Electrophysiology of Laminar Cortical Activity in the Common Marmoset

요약

맞춤형으로 제작된 마이크로 드라이브는 선형 실리콘 어레이를 사용하여 피질 기록 부위를 밀리미터 미만으로 타겟팅할 수 있습니다.

초록

마모셋 원숭이는 매끄러운 피질 표면으로 인해 층류 피질 회로를 검사하는 데 이상적인 모델을 제공하며, 이는 선형 배열로 기록을 용이하게 합니다. 마모셋은 다른 영장류와 유사한 신경 기능 조직과 기록 및 이미징에 대한 기술적 이점으로 인해 최근 인기를 얻고 있습니다. 그러나 이 모델의 신경 생리학은 크기가 작고 해부학적 랜드마크인 자이리가 없기 때문에 몇 가지 고유한 문제를 제기합니다. 연구원들은 맞춤형 마이크로 드라이브를 사용하여 선형 어레이 배치를 밀리미터 미만의 정밀도로 조작하고 녹화일 동안 동일한 망막국소 목표 위치에서 안정적으로 기록할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마이크로 드라이브 포지셔닝 시스템의 단계별 구성과 실리콘 선형 전극 어레이를 사용한 신경 생리학적 기록 기술을 설명합니다. 기록 세션 전반에 걸쳐 전극 배치를 정밀하게 제어함으로써 연구원은 피질을 쉽게 가로질러 망막 조직과 기록된 뉴런의 조정 특성을 기반으로 관심 영역을 식별할 수 있습니다. 또한, 이 층류 어레이 전극 시스템을 사용하여 전류 소스 밀도 분석(CSD)을 적용하여 개별 뉴런의 기록 깊이를 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 어레이의 여러 채널에 걸쳐 있는 Kilosort에서 분리된 스파이크 파형을 포함하여 층류 기록의 예를 보여줍니다.

서문

마모셋(Callithrix jacchus)은 최근 몇 년 동안 뇌 기능을 연구하는 모델로 빠르게 인기를 얻고 있습니다. 이러한 인기의 증가는 마모셋의 매끄러운 피질의 접근성, 인간 및 다른 영장류와의 신경 기능 조직의 유사성, 작은 크기와 빠른 번식 속도¹ 때문입니다. 이 모델 유기체의 인기가 높아짐에 따라 마모셋 뇌에 사용하기에 적합한 신경 생리학적 기술이 급속히 발전했습니다. 전기 생리학 방법은 설치류와 영장류의 피질에서 단일 뉴런의 활동을 연구하기 위해 신경 과학에서 널리 사용되어 비교할 수 없는 시간 해상도와 위치 액세스를 제공합니다. 마모셋 원숭이가 시각 신경 과학의 모델로서 상대적으로 참신하기 때문에 깨어 있는 행동 전기 생리학 기술의 최적화는 여전히 진화하고 있습니다. 이전 연구에서는 마취 제제2에서 전기생리학을 위한 강력한 프로토콜의 확립을 보여주^{었으며, 초기} 각성 행동 신경생리학 연구는 단일 채널 텅스텐 선택극물³의 신뢰성을 보여주었다. 최근 몇 년 동안 연구자들은 깨어 있는 신경 생리학을 위한 실리콘 기반 미세 전극 어레이의 사용을 확립했습니다⁴. 그러나 마모셋은 뇌 크기가 작고 해부학적 랜드마크가 없기 때문에 독특한 표적 지정 문제를 제기합니다. 이 프로토콜은 실리콘 선형 어레이를 사용하여 조직 손상을 최소화하면서 대규모 뉴런 집단을 기록할 수 있는 마모셋에 적합한 마이크로 드라이브 기록 시스템을 구성하고 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마모셋을 다루는 것은 더 큰 영장류에 비해 시각 피질의 망막 지도의 규모가 작기 때문에 도전이 됩니다. 전극을 1mm만 조금만 이동해도 맵이 크게 바뀔 수 있습니다. 더욱이, 연구자들은 시각 피질에서 더 넓은 범위의 망막 위치를 얻기 위해 기록 세션 사이의 전극 배치를 변경해야 하는 경우가 많습니다. 현재의 반만성 제제는 매일 또는 서브 밀리미터 스케일에서 특정 위치를 표적으로 삼을 수 있을 만큼 충분히 정밀하게 전극 위치를 조정할 수 없다⁵. 이를 염두에 두고, 제안된 마이크로 드라이브 시스템은 경량 마이크로 드라이브를 기록 챔버에 장착하고 피질 부위의 서브 밀리미터 표적화를 허용하는 X-Y 전극 스테이지를 활용합니다. 이동 가능한 X-Y 단계 구성 요소는 피질 영역을 체계적으로 횡단하기 위해 선형 어레이의 수직 및 수평 이동을 허용하며, 이는 관심 영역을 식별하는 데 필요합니다(망막도 및 튜닝 특성을 통해 ). 녹화 세션 전반에 걸쳐 연구원은 X-Y 스테이지를 수동으로 조정하여 해당 영역 내에서 대상 부위를 이동할 수도 있습니다. 이는 쉬운 전극 표적화 메커니즘을 갖지 않는 반만성 기록 제제를 사용하는 대체 기술에 비해 주요 이점입니다.

마이크로 드라이브는 피질로 낮추기 위해 다양한 실리콘 어레이를 장착할 수 있는 다목적 도구입니다. 이 프로토콜에서는 200μm 간격으로 두 개의 32채널 선형 어레이가 있는 맞춤형 프로브를 사용하여 피질 깊이에 걸쳐 있는 층류 회로를 조사했습니다. 신경 회로를 조사하는 대부분의 방법은 일반적으로 대뇌 피질의 모든 층에 걸쳐 평균화된 전위 또는 단일 단위를 샘플링합니다. 그러나 최근의 연구는 대뇌 피질의 층류 미세회로(cortical laminar microcircuits)⁶에 대한 흥미로운 발견을 밝혀냈다. 마이크로 드라이브를 활용하여 연구원들은 층류 프로브를 사용하고 기록 깊이를 미세 조정하여 모든 레이어에서 포괄적인 샘플링을 보장할 수 있습니다.

이 시스템은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소로 구성할 수 있으며 다양한 실험 기술 또는 프로브에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 준비의 주요 장점은 밀리미터 미만의 정밀도로 X-Y 기록 위치를 변경하고 피질 내에서 기록의 깊이를 제어할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 X-Y 스테이지 마이크로 드라이브 및 신경 생리학 기록 기술을 구성하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

프로토콜

실험 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)를 따랐다. 실험 및 행동 절차에 대한 프로토콜은 로체스터 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 기록용 전극을 포함하는 마이크로 드라이브의 구성(그림 1)

알림: 다중 채널 선형 실리콘 어레이를 고정하는 맞춤형 X-Y 스테이지를 사용하면 녹음 부위를 밀리미터 미만으로 타겟팅할 수 있습니다.

1. 그림 1에 나와 있는 모든 마이크로 드라이브 부품을 모으십시오. 투명 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 플라스틱을 사용하여 맞춤형 부품을 3D 프린팅합니다. 여기에는 보호 슬리브, 베이스, X 스테이지 및 Y 스테이지가 포함됩니다. 3D 부품 설계는 온라인(https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html)에서 사용할 수 있습니다. 또한 전극, 플라스틱 직사각형 플랫폼, 그리드, 마이크로 매니퓰레이터, 강철 튜브 및 6개의 스테인리스 스틸 나사(나사 크기: 00)를 모으십시오.
   1. 다이아몬드 휠 절단 부착물이 있는 회전 도구를 사용하여 4mm x 3mm 구멍 간격으로 플라스틱 그리드의 3mm x 1mm 섹션을 잘라냅니다.
   2. 에폭시를 사용하여 작은 컷아웃 그리드 섹션을 Y-스테이지 상단에 고정합니다. 그런 다음 나사로 해당 그리드 위에 마이크로 드라이브를 끼웁니다. 안정성을 위해 바닥에 에폭시를 추가하십시오.
   3. 3D 프린팅된 소형 직사각형 플랫폼을 에폭시가 있는 28G 강철 튜브에 부착합니다. 이것은 실리콘 전극을 고정하기 위한 향후 단계에서 사용될 것입니다.
   4. 그리드를 통해 23G 가이드 튜브를 끼웁니다. 그런 다음 플라스틱 플랫폼에 부착된 강철 튜브를 23G 가이드 튜브를 통해 끼웁니다. 28G 강철 튜브를 마이크로 드라이브의 슬롯 중 하나에 넣습니다.
   5. 그런 다음 스테인리스 스틸 육각 나사(크기: 00, 길이: 1/8인치)를 사용하여 3D 부품(베이스, X 스테이지, Y 스테이지)을 조립하여 드라이브 베이스를 만듭니다.
      1. 먼저 손으로 두드리는 도구를 사용하여 베이스와 X 스테이지 모두에 미리 만들어진 나사 구멍을 두드립니다. 그런 다음 X의 긴 슬롯을 통해 4개의 나사를 삽입하여 시작하십시오.tage는 베이스에 미리 만들어진 해당 나사 구멍에 고정합니다.
      2. 이동식 Xtage가 베이스에 고정되면 Y의 긴 슬롯을 통해 두 개의 나사를 삽입합니다.tage, X의 미리 만들어진 나사 구멍에 고정tage.
         알림: X 둘 다tage 및 Y stage는 나사가 완전히 조여질 때까지 움직일 수 있어야 합니다.
2. 마이크로 매니퓰레이터 드라이브에 전극 커넥터를 부착하기 위한 플라스틱 플랫폼과 전극을 고정하기 위한 확장 폴리이미드 튜브가 장착되어 있는지 확인합니다. 테이프를 사용하여 64핀 커넥터를 마이크로 매니퓰레이터의 플랫폼에 연결합니다.
3. 미세 매니퓰레이터의 플라스틱 튜브에 바시트라신(멸균 연고)을 조심스럽게 바르고 유연한 리본 케이블을 통해 64핀 커넥터에 연결된 전극을 부착합니다.
4. 마이크로 매니퓰레이터 드라이브를 사용하여 실리콘 전극과 커넥터를 고정하고 Y-s의 구멍을 통해 플라스틱 튜브를 끼웁니다.tage. 전극은 se 아래에 매달려 있습니다.tage 프로브의 플라스틱 직사각형 플랫폼에 부착되기를 기다립니다(7단계, 섹션 1).
5. 마이크로 매니퓰레이터 드라이브에서 64핀 커넥터를 분리하고 접착제 젤을 사용하여 커넥터를 X-s의 플랫폼에 고정합니다.tage 접착제가 커넥터를 제자리에 고정하면 커넥터의 결합을 강화하기 위해 추가 에폭시를 추가할 수 있습니다. 하룻밤 동안 말리십시오.
6. 플라스틱 튜브에서 전극을 조심스럽게 분리하고 어셈블리에서 미세 조작기 드라이브를 제거합니다.
   알림: 이 시점에서 드라이브는 도움의 손길의 앨리게이터 클립으로만 고정되며 전극은 드라이브 구조 내에서 고정되어 있지 않습니다.
7. 앨리게이터 클립을 조심스럽게 움직여 드라이브를 뒤집어 고정되지 않은 전극을 확인합니다. 뭉툭한 팁 집게를 사용하여 전극을 Y 단계 아래의 플라스틱 홀더에 놓고 소량의 실리콘 엘라스토머(실라스틱)로 고정합니다. 접착제가 경화될 때까지 5분 동안 기다리십시오.
8. 마이크로 드라이브의 나사 컨트롤을 사용하여 전극을 집어넣습니다.
9. 마이크로 드라이브의 전극 위에 보호 슬리브를 놓습니다. 이 보호 슬리브는 맞춤 인쇄된 기록 챔버와 크기가 동일하며 드라이브 어셈블리의 베이스에 단단히 고정됩니다.
10. 일자 드라이버를 사용하여 마이크로 드라이브의 베이스 구성요소에 있는 3개의 측면에 있는 나사를 조여 보호 슬리브를 제자리에 고정합니다. 녹음에 사용되는 헤드 스테이지를 64핀 커넥터에 연결합니다.

2. 전체 임피던스를 줄이기 위한 전극의 폴리트로드 도금 (그림 2)

알림: 최상의 녹음 품질을 위해 실리콘 전극 어레이를 폴리(3,4-에틸렌디옥시티오펜) 용액(PEDOT)으로 전극 도금하는 것이 유용합니다. 이 방법은 신호 대 잡음비 ^7,8을 증가시키는 것으로 나타났습니다.

1. PEDOT 용액을 만들려면 0.075mL의 3,4-에틸렌디옥시티오펜(EDOT)과 1.4g의 폴리(나트륨 4-스티렌설포네이트)(PSS)를 증류수 70mL에 혼합합니다. 구성 요소가 완전히 용해되도록 이 용액을 간략하게 소용돌이치십시오. 최상의 용해를 위해 사용 전날 이 용액을 혼합하십시오.
2. 임피던스 테스터 소프트웨어(재료 표 참조)를 실행한 후 선택한 전극 준비로 설정을 준비합니다. 소프트웨어 창의 왼쪽 상단에 있는 상단 드롭다운 메뉴를 사용하여 사용 중인 어댑터(N2T A32)를 선택합니다. 두 번째 드롭다운 메뉴를 사용하여 사용 중인 전극(NLX-EIB-36)을 선택합니다. 전극이 풀다운 메뉴에 나열되지 않으면 새 전극을 정의하는 방법에 대한 설명서를 참조하십시오. 채널 수가 올바른지 확인하십시오.
3. 커넥터를 통해 프로브를 임피던스 테스터 시스템에 연결하고 프로브를 접지된 식염수로 내려 기준선 판독값을 얻습니다.
   1. 임피던스 테스터 시스템에서 왼쪽의 임피던스 테스트 버튼을 누르고 올바른 설정(설정: 테스트 주파수: 1,004Hz, 주기: 100, 일시 중지: 0)을 확인합니다. 그런 다음 오른쪽 하단의 테스트 프로브 버튼을 누릅니다.
   2. 임피던스 테스터가 실행되면 프로브 보고서 창이 나타나 결과를 스프레드시트에 저장합니다. 전극의 양쪽 섕크에 대해 나중에 참조할 수 있도록 이 결과를 저장하십시오(임피던스 테스터와 함께 사용하기 위해 전극을 비커에 장착하는 것은 그림 2D에 나와 있음). 여러 개의 섕크가 있는 프로브를 사용하는 경우 각 섕크에 대해 3단계를 반복해야 합니다.
4. 비커를 고정하는 받침대(예: 실험실 잭)를 내려 식염수에서 프로브를 제거합니다. 비커 유체를 증류수로 교체하십시오. 실험실 잭을 올려 전극을 잠그고 남은 식염수를 헹구고 실험실 잭을 다시 내립니다.
5. 비커의 증류수를 PEDOT 용액으로 교체하고 전극이 용액에 잠길 때까지 랩 잭을 올립니다.
6. 소프트웨어 창의 왼쪽에 있는 DC 전기 도금 버튼을 선택하고 올바른 설정이 사용되었는지 확인합니다(설정: 자동 도금: 0.004μA, 350Hz, 지속 시간: 5, 일시 중지: 1). 그런 다음 오른쪽 하단의 자동 도금 버튼을 누릅니다. 다시 한 번, 전기 도금 결과와 함께 프로브 보고서 창이 나타납니다. 나중에 참조할 수 있도록 이 결과를 저장합니다. 여러 섕크가 있는 프로브를 사용하는 경우 각 섕크에 대해 이 단계를 반복해야 합니다.
7. 랩 잭을 내려 PEDOT 용액에서 프로브를 제거하고 이전에 수행한 대로 증류수로 프로브를 헹굽니다(4단계). 헹군 후 비커에 식염수를 채우고 전극이 잠길 때까지 랩 잭을 올립니다.
8. 소프트웨어 창의 왼쪽에 있는 테스트 임피던스 버튼을 누르고 올바른 설정이 사용되었는지 확인합니다(설정: 테스트 주파수: 1,004Hz, 주기: 100, 일시 중지: 0). 오른쪽 하단의 테스트 프로브 버튼을 누릅니다. 나중에 참조할 수 있도록 이 결과를 저장합니다. 여러 섕크가 있는 프로브를 사용하는 경우 각 섕크에 대해 이 단계를 반복해야 합니다.
   알림: 전기도금 후 값과 전기 도금 전 값을 비교합니다. 임피던스 값이 감소해야 합니다.
9. 프로브를 계속 사용하면 6개월 후에 임피던스 값이 증가할 수 있습니다. 기록 신호의 임피던스 값이 우려되는 경우 3단계에 따라 프로브 임피던스를 다시 테스트하십시오. 임피던스 값이 초기 값에서 증가하면 전기 도금을 반복합니다(6단계).

3. 헤드 캡, 챔버 및 개두술의 외과적 배치(그림 3A-C)

참고: 이 연구에서는 연구가 종료될 때 동물을 이소플루란으로 마취하고 케타민을 근육내(IM) 주사한 후 유타솔을 복강내(IP) 주사했습니다. 뇌는 식염수와 10% 포르말린을 사용한 심 경관류 후 적출되었습니다.

1. 마모셋(최소 1.5세)이 수술 2개월 전에 앞서 설명한 방법 ^3,9,10,11에 따라 작은 영장류 의자에 앉도록 훈련시킵니다.
2. 수술 당일에는 케타민(5-15mg/kg)/덱스도미토(0.02-0.1mg/kg)(근육이완제로 미다졸람 0.25mg/kg)를 근육주사(i.m.) 주사하여 피험자를 유도하고 심박수, 호흡, 발가락 꼬집기 반사를 기반으로 적절한 마취를 확인합니다. 수술 내내 지속적인 이소플루란(100% 산소에서 0.5%-2%)을 투여하기 위해 동물을 삽관하면서 바이탈을 모니터링합니다. 수술 중 눈에 동물용 연고를 사용하여 마취 중 건조함을 방지하십시오.
3. 외과의가 멸균 PPE를 착용한 후 멸균 드레이프를 사용하여 표면과 수술 부위를 덮을 멸균 수술 부위를 준비합니다. 무균 기술을 사용하여 외과의가 티타늄 기둥과 나사가 있는 아크릴 헤드 캡을 이식하여 이전에 Nummela et ^al.11이 자세히 설명한 방법을 사용하여 머리를 고정하도록 합니다.
4. 임플란트 수술 동안, 입체 좌표¹²에 기초하여 관심 영역(예: 시각 영역, 중간 측두엽 영역[MT] 및 일차 시각 피질[V1])에 대한 기록실 배치를 계획한다.
5. 접지선을 놓습니다.
   1. 계획된 녹음실 영역 근처의 두개골에 1.1mm 버 구멍을 뚫는 것으로 시작합니다. 팁에서 약 36-0.075mm 떨어진 곳에 1G 스테인리스 스틸 와이어를 구부리고 버홀 바닥의 두개골과 경막 사이에 와이어의 구부러진 부분을 밀어 넣습니다.
   2. 처음에는 와이어와 구멍을 뼈 왁스로 밀봉한 다음 챔버를 배치할 때 시멘트와 아크릴로 밀봉합니다. 접지를 위해 부착할 챔버 근처의 바깥쪽 부분을 남겨 두십시오.
6. 퀵 점착 시멘트의 베이스 층을 배치하여 레코딩 부위와 접지선의 전체 영역을 덮은 후 퀵 접착 시멘트를 사용하여 레코딩 챔버(맞춤형 3D 프린팅 부품으로 구성)를 두개골에 부착하고 헤드 임플란트를 제작할 때 아크릴로 보강합니다.
7. 격리실 내부에 꼭 맞도록 설계된 3D 프린팅 챔버 캡으로 격리실을 봉인한다(피험자와 짝을 이룬 케이지 메이트가 제거할 수 없음).
   1. 포함된 혼합 팁을 사용하여 챔버의 내부 가장자리 주위에 소량의 실리콘 엘라스토머(실라스틱)를 분배한 다음 외부 챔버 벽과 같은 높이가 될 때까지 챔버 캡을 삽입합니다.
   2. 챔버는 챔버 양쪽에 접근 구멍(직경 1mm)이 있어 챔버 캡을 쉽게 제거할 수 있습니다. 실라스틱을 사용하여 이러한 액세스 구멍을 밀봉하여 밀폐된 챔버 밀봉을 만듭니다.
      알림: 챔버 캡을 제거하려면 핀셋을 사용하여 먼저 액세스 구멍을 밀봉하는 실라스틱을 제거하여 챔버의 기밀 밀봉을 해제하십시오. 그런 다음 핀을 사용하여 챔버 캡을 챔버 밖으로 활용할 수 있습니다.
8. 동물을 마취에서 회복시키고 흉골 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 방치하지 마십시오. 수술 후 항생제(아목시실린-클라불란산 13.75mg/kg)로 7일간, 항염증제(멜록시캄 0.1mg/kg)를 3일 동안 투여합니다. 회복 전에 서서히 방출되는 진통제를 수술 후 72시간 동안 투여하고 완전히 회복될 때까지 동물을 독립적으로 사육합니다.
9. 수술 후 2-3주가 지나면 머리 지지대와 시각 행동을 훈련하기 시작합니다. 마모셋을 영장류 의자에 놓고 머리 지지대에 적응할 수 있도록 합니다. 일단 편안해지면, 마모셋이 중심 시각 고정(central visual fixation⁾¹³을 포함한 몇 가지 기본 작업과 시력(visual facity)¹¹을 측정하는 데 사용되는 주변부 감지 가보르 격자(Gabor grating)를 향한 saccade 작업을 수행하도록 훈련시킨다.
10. 충분한 행동 훈련 후 기록실 내에서 개두술을 시행합니다. 멸균 기술에서 두 번째 수술을 수행하여 관심 영역(예: MT 영역)에 걸쳐 기록 챔버에서 개두술(직경 2-3mm)을 만듭니다. 약 1mm의 규라스틱 또는 개두술의 깊이를 두껍게 도포하여 개두술을 밀봉하여 뇌를 감염으로부터 보호하고 육아의 성장을 줄인다¹⁴. 실라스틱 씰의 가장자리가 모든 면에서 치과용 시멘트의 최소 2mm 이상을 잡아주는지 확인하십시오. 7단계에서 설명한 대로 챔버 캡을 교체합니다.
11. 수술 후 며칠 동안 출혈이 발생하거나 실라스틱 씰에서 투명한 액체가 누출되면 챔버를 청소해야 합니다.
    1. 실라스틱 씰이 손상되지 않은 경우 멸균 기술을 사용하여 10% 베타딘으로 세척하고 씰을 제거하기 전에 멸균 식염수로 세척하십시오. 실라스틱 씰이 손상되지 않은 경우 멸균 기술에 따라 멸균 식염수로만 세척하십시오.
    2. 실라스틱이 제거되면 멸균 식염수로 경막을 여러 번 씻어내고 면 팁 어플리케이터로 말리십시오. 새로운 실라스틱 층을 적용하기 전에 면 팁 어플리케이터를 사용하여 챔버를 완전히 건조시킵니다. 일반적으로 챔버는 안정화되고 며칠에서 1주일 후에 단단히 밀봉되어 건조한 상태를 유지합니다.
12. 개두술이 안정되고 출혈의 징후가 보이지 않으면 경막 긁어내기를 수행하여 경막 위의 과도한 조직을 제거합니다. 그런 다음 <1mm)의 얇은 실라스틱(녹음용 전극이 통과할 수 있을 만큼 얇음)을 적용하고 기계적 구매를 위해 그림 3C와 같이 1/4 버 드릴 비트를 사용하여 개두술 벽 위로 실라스틱을 심지합니다.
    알림: 이렇게 하면 청소 목적으로 더 쉽게 제거할 수 있습니다. 실라스틱은 연구 기간 동안 제자리에 남아 있을 수 있으며 기록을 위해 선형 어레이 전극으로 구멍을 뚫을 수 있습니다.

4. 신경 생리학 기록 설정(그림 3D-F)

참고: 동물 취급 단계는 실험실 및 실험에 따라 다릅니다. 다음 단계는 마이크로 드라이브의 배치 및 녹음을 위한 경막의 침투와 관련이 있습니다.

1. 기록 챔버에서 캡을 제거합니다(섹션 3, 7.2단계 참조). 91% 이소프로필 알코올에 캡을 넣어 녹음하는 동안 담그십시오. 챔버의 가장자리가 실라스틱에서 깨끗한지 확인하십시오. 챔버 가장자리에 실라스틱이 남아 있으면 마이크로 드라이브가 올바르게 장착되지 않습니다.
2. 마이크로 드라이브의 바닥에는 동물의 챔버에 조이기위한 3 개의 나사가 있습니다. 일반적으로 이러한 나사는 챔버와 동일한 크기의 보호 슬리브 주위에 조여져 내부의 실리콘 프로브가 부딪히지 않도록 보호합니다.
   1. 먼저 드라이버를 사용하여 실리콘 프로브 위에 보호 슬리브를 고정하는 나사 3개를 풀고 슬리브를 조심스럽게 제거합니다. 마이크로 드라이브를 기록 챔버에 부착하고 챔버 벽의 실리콘 전극에 부딪히지 않도록 주의합니다(그림 3D, E).
   2. 또한 드라이브를 챔버에 배치하기 전에 전극이 완전히 수축된 위치에 있는지 확인하여 초기 배치 시 피질 위에 잘 위치하도록 합니다.
3. 나사를 장착한 후 드라이버를 사용하여 마이크로 드라이브 측면에 있는 각 나사를 조입니다(그림 3F). 나사를 조일 순서를 선택하고 매번 사용하여 위치의 안정성을 유지하십시오. 연구원들은 또한 나사를 비슷한 양으로 조이기 위해 처음에 나사를 풀 때 회전 수를 계산할 수 있습니다. 프로브가 느슨한지 확인하고 필요에 따라 조이되 과도하게 조여 플라스틱의 나사산이 벗겨지지 않도록 주의하십시오.
4. 마이크로 드라이브가 챔버에 고정되면 필요한 모든 접지선을 배치합니다.
   알림: 헤드 스테이지를 커넥터에 밤새 삽입하고 SPI(Serial Peripheral Interface) 케이블만 헤드 스테이지에 삽입하십시오.tage 헤드 s를 삽입하기 어렵기 때문입니다.tage 동물에 있는 동안 커넥터에 연결합니다.
5. SPI 케이블을 헤드에 조심스럽게 꽂습니다.tage(이미 프로브에 연결되어 있음). 전선이 구부러지지 않도록 하십시오. Open-Ephys GUI(https://github.com/open-ephs/plugin-GUI)를 사용하여 30kHz에서 헤드 스테이지의 모든 신경 생리학 데이터를 증폭하고 디지털화합니다. 하이 패스 필터는 헤드 스테이지에서 0.1Hz로 광대역 신호를 필터링합니다. 앞에서 설명한 대로 이 필터링의 위상 변이를 수정합니다¹⁵. 선형 배열의 경우, 결과로 생성되는 트레이스를 공통평균값 참조로 전처리합니다.
6. 기록 시스템에서 사용 중인 특정 전극 배열에 대한 채널 맵을 입력하여 기록 중에 플롯된 채널이 고역 통과 필터링된 기록 신호 보기에서 깊이별로 정렬되도록 합니다. 이 보기는 전극을 전진 및 후퇴할 때 활용됩니다.

5. 신경 생리학 기록 실험 수행(그림 4)

참고: 여기에서, 전극 어레이를 피질로 낮추는 방법이 설명됩니다. 이 방법은 기저 조직의 과도한 딤플을 방지하기 위해 최적화되었습니다. 전기생리학적 기록에서 잡음의 증가는 실라스틱을 관통하여 뇌로 들어가기 전에 보조개가 생기는 좋은 징후를 제공합니다. 일단 뇌에 들어가면, 보조개가 너무 많으면 연구자는 드라이브를 조작하지 않고도 프로브에서 단위가 이동하는 것을 알아차릴 수 있습니다(단위는 깊이에서 채널을 가로질러 점차적으로 이동함) 또는 대안으로 연구원은 특히 프로브의 표면 부위에서 신경 활동이 억제되는 것을 알아차릴 수 있습니다. 이러한 조건에서는 딤플을 완화하고 더 나은 녹음을 용이하게 하기 위해 드라이브를 접습니다.

1. 마이크로 드라이브의 나사 컨트롤을 사용하여 실리콘 프로브를 내리고 어레이 팁에서 장치가 관찰될 때까지 250-1초마다 한 바퀴(2μm)를 만듭니다.
   알림: 경막 위에 놓인 실라스틱이 침투하는 동안 소음이 약간 증가할 수 있습니다. 섕크는 튕겨 나오기 전에 실라스틱을 딤플링하여 프로브의 노이즈를 증가시킬 수 있습니다. 단위의 첫 번째 표시가 silastic 층의 침투를 도울 때까지 빠른 하강.
2. 첫 번째 뉴런이 관찰되면 마이크로 드라이브(250μm)를 한 바퀴 돌려 전극이 규질과 경막을 통해 피질 조직으로 튀어나오기 시작할 때 진입 속도를 줄입니다. 전극이 미세 조작 없이 시간이 지남에 따라 조직으로 계속 전진하는 것처럼 보이면 추가 회전을 후퇴시켜 그 아래의 규질과 조직을 누르는 프로브의 압력을 완화합니다.
   참고: 선형 배열에 대한 올바른 채널 맵이 로드된 경우 뉴런의 위치를 추적할 수 있어야 합니다(채널은 피질에 상대적인 깊이에 따라 정렬된 것으로 나타납니다).
3. 뉴런이 프로브의 길이에 걸쳐 고르게 분포될 때까지 20-30분 동안 약 4-6회전(1-1.5mm)씩 진행하면서 어레이를 피질로 매우 천천히 계속 구동합니다.
4. 녹음을 시작하기 전에 어레이를 1-2회전(0.25-0.5mm) 천천히 집어넣어 조직에 가해지는 압력을 줄입니다.
   참고: 뉴런은 일반적으로 이 후퇴 동안 선형 어레이의 채널 위치를 이동하지 않으며, 이는 주로 조직에 가해지는 압력을 줄이기 위해 작용한다는 것을 시사합니다. 후퇴가 없으면 조직이 이완됨에 따라 기록 중에 연속적인 어레이 이동이 관찰되어 기록 안정성이 저하될 수 있습니다(그림 4C).
5. 철회 후 녹음을 시작하기 전에 20분 동안 기다리십시오. 이렇게 하면 녹음에서 볼 수 있는 움직임의 양이 제한됩니다. 이 시간을 사용하여 기록을 준비합니다(즉, 시선 추적을 보정하고 자극 표시 시스템을 준비).
6. 레코딩 소프트웨어에서 레코딩 을 선택합니다.
7. 실험이 완료되면 녹화 버튼을 다시 선택합니다. 이렇게 하면 선택한 대상에 전체 녹음 파일이 생성됩니다. 계속하기 전에 파일이 올바르게 저장되었는지 확인하십시오.
8. 이전과 비슷한 속도로 배열을 피질 밖으로 천천히 집어넣기 시작합니다(20-30분 동안 4-6바퀴). 프로브를 따라 뉴런이 이동하는 것을 관찰하여 프로브가 후퇴하는 것을 시각화합니다. 뉴런을 처음 본 이후 회전 수만큼 후퇴한 후 프로브에서 더 이상 뉴런이 관찰되지 않으면 완전히 수축된 시작 위치로 돌아갈 때까지 더 빠르게 후퇴합니다.
9. 기록 챔버에서 프로브를 제거하려면 섹션 1의 3-4단계를 역순으로 수행합니다(즉, 먼저 3단계를 수행한 다음 2단계를 수행한 다음 1단계를 수행).
10. 프로브가 기록 챔버에서 제거되면 콘택트 렌즈 용액에 20분 동안 담가 전극에서 조직이나 혈액을 제거합니다. 그 후, 프로브를 알코올에 1분 동안 넣어 콘택트렌즈 용액을 제거하고 전극을 건조시킵니다.
11. Kilosort2를 사용하여 기록 시스템에서 초기 필터링 후 어레이 데이터를 스파이크 정렬합니다(섹션 4, 5단계에서 설명).
    1. "phy" GUI(https://github/kwikteam/phy)를 사용하여 스파이크 정렬 알고리즘의 출력에 수동으로 레이블을 지정합니다. 파형이 작거나 생리적으로 믿을 수 없는 파형을 가진 단위를 노이즈로 분류하고 제외합니다.
    2. 층류 프로브를 사용하는 경우 각 채널의 스파이크 파형을 확인하여 단일 장치가 피크 파형으로 채널에 레이블이 지정되었는지 확인합니다(그림 5A). PCA 공간에 명확한 클러스터가 있는 장치, 1% 미만의 스파이크 간 간격 위반 및 bi-phasic 스파이크 파형(선형 배열의 인접 채널에 국한되어야 함)만 포함합니다. 그림 5B에는 PCA 공간(오른쪽 상단)의 명확한 클러스터와 시간 경과에 따른 안정성(오른쪽 하단)이 표시되어 있습니다.

결과

이 프로토콜은 X-Y 전극 스테이지(그림 1)를 구축하는 방법을 설명하며, 이를 통해 밀리미터 미만의 부위를 타겟팅하고 별도의 기록 세션에서 안정적인 포지셔닝을 유지할 수 있습니다. X-Y 포지셔닝의 신뢰성은 그림 6에 나와 있으며, 일주일 간격으로 수행된 두 개의 녹음 세션에서 평균 RF 위치가 70.8% 겹치는 것으로 나타났습니다(그림 6A...

토론

여러 방법(예를 들어, 만성, 반만성, 급성)이 현재 비인간 영장류에서 신경생리학 실험을 수행하기 위해 이용 가능하다. 일반적인 마모셋은 크기가 작고 해부학적 랜드마크인 자이리가 없기 때문에 신경 생리학 실험에 고유한 문제를 제기합니다. 이를 위해 연구자들은 기록 대상을 식별하기 위해 관심 영역의 망막 및 튜닝 특성과 같은 신경 생리학적 랜드마크를 사용해야 합니다. 그러므로, 피질 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 Hp burr drill bit	McMaster & Carr	Cat# 43035A32	Carbide Bur with 1/4" Shank Diameter, Rounded Cylinder Head, trade Number SC-1, single Cut(https://www.mcmaster.com/products/bur-bits/burs-7/?s=1%2F4%22+bur+bits)
1x1mm Crist Grid	Crist Instruments	1 mm x 1 mm Grid	https://www.cristinstrument.com/products/implant-intro/grids
91% isopropyl alcohol	Medline	N/A	https://www.medline.com/product/Medline-Isopropyl-Rubbing-Alcohol/Bulk-Alcohol/Z05-PF03807?question=91%25%20isopropyl%20alcohol
Acquisition Board	Open-Ephys	N/A	https://open-ephys.org/acquisition-system/eux9baf6a5s8tid06hk1mw5aafjdz1
Bacitracin Ointment	Medline: Cosette Pharmaceuticals Inc	N/A	https://www.medline.com/product/Bacitracin-Ointment/Antibiotics/Z05-PF86957?question=bacitr
Blunt straight Forceps	Medline	N/A	https://www.medline.com/category/Central-Sterile/Surgical-Instruments/Forceps/Z05-CA16_02_20/products
Bone wax	Medline	ETHW31G	https://www.medline.com/product/Ethicon-Bone-Wax/Bone-Wax/Z05-PF61528?question=bonewax
C&B Metabond Quick Adhesive Cement System	Parkell, Inc.	SKU: S380	https://www.parkell.com/C-B-Metabond-Quick-Adhesive-Cement-System
Clavamox	MWI Animal Health	N/A
Contact lens solution	Bausch and lomb		Various sources available
Custom Printed 3D printed parts	ProtoLab		https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal Connector	Various Sources	DB25-G2 25	DB25-G2 25 Pin Male Plug Port Signal 2 Row Terminal Breakout Board Screw Nut Connector
diamond saw attachement for dremmel	Dremmel	545 Diamond Wheel	https://www.dremel.com/us/en/p/545-26150545ab
Digitizing Head-stages	Intan	RHD 32channel (Part #C3314)	https://intantech.com/RHD_headstages.html?tabSelect=RHD32ch&yPos=120.80 000305175781
EDOT	Sigma Aldrich	Product # 483028	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/483028
Helping Hands	Harbor Freight	N/A	https://www.harborfreight.com/helping-hands-60501.html
Hook Electrical Clips	Various Sources	N/A	Hook test Cable wires
Interface Cables (RHD 3-ft (0.9 m) ultra thin SPI cable)	Intan	Part #C3213	https://intantech.com/RHD_SPI_cables.html
Lab jack	Various Sources	N/A	https://www.amazon.com/Stainless-Steel-Scissor-Stand-Platform/dp/B07T8FM85H/ref=asc_df_B07T8FM85H/?tag=&linkCode=df0&hvadid=366343 827267&hvpos=&hvnetw=g&hvrand =2036619536500717246&hvpone =&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hv dvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=900 5674&hvtargid=pla-795933567991& ref=&adgrpid=71496544770&th=1
Meloxicam	MWI Animal Health	N/A
Micro-drive	Crist Instrument	3-NRMD	https://www.cristinstrument.com/products/microdrives/miniature-microdrive-3-nrmd
Multi-channel linear silicon arrays with 64 channel connector	NeuroNexus	A1x32-5mm-25-177	https://www.neuronexus.com/products/electrode-arrays/up-to-10-mm-depth/
NanoZ Omentics Adapter- 32 Channel	NeuraLynx	ADPT-NZ-N2T-32	https://neuralynx.com/hardware/adpt-nz-n2t-32
NanoZ System	Plexon	NanoZ Impedence Tester	https://plexon.com/products/nanoz-impedance-tester/
Narishige Micromanipulator	Narishige	Stereotaxic Micromanipulator	https://usa.narishige-group.com/
Open-Ephys GUI	Open-Ephys		https://open-ephys.org/
Polyimide Tubing (OD(in): 0.021 / ID(in) 0.018 )	Various Sources (Chamfr)	Chamfr Cat#HPC01895	https://chamfr.com/sellers/teleflex-medical-oem-llc/
Primate Chair	Custom made by University of Rochester Machine Shop	Designs online	https://marmolab.bcs.rochester.edu/resources.html
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)	Sigma Aldrich	Product # 243051	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/243051
RHD USB Interface board	Intan	RHD2000 Evaluation Board Version 1.0	https://intantech.com/RHD_USB_interface_board.html
Silastic gel	World Precision Instuments	# KWIK-SIL	Low Toxicity Silicone Adhesive ((https://www.wpiinc.com/kwik-sil-low-toxicity-silicone-adhesive)
Slow release buprenorphine	Compounding Pharmacy
Stainless steel wire 36 gauge	McMaster & Carr	Cat# 6517K11	Round Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel Wire, Matte Finish, 1-Foot Long, 0.008" Diameter
Stanley 6-Piece Precision Screwdriver Set	Stanley	1.4mm flathead screwdriver	https://www.amazon.com/Stanley-Tools-6-Piece-Precision-Screwdriver/dp/B076621ZGC/ref=sr_1_3?crid=237VSK5FNFP9N&keywords= stanley+66-052&qid=1672764369&sprefix= stanley+66-052%2Caps%2C90&sr=8-3
Steel Screws	McMaster & Carr	type 00 stainless steel hex screws and 1/8” in length	https://www.mcmaster.com/
Steel Tube	McMaster & Carr	28 gauge stainless steel tubing	https://www.mcmaster.com/tubing/multipurpose-304-stainless-steel-6/id~0-055/
Superglue	Loctite	SuperGlue Gel Control	https://www.loctiteproducts.com/en/products/fix/super-glue/loctite_super_gluegelcontrol.html