zement und Acryl, wenn Sie die Kammern platzieren. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Teil draußen in der Nähe der Kammer lassen, um ihn zur Erdung zu befestigen.
6. Nachdem Sie eine Basisschicht aus schnell haftendem Zement aufgetragen haben, um die gesamte Fläche der Aufnahmestelle und des Erdungskabels abzudecken, kleben Sie die Aufnahmekammern (bestehend aus kundenspezifischen 3D-gedruckten Teilen) mit dem schnell klebenden Zement auf den Schädel und verstärken Sie sie beim Bau des Kopfimplantats mit Acryl.
7. Verschließen Sie die Kammern mit einer 3D-gedruckten Kammerkappe, die so konzipiert ist, dass sie eng in die Kammer passt (und nicht von Käfigkameraden entfernt werden kann, die mit dem Subjekt gepaart untergebracht sind).
   1. Geben Sie mit den mitgelieferten Mischkanülen eine kleine Menge Silikonelastomer (silastisch) um die Innenkanten der Kammer herum und setzen Sie dann die Kammerkappe ein, bis sie bündig mit den Außenwänden der Kammer abschließt.
   2. Die Kammern sind mit Zugangslöchern (1 mm Durchmesser) auf beiden Seiten der Kammer ausgestattet, um sicherzustellen, dass die Kammerkappe leicht entfernt werden kann. Verwenden Sie Silastik, um diese Zugangslöcher abzudichten, was zu einer luftdichten Kammerabdichtung führt.
      Anmerkungen: Um die Kammerkappen zu entfernen, entfernen Sie zuerst mit einer Pinzette die silastische Abdichtung der Zugangslöcher, um die luftdichte Abdichtung der Kammer zu brechen. Dann kann ein Stift verwendet werden, um die Kammerkappe aus der Kammer zu hebeln.
8. Erholen Sie die Tiere aus der Narkose und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Behandeln Sie die Tiere postoperativ 7 Tage lang mit Antibiotika (Amoxicillin-Clavulansäure bei 13,75 mg/kg) und 3 Tage lang mit Entzündungshemmern (Meloxicam bei 0,1 mg/kg). Geben Sie Schmerzmittel mit langsamer Freisetzung vor der Genesung bis 72 Stunden nach der Operation und halten Sie die Tiere bis zur vollständigen Genesung selbstständig unter.
9. Beginnen Sie zwei bis drei Wochen nach der Operation mit dem Training der Kopfstütze und des Sehverhaltens. Setzen Sie den Weißbüschelaffen in einen Primatenstuhl und gewöhnen Sie sich an die Kopfstütze. Sobald Sie sich wohl fühlen, trainieren Sie den Weißbüschelaffen, mehrere grundlegende Aufgaben auszuführen, einschließlich der zentralen visuellen Fixierung¹³ und einer Sakkadenaufgabe in Richtung eines peripher erkannten Gabor-Gitters, das zur Messung seiner Sehschärfe verwendet wird¹¹.
10. Führen Sie nach ausreichendem Verhaltenstraining eine Kraniotomie in der Aufnahmekammer durch. Führen Sie bei sterilen Techniken eine zweite Operation durch, um eine Kraniotomie (2-3 mm Durchmesser) in der Aufnahmekammer über dem interessierenden Bereich (z. B. Bereich MT) zu erstellen. Versiegeln Sie die Kraniotomie mit einer dicken Anwendung von Silastic von etwa 1 mm oder der Tiefe der Kraniotomie, um das Gehirn vor Infektionen zu schützen und das Granulationswachstum^{zu reduzieren 14}. Stellen Sie sicher, dass die silastische Dichtung Kanten hat, die an allen Seiten mindestens 2 mm oder mehr des Zahnzements greifen. Setzen Sie die Kammerkappe wie in Schritt 7 beschrieben wieder auf.
11. Wenn in den Tagen nach der Operation Blutungen auftreten oder aus der silastischen Dichtung klare Flüssigkeiten austreten, muss die Kammer gereinigt werden.
    1. Wenn die silastische Versiegelung intakt ist, verwenden Sie sterile Techniken, um sie mit 10% Betadin zu reinigen, und waschen Sie sie mit steriler Kochsalzlösung, bevor Sie die Versiegelung entfernen. Wenn die silastische Versiegelung nicht intakt ist, reinigen Sie sie nur mit steriler Kochsalzlösung unter sterilen Techniken.
    2. Sobald das Silastic entfernt ist, spülen Sie die Dura mehrmals mit steriler Kochsalzlösung und trocknen Sie sie mit einem Wattestäbchenapplikator. Trocknen Sie die Kammer gründlich mit einem Wattetaschenapplikator ab, bevor Sie eine neue Schicht Silastic auftragen. Typischerweise stabilisiert sich die Kammer und bleibt nach einigen Tagen bis 1 Woche trocken und dicht.
12. Sobald sich die Kraniotomie stabilisiert hat und keine Anzeichen von Blutungen zeigt, führen Sie einen Duralkratzer durch, um überschüssiges Gewebe über der Dura zu entfernen. Tragen Sie dann eine dünne Schicht (<1 mm) Silastic auf (dünn genug, um den Durchgang der Elektroden für Aufnahmen zu ermöglichen) und verwenden Sie einen 1/4-Gratbohrer, um das Silastic über die Wände der Kraniotomie zu leiten, wie in Abbildung 3C gezeigt, um es mechanisch zu kaufen.
    HINWEIS: Dies ermöglicht auch eine einfachere Entfernung zu Reinigungszwecken. Die Silastik kann für die Dauer der Studie an Ort und Stelle bleiben und zur Aufzeichnung mit linearen Array-Elektroden punktiert werden.

4. Aufbau der neurophysiologischen Aufzeichnung (Abbildung 3D-F)

HINWEIS: Die Schritte zum Umgang mit Tieren variieren je nach Labor und Experiment. Die folgenden Schritte sind spezifisch für die Platzierung des Mikrolaufwerks und die Durchdringung der Dura für die Aufnahmen.

1. Entfernen Sie die Kappe von der Aufnahmekammer (beschrieben in Abschnitt 3, Schritt 7.2). Legen Sie die Kappe in 91%igen Isopropylalkohol, um sie während der Aufnahme einzuweichen. Stellen Sie sicher, dass die Ränder der Kammer frei von Silastik sind. Wenn Silastic an den Rändern der Kammer verbleibt, sitzt das Mikrolaufwerk nicht richtig.
2. Die Basis des Mikroantriebs hat drei Schrauben zum Anziehen an der Kammer am Tier. Normalerweise werden diese Schrauben um eine Schutzhülle angezogen, die die gleiche Größe wie die Kammer hat, um die Silikonsonde im Inneren vor Stößen zu schützen.
   1. Lösen Sie zunächst mit dem Schraubendreher die drei Schrauben, mit denen die Schutzhülle über der Silikonsonde befestigt ist, und entfernen Sie vorsichtig die Hülse. Befestigen Sie das Mikrolaufwerk an der Aufnahmekammer und achten Sie darauf, dass die Siliziumelektroden nicht an den Wänden der Kammer stoßen (Abbildung 3D, E).
   2. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich die Elektroden in einer vollständig eingefahrenen Position befinden, bevor Sie den Antrieb auf die Kammer setzen, so dass sie bei der ersten Platzierung weit über dem Kortex sitzen.
3. Ziehen Sie nach dem Einsetzen mit dem Schraubendreher jede Schraube an der Seite des Mikrolaufwerks fest (Abbildung 3F). Wählen Sie eine Bestellung zum Anziehen der Schrauben und verwenden Sie diese jedes Mal, um die Stabilität an der Stelle zu erhalten. Forscher möchten möglicherweise auch die Anzahl der Umdrehungen zählen, wenn sie die Schrauben zunächst lösen, um sie um einen ähnlichen Betrag anzuziehen. Überprüfen Sie, ob die Sonde locker ist, und ziehen Sie sie bei Bedarf fest, aber achten Sie darauf, die Schraubengewinde im Kunststoff nicht durch zu festes Anziehen abzuisolieren.
4. Sobald der Mikroantrieb an der Kammer befestigt ist, verlegen Sie alle erforderlichen Erdungskabel.
   HINWEIS: Lassen Sie die Kopfstufe über Nacht in den Anschluss eingesteckt und stecken Sie das SPI-Kabel (Serial Peripheral Interface) nur für Aufnahmen in die Kopfstufe, da es schwierig ist, die Kopfstufe in den Anschluss einzustecken, während sie sich am Tier befindet.
5. Stecken Sie das SPI-Kabel vorsichtig in die Kopfstufe (bereits mit der Sonde verbunden). Achten Sie darauf, den Draht nicht zu verbiegen. Verstärken und digitalisieren Sie alle neurophysiologischen Daten aus dem Kopfstadium bei 30 kHz mit der Open-Ephys-GUI (https://github.com/open-ephs/plugin-GUI). Hochpassfilter des Breitbandsignals von der Kopfstufe bei 0,1 Hz. Korrigieren Sie die Phasenverschiebungen dieser Filterung, wie zuvor^{beschrieben 15}. Verarbeiten Sie bei linearen Arrays die resultierenden Ablaufverfolgungen durch Verweisung auf den allgemeinen Durchschnitt vor.
6. Geben Sie die Kanalzuordnung für das jeweilige Elektrodenarray ein, das im Aufzeichnungssystem verwendet wird, sodass die während der Aufnahme dargestellten Kanäle in der Hochpassfilter-Aufzeichnungssignalansicht nach Tiefe sortiert werden. Diese Ansicht wird beim Vor- und Zurückfahren der Elektrode verwendet.

5. Durchführung des neurophysiologischen Aufzeichnungsexperiments (Abbildung 4)

HINWEIS: Hier wird das Verfahren zum Absenken der Elektrodenarrays in den Kortex beschrieben; Diese Methode wurde optimiert, um übermäßige Grübchen des darunter liegenden Gewebes zu vermeiden. Eine Zunahme des Rauschens in den elektrophysiologischen Aufzeichnungen liefert einen guten Hinweis auf Grübchen, bevor sie in die Silastik eindringen und in das Gehirn gelangen. Im Gehirn angekommen, kann der Forscher bei zu vielen Grübchen bemerken, dass sich Einheiten auf der Sonde verschieben, auch ohne die Manipulation des Antriebs (Einheiten bewegen sich allmählich in der Tiefe über die Kanäle), oder alternativ kann der Forscher eine Unterdrückung der neuronalen Aktivität bemerken, insbesondere an oberflächlichen Stellen auf der Sonde. Unter diesen Bedingungen wird das Laufwerk eingefahren, um Grübchen zu lindern und bessere Aufnahmen zu ermöglichen.

1. Senken Sie die Siliziumsonde mit der Schraubsteuerung am Mikroantrieb ab und machen Sie alle 1-2 s eine Umdrehung (250 μm), bis Einheiten an der Array-Spitze beobachtet werden.
   HINWEIS: Während des Eindringens der über die Dura gelegten Silastik kann ein geringfügiger Anstieg des Geräusches beobachtet werden. Die Schäfte werden die Silastik vor dem Durchspringen einlösen, was das Rauschen auf der Sonde erhöhen kann. Ein schneller Abstieg bis zum ersten Anzeichen von Einheiten hilft beim Eindringen in die silastische Schicht.
2. Sobald die ersten Neuronen beobachtet wurden, ziehen Sie eine Umdrehung des Mikroantriebs (250 μm) zurück, um die Eintrittsgeschwindigkeit zu verringern, wenn die Elektrode beginnt, durch die Silastik und Dura in das kortikale Gewebe zu springen. Wenn die Elektrode im Laufe der Zeit ohne Mikromanipulation weiter in das Gewebe vorzudringen scheint, ziehen Sie eine zusätzliche Drehung zurück, um den Druck von der Sonde zu entlasten, die auf die Silastic und das darunter liegende Gewebe drückt.
   HINWEIS: Es sollte möglich sein, die Position von Neuronen zu verfolgen, wenn die richtige Kanalkarte für das lineare Array geladen wurde (die Kanäle werden nach ihrer Tiefe relativ zum Kortex geordnet angezeigt).
3. Fahren Sie das Array sehr langsam in den Kortex hinein und bewegen Sie sich über eine Dauer von 20-30 Minuten um etwa vier bis sechs Umdrehungen (1-1,5 mm), bis die Neuronen gleichmäßig über die Länge der Sonde verteilt sind.
4. Ziehen Sie das Array langsam um ein bis zwei Umdrehungen (0,25-0,5 mm) zurück, um den Druck auf das Gewebe zu verringern, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen.
   HINWEIS: Neuronen wechseln während dieser Retraktion normalerweise nicht die Kanalposition auf dem linearen Array, was darauf hindeutet, dass sie in erster Linie dazu dient, den Druck auf das Gewebe zu reduzieren. Ohne Retraktion kann während der Aufzeichnung eine kontinuierliche Array-Verschiebung beobachtet werden, wenn sich das Gewebe entspannt, wodurch die Aufnahmestabilität gestört wird (Abbildung 4C).
5. Warten Sie nach dem Einfahren 20 Minuten, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen. Dadurch wird die Bewegungsmenge in der Aufnahme begrenzt. Nutzen Sie diese Zeit, um sich auf die Aufnahme vorzubereiten (d. h. das Eye-Tracking zu kalibrieren und die Stimulus-Präsentationssysteme vorzubereiten).
6. Wählen Sie Aufzeichnen in der Aufnahmesoftware.
7. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, wählen Sie erneut die Aufzeichnungsschaltfläche aus. Dadurch wird die vollständige Aufnahmedatei am ausgewählten Ziel erstellt. Stellen Sie sicher, dass die Datei korrekt gespeichert wurde, bevor Sie fortfahren.
8. Beginnen Sie langsam, das Array mit einer ähnlichen Geschwindigkeit wie zuvor aus dem Kortex zurückzuziehen (vier bis sechs Umdrehungen über eine Dauer von 20-30 Minuten). Stellen Sie sich vor, wie sich die Sonde zurückzieht, indem Sie beobachten, wie sich die Neuronen entlang der Sonde bewegen. Nach dem Zurückziehen um die Anzahl der Windungen seit dem ersten Sehen von Neuronen und wenn keine Neuronen mehr auf der Sonde beobachtet werden, fahren Sie schneller zurück, bis Sie in die vollständig eingefahrene Ausgangsposition zurückkehren.
9. Um die Sonde aus der Aufnahmekammer zu entfernen, führen Sie die Schritte 1-3 in Abschnitt 4 in umgekehrter Reihenfolge aus (d. h. führen Sie zuerst Schritt 3, gefolgt von Schritt 2 und dann Schritt 1 aus).
10. Sobald die Sonde aus der Aufnahmekammer entfernt wurde, weichen Sie sie 20 Minuten lang in Kontaktlinsenlösung ein, um Gewebe oder Blut von der Elektrode zu entfernen. Legen Sie die Sonde anschließend 1 Minute lang in Alkohol, um die Kontaktlinsenlösung zu entfernen, und lassen Sie die Elektrode trocknen.
11. Verwenden Sie Kilosort2, um die Array-Daten nach der anfänglichen Filterung aus dem Aufzeichnungssystem zu sortieren (wie weiter oben in Abschnitt 4, Schritt 5 beschrieben).
    1. Beschriften Sie die Ausgaben der Spike-Sortieralgorithmen manuell mit der GUI "phy" (https://github/kwikteam/phy). Klassifizieren Sie die Geräte mit winzigen oder physiologisch unplausiblen Wellenformen als Rauschen und schließen Sie sie aus.
    2. Wenn Sie laminare Sonden verwenden, zeigen Sie die Spike-Wellenformen über jeden Kanal an, um sicherzustellen, dass einzelne Einheiten auf dem Kanal mit der Spitzenwellenform gekennzeichnet sind (Abbildung 5A). Schließen Sie nur Einheiten ein, die klare Cluster im PCA-Raum, weniger als 1 % Verletzungen des Inter-Spike-Intervalls und zweiphasige Spike-Wellenformen aufweisen (die auf benachbarte Kanäle auf dem linearen Array lokalisiert werden sollten). Ein Beispiel für eine einzelne Einheit ist in Abbildung 5B dargestellt, die klare Cluster im PCA-Bereich (oben rechts) und Stabilität im Zeitverlauf (unten rechts) zeigt.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein X-Y-Elektrodentisch (Abbildung 1) gebaut wird, der das Anvisieren von Stellen im Submillimeterbereich ermöglicht und eine zuverlässige Positionierung über separate Aufnahmesitzungen hinweg aufrechterhält. Die Zuverlässigkeit der X-Y-Positionierung ist in Abbildung 6 dargestellt, die zeigt, dass zwei Aufnahmesitzungen, die im Abstand von einer Woche durchgeführt wurden, eine Überlappung von 70,8 % in ihren mittleren HF-...

Diskussion

Derzeit stehen mehrere Methoden (z. B. chronisch, semichronisch, akut) zur Verfügung, um neurophysiologische Experimente an nicht-menschlichen Primaten durchzuführen. Der Weißbüschelaffe stellt aufgrund seiner geringen Größe und des Fehlens von Windungen als anatomische Orientierungspunkte einzigartige Herausforderungen für neurophysiologische Experimente dar. Dies erfordert, dass die Forscher neurophysiologische Orientierungspunkte wie die Retinotopie und die Tuning-Eigenschaften von Interessengebieten verwenden,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachement for dremmel	Dremmel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedence Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instuments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html