JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذه المخطوطة هو فحص استخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء للكشف عن الأجسام المضادة IgG و IgM الخاصة بداء.

Abstract

تم تطوير اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء (IFA) للكشف عن مختلف أنماط الأجسام المضادة الخاصة بداء في الأمصال أو السائل الشوكي الدماغي. يوفر هذا الاختبار نتائج سريعة ويمكن استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة لداء في عدة سيناريوهات مختلفة. يعد اختبار IFA لداء مفيدا بشكل خاص للكشف السريع والمبكر عن الأجسام المضادة لتقييم الاستجابة المناعية لدى المريض الذي أصيب بداء. على الرغم من أن الطرق الأخرى لتشخيص داء قبل الوفاة لها الأسبقية ، يمكن استخدام هذا الاختبار لإثبات التعرض الأخير لفيروس داء من خلال اكتشاف الأجسام المضادة. لا يوفر اختبار IFA عيار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس (VNA) ، ولكن يمكن تقييم استجابة الوقاية قبل التعرض (PrEP) من خلال وجود الأجسام المضادة الإيجابية أو السلبية. يمكن استخدام هذا الاختبار في مواقف مختلفة ويمكن أن يوفر نتائج لعدد من الأهداف المختلفة. في هذه الدراسة ، استخدمنا العديد من عينات المصل المقترنة من الأفراد الذين تلقوا PrEP وأظهروا وجود الأجسام المضادة لداء بمرور الوقت باستخدام اختبار IFA.

Introduction

يستخدم اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء (IFA) للكشف عن مختلف أنماط الأجسام المضادة الخاصة بداء في الأمصال أو السائل الدماغي الشوكي. وهو واحد من ترسانة من الاختبارات المتاحة لمراقبة مريض داء قبل الوفاة. من المفيد بشكل خاص للكشف المبكر عن الأجسام المضادة تقييم الاستجابة المناعية للمريض لعدوى داء. عند استخدامه بالاقتران مع اختبارات أخرى وتاريخ الحالة وحالة تطعيم المريض ، يمكن أن يساعد اختبار IFA في تحديد التعرض لفيروس داء أو اللقاح1. نظرا لأن اختبار IFA يقيس IgM و / أو IgG ، يمكن أن تشير قيم الجسم المضاد المحدد إلى إطار زمني تقريبي من التعرض للمستضد1. قد يكون هذا الاختبار مفيدا في التطبيقات المدرجة أو غيرها من التطبيقات التي لم يتم استكشافها بعد.

هناك العديد من المقايسات المصلية لداء المتاحة. اختبار تثبيط التركيز الفلوري السريع (RFFIT) ، أو اختبار تحييد فيروس الأجسام المضادة الفلورية (FAVN) ، أو تعديلات هذه هي الطرق الأساسية لقياس الأجسام المضادة المعادلة لفيروس داء (RVNAs) 1. ومع ذلك ، فإن هذه الاختبارات لا تفرق بين الأجسام المضادة IgM و IgG. عندما يكون التمييز بين النمط المتماثل للأجسام المضادة مهما في مراقبة الاستجابة المناعية لداء ، يتم استخدام اختبارات IFA لداء ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم داء (ELISA) ، لكنها لا تقيس RVNAs. على الرغم من أنه يمكن استخدام اختبارات IFA و ELISA لتحديد وجود أجسام مضادة خاصة بداء في عينة ، إلا أن هناك بعض الاختلافات في كيفية تنفيذها. يستخدم اختبار IFA فيروسا حيا مستزرعا بالخلايا كركيزة مستضد ، بينما يستخدم ELISA النموذجي للكشف عن داء واحدا أو أكثر من البروتينات الفيروسية. في بيئة معملية حيث يمكن زراعة فيروس داء ، يمكن إجراء اختبار IFA بسهولة أكبر بدلا من شراء أو زراعة بروتينات فيروسية فردية ل ELISA. يجب مراعاة الغرض من الاختبار والمعلومات التي تم الحصول عليها من نتائج أي مقايسة مصلية لداء عند تحديد أيهما تختار2.

IgM هو أول من يستجيب ، ويزداد حتى يتم ملاحظة تبديل الفصل في حوالي اليوم 28 ، وعند هذه النقطة يصبح IgG الجسم المضاد السائدالمنتشر 3. وبالتالي ، لن يتوقع IgM إلا لفترة محدودة من الوقت بعد التعرض لفيروس داء أو التطعيم. يمكن أن يشير اختبار كل من المصل والسائل النخاعي (CSF) إلى ما إذا كان التعرض من خلال التطعيم ، حيث يمكن رؤية الأجسام المضادة فقط في الأمصال ، أو من عدوى فيروسية ، والتي من المحتمل أن تظهر أجساما مضادة في السائل الدماغي الشوكي1.

لقد ثبت أن الأجسام المضادة لداء تستمر لعدة سنوات بعد العلاج الوقائي قبل التعرض (PrEP)4. يمكن أن يكون اختبار IFA أداة مفيدة لإثبات ذلك في نقاط زمنية مختلفة بعد التطعيم أو التعرض.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التالي للاستخدام الأخلاقي للعينات البشرية من قبل مركز Wadsworth التابع لوزارة الصحة بولاية نيويورك لتطوير الفحص ، رقم الموافقة على البروتوكول # 03-019.

1. السلامة

  1. ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) ، على الأقل لحماية العين (نظارات أو درع للوجه) ، وقناع جراحي ، وقفازات غير مطاطية.
  2. تأكد من تطعيم الموظفين ضد داء وأنه تم إثبات عيار ≥0.5 وحدة دولية / مل خلال الأشهر ال 6 الماضية.

2. إعداد شريحة مستضد

ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات التلاعب بالفيروسات والسائل الدماغي الشوكي والمصل في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) باستخدام الاحتياطات العالمية.

  1. قم بإعداد 20 مل من الورم الأرومي العصبي للفأر أو خلايا BHK-21 بتركيز 3.0 × 105 خلايا / مل في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ل Eagle مع 10٪ مصل بقري جنيني (EGM) والحفاظ على البرودة حتى الاستخدام.
  2. تحضير فيروس CVS-11 عن طريق التخفيف في EGM إلى تخفيف عملي قدره 1.0 × 106.5 50٪ جرعة معدية لزراعة الأنسجة (TCID50) لكل ملليلتر والحفاظ على البرودة حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: يتم تحديد TCID50 بواسطة طريقة Reed and Muench المنشورة مسبقا5.
  3. قم بتنظيف حجرة منزلقة الرطوبة وشرائح مجهر البئر المطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء في BSC.
  4. أضف الماء المقطر (dH2O) إلى شرائح من الورق الماص في حجرة الشريحة لضمان بقاء الرطوبة ثابتة طوال العملية.
  5. باستخدام قلم رصاص ، قم بتسمية كل شريحة لاستخدامها برقم الدفعة والتاريخ ونوع الخلية وأي معلومات تعريف أخرى مطلوبة للتخزين ، وضعها في غرفة الشريحة.
    ملاحظة: لن تتحمل معظم العلامات أو الأقلام أو الملصقات خطوة تثبيت الأسيتون المستقبلية (الخطوة 2.9).
  6. ضع 50 ميكرولتر من تخفيف الفيروس على كل بئر على شرائح المجهر باستخدام ماصة متكررة. بعد ذلك ، ضع 50 ميكرولتر من تخفيف الخلايا على كل بئر ، مع الحرص على عدم تلويث طرف الماصة بالفيروس الموجود بالفعل على البئر.
  7. أغلق حجرة منزلق الرطوبة وضعها في الحاضنة الرطبة عند 34-36 درجة مئوية. تقييم عدوى الخلية بعد 24 ساعة.
    ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 2.8-2.12 على شريحة واحدة فقط.
  8. قم بإزالة الشريحة من غرفة الرطوبة واستنشاق المادة الطافية بعناية. اغسل الشريحة في وعاء كوبلين مملوء بالفوسفات (PBS) لمدة 2 دقيقة ، ثم اترك الشريحة تجف في الهواء.
  9. ضع الشريحة في برطمان كوبلين وقم بتثبيت الشريحة في الأسيتون البارد لمدة لا تقل عن 1 ساعة في مجمد -20 درجة مئوية معتمد للمواد القابلة للاشتعال. قم بإجراء جميع إجراءات صب الأسيتون وتجفيف الهواء في غطاء الدخان.
  10. اترك الأسيتون يومض وينزلق حتى يجف. ضع الأجسام المضادة الفلورية المباشرة لداء (DFA) المتقارن المحضر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة على آبار الشريحة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حاضنة رطبة 34-36 درجة مئوية.
  11. اغسل الشريحة في برطمانات كوبلين من PBS مرتين لمدة 2 دقيقة لكل منهما. جفف الشريحة بالهواء.
  12. قم بتركيب غطاء مع 0.05 M Tris و 0.15 M NaCl (درجة الحموضة 9.0) و 20٪ حامل الجلسرين ، واقرأ الشريحة باستخدام مجهر الفلورسنت عند تكبير 200x لتقييم العدوى. إذا لم تكن الخلايا مصابة بنسبة 50٪ تقريبا ، كرر الخطوات 2.7-2.12 في اليوم التالي حتى يتم الوصول إلى العدوى المطلوبة.
    ملاحظة: يتم تقريب عدوى الخلايا بناء على التقييم البصري لنسبة الخلايا السالبة إلى الخلايا الإيجابية لداء على بئر الشريحة. تظهر الخلايا السالبة حمراء اللون ، بينما تظهر الخلايا الإيجابية تلطيخا فلوريا أخضر.
  13. قم بإزالة الشرائح المتبقية من الحاضنة وغرفة الرطوبة. قم بشفط المادة الطافية بعناية من كل بئر ، ثم ضع الشرائح في جرة (جرات) كوبلين مع برنامج تلفزيوني لمدة 1-2 دقيقة. جفف الشرائح في الهواء لمدة 30 دقيقة تقريبا. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

3. إعداد عينة

  1. تحضير مصل المريض أو تخفيفات عينة السائل الدماغي الشوكي للاختبار. قم بإعداد المرافق اللازم لتركيز العمل المناسب المخفف في برنامج تلفزيوني مع 0.05٪ إيفانز الأزرق.
    ملاحظة: احتفظ بالاقتران في الظلام للحفاظ على سلامة الفلوروفور قبل التطبيق

4. إجراء IFA

  1. قم بإزالة العدد اللازم من شرائح المستضد المعدة اللازمة لكل فحص واترك الشرائح تذوب وتجف تماما.
  2. ضع الشرائح في برطمان (برطمانات) كوبلين وقم بتثبيت الشرائح في الأسيتون البارد لمدة تتراوح بين 2 ساعة إلى ليلة وضحاها في مجمد -20 درجة مئوية معتمد للمواد القابلة للاشتعال. أخرج الشرائح من الأسيتون واتركها تجف في الهواء.
  3. ضع الشرائح في صندوق غرفة الرطوبة داخل BSC مع شرائط ماصة مبللة ب dH2O للحفاظ على الرطوبة. ضع 50 ميكرولتر من كل تخفيف عينة أو عينة تحكم أو PBS على البئر المحدد مسبقا.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي كل شريحة على عدد مناسب من آبار عينات المرضى ، والتحكم الإيجابي ، والتحكم السلبي ، وبئر التحكم في خلايا PBS.
  4. ضع غرفة منزلقة الرطوبة المغلقة في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . احتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإزالة غرفة شريحة الرطوبة من الحاضنة ووضعها في BSC.
  5. استخدم طرف الشافطة لشفط المادة الطافية بعناية من كل بئر ، مع ضمان عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلية. استخدم ماصة قطارة معقمة لتطبيق قطرة واحدة من برنامج تلفزيوني على كل بئر.
  6. كرر الشفط الدقيق ، ثم ضع كل شريحة في وعاء كوبلين مملوء ببرنامج تلفزيوني واغسله مرتين لمدة 15 دقيقة.
  7. ضع الشرائح مرة أخرى في صندوق غرفة الرطوبة وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المناسبة المضادة للإنسان على كل بئر. كرر الخطوات من 4.4 إلى 4.6.
  8. اترك الشرائح تجف في الهواء ، وقم بتركيب غطاء مع وسائط التثبيت ، واقرأ الشرائح تحت مجهر الفلورسنت.

5. تحليل الشرائح

  1. عينات الصف على أساس نمط التلوين وشدة مضان مقارنة مع عينات السيطرة الإيجابية مع عيار الأجسام المضادة لداء عالية مؤكدة.
  2. صنف العينات على مقياس سالب ، 1+ ، 2+ ، 3+ ، و 4+ ، مع نتيجة سلبية تظهر عدم وجود تلطيخ فلوري و 4+ تمثل مضان لون التفاح الأخضر الفاتح مع نمط تلطيخ مشابه لعينات التحكم الإيجابية1.
    ملاحظة: ينطبق لون التفاح الأخضر فقط على الأجسام المضادة التي تحمل علامة FITC ؛ يختلف اللون حسب اختيار الفلوروفور.
  3. قم بتعيين قيمة نقطة نهاية للعينات ممثلة بعامل التخفيف الذي تعرض فيه العينة درجة 1-2+. اختبر العينات بعامل تخفيف أعلى إذا لم يتم الوصول إلى نقطة النهاية في الفحص الأولي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم جمع جميع عينات المصل من المرضى في نفس الأطر الزمنية تقريبا بعد PrEP. تم اختبار العينات من خمسة مرضى مختلفين في النقاط الزمنية التالية: أسبوعان بعد التطعيم النهائي ضد لقاح داء ، و 6 أشهر بعد سلسلة لقاح داء ، و 18 شهرا بعد سلسلة لقاح داء. تم تخفيف كل عينة مصل في سلسلة وتصنيفها لكل من وجود IgM و IgG ،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يستفيد اختبار IFA من مركب الأجسام المضادة للمستضد ، مما يسمح بموقع وضع العلامات لتصور الأجسام المضادة الخاصة بداء. يتم زرع خلايا الورم الأرومي العصبي أو خلايا BHK على شرائح مجهرية متعددة الآبار مغلفة ب PTFE ويتم تلقيحها بسلالة مختبر فيروس داء CVS-11. بمجرد أن تتلاقى الطبقة الأحادية وتصل الخلايا إ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن ممتنون لمركز وادزورث التابع لوزارة الصحة بولاية نيويورك لدعم هذا المشروع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
25x55mm glass cover slipsAny
AcetoneAny
Anti-Human IgG Labeled ConjugateSigma-AldrichF9512
Anti-Human IgM Labeled ConjugateSeraCare5230-0286
Aspirating pipette tipAny
BHK-21 CellsATCCCCL-10
BION IFA DiluentMBL BIONDIL-9993
Cell Culture waterSigma-AldrichW3500EGM
Coplin JarsAny
Fetal Bovine Serum Sigma-AldrichF2442EGM
Fluorescent microscope with FITC filterAny
GlycerolSigma-AldrichG7893Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagentFisher Scientific23-043-158IgG Inactivation Reagent
L-GlutamineSigma-AldrichG-7513EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonateSigma-AldrichM0643EGM
Mouse Neuroblastoma CellsATCCCCL-131
Multi-well PTFE coating glass slidesAny
PBSAnypH 7.6 
PenicillinSigmaP-3032EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody ConjugateMillipore Sigma5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS-5761EGM
Sodium Chloride crystalsSigma-AldrichS5886Mountant
Sterile dropperAny
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0Sigma-AldrichS9693Mountant
Tryptose Phosphate BrothBD260300EGM
Vitamin mixSigma-AldrichM6895EGM

References

  1. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
  2. Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
  3. Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
  4. Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
  5. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  6. Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
  7. Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
  8. Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
  9. Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
  10. Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
  11. Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved