איתור נוגדנים מסוג כלבת, IgG ו-IgM באמצעות בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים של כלבת

Summary

מטרת כתב היד היא לבחון את השימוש בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת לאיתור נוגדנים ספציפיים לכלבת מסוג IgG ו-IgM.

Abstract

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) פותחה כדי לאתר איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. בדיקה זו מספקת תוצאות מהירות וניתן להשתמש בה כדי לזהות נוגדנים לכלבת במספר תרחישים שונים. בדיקת IFA לכלבת שימושית במיוחד לגילוי מהיר ומוקדם של נוגדנים להערכת התגובה החיסונית בחולה שחלה בכלבת. למרות ששיטות אחרות לאבחון כלבת לפני המוות מקבלות עדיפות, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי להדגים את החשיפה האחרונה לנגיף הכלבת באמצעות זיהוי נוגדנים. בדיקת IFA אינה מספקת נוגדנים מנטרלי וירוסים (VNA), אך ניתן להעריך את התגובה המונעת לפני חשיפה (PrEP) באמצעות נוכחות נוגדנים חיובית או שלילית. בדיקה זו יכולה לשמש במצבים שונים ויכולה לספק תוצאות למספר מטרות שונות. במחקר זה, השתמשנו במספר דגימות סרום מזווג מאנשים שקיבלו PrEP והדגמנו את נוכחות נוגדני הכלבת שלהם לאורך זמן באמצעות בדיקת IFA.

Introduction

בדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים עקיפים לכלבת (IFA) משמשת לאיתור איזוטיפים שונים של נוגדנים ספציפיים לכלבת בסרה או בנוזל השדרה המוחי. זהו אחד מארסנל של בדיקות זמינות למעקב אחר חולה כלבת לפני המוות. זה שימושי במיוחד עבור גילוי מוקדם של נוגדנים כדי להעריך את התגובה החיסונית של המטופל לזיהום כלבת. כאשר נעשה בה שימוש בשילוב עם בדיקות אחרות, היסטוריית מקרים וסטטוס החיסון של המטופל, בדיקת IFA יכולה לסייע בקביעת חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון¹. מכיוון שבדיקת IFA מודדת IgM ו/או IgG, ערכי הנוגדן הספציפי יכולים להצביע על מסגרת זמן משוערת מחשיפה לאנטיגן¹. בדיקה זו עשויה להיות שימושית ביישומים המפורטים או ביישומים אחרים שעדיין לא נחקרו.

ישנן מספר בדיקות סרולוגיות לכלבת זמינות. בדיקת עיכוב מיקוד פלואורסצנטי מהיר (RFFIT), בדיקת נטרול נגיף נוגדנים פלואורסצנטי (FAVN), או שינויים של אלה הן השיטות העיקריות למדידת נוגדנים מנטרלי נגיף הכלבת (RVNAs)¹. עם זאת, בדיקות אלה אינן מבדילות נוגדנים IgM ו- IgG. כאשר הבחנה בין איזוטיפ נוגדנים חשובה בניטור התגובה החיסונית של הכלבת, נעשה שימוש בבדיקות כלבת IFA ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים כלבת (ELISA), אך הן אינן מודדות RVNAs. למרות בדיקות IFA ו- ELISA ניתן להשתמש כדי לקבוע את נוכחותם של נוגדנים ספציפיים כלבת בדגימה, ישנם כמה הבדלים באופן שבו הם מבוצעים. בדיקת IFA משתמשת בנגיף חי בתרבית תאים כמצע האנטיגן שלו, בעוד שבדיקת ELISA טיפוסית לגילוי כלבת משתמשת באחד או יותר מהחלבונים הנגיפיים. בסביבת מעבדה שבה ניתן לגדל את נגיף הכלבת, ניתן לבצע את בדיקת IFA בקלות רבה יותר במקום לרכוש או לטפח חלבונים נגיפיים בודדים עבור ELISA. יש לקחת בחשבון את מטרת הבדיקה ואת המידע המתקבל מתוצאות כל בדיקה סרולוגית של כלבת בעת ההחלטה באיזו בחירה².

IgM הוא הראשון להגיב, גדל עד החלפת בכיתה נצפתה בסביבות היום 28, אז IgG הופך נוגדן^{במחזור 3} השולט. לפיכך, IgM צפוי רק לפרק זמן מוגבל לאחר חשיפה לנגיף הכלבת או חיסון. בדיקת הסרום והנוזל השדרתי (CSF) יכולה להצביע אם החשיפה הייתה באמצעות חיסון, שבו נוגדנים ייראו רק בסרה, או מזיהום ויראלי, שעשוי להראות נוגדנים ב- CSF¹.

הוכח כי נוגדנים לכלבת נמשכים מספר שנים לאחר טיפול מונע לפני חשיפה (PrEP)⁴. בדיקת IFA יכולה להיות כלי שימושי להדגים זאת בנקודות זמן שונות לאחר החיסון או החשיפה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר לשימוש אתי בדגימות אנושיות על ידי מחלקת הבריאות של מדינת ניו יורק מרכז וודסוורת' לפיתוח מבחנים, מספר אישור פרוטוקול #03-019.

1. בטיחות

1. לבשו ציוד מגן אישי (PPE), לפחות מגן עיניים (משקפיים או מגן פנים), מסכה כירורגית וכפפות ללא לטקס.
2. יש לוודא כי אנשי הצוות מחוסנים לכלבת וכי הודגם טיטר של ≥0.5 IU/mL במהלך 6 החודשים האחרונים.

2. הכנת שקופית אנטיגן

הערה: בצע את כל המניפולציות של וירוסים, CSF וסרום בארון בטיחות ביולוגית (BSC) תוך שימוש באמצעי זהירות אוניברסליים.

1. הכינו 20 מ"ל של תאי נוירובלסטומה של עכבר או BHK-21 לריכוז של 3.0 x 10⁵ תאים/מ"ל במדיה החיונית המינימלית של Eagle בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (EGM) ושמרו על קור עד לשימוש.
2. הכינו את נגיף CVS-11 על ידי דילול ב-EGM לדילול עובד של 1.0 x 10^6.5 50% תרבית רקמה במינון זיהומי (TCID₅₀) למיליליטר ושמרו על קור עד שהוא מוכן לשימוש.
   הערה: TCID₅₀ נקבע על ידי שיטת ריד ומואנץ' שפורסמה בעבר⁵.
3. נקו תא מגלשות לחות ומגלשות מיקרוסקופ מצופות היטב מפוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) עם 70% אתנול ואפשרו להן להתייבש באוויר ב-BSC.
4. הוסף מים מזוקקים (dH₂O) לרצועות נייר סופג בתא השקופיות כדי להבטיח שהלחות תישאר קבועה לאורך כל ההליך.
5. באמצעות עיפרון, תייג כל שקופית לשימוש עם מספר הפריט, התאריך, סוג התא וכל מידע מזהה אחר הדרוש לאחסון, והנח בתא השקופיות.
   הערה: רוב הסמנים, העטים או התוויות לא יעמדו בשלב קיבוע האצטון העתידי (שלב 2.9).
6. החל 50 μL של דילול וירוס על כל באר על שקופיות המיקרוסקופ עם פיפטה חוזרת. לאחר מכן, להחיל 50 μL של דילול תאים על כל באר, נזהר לא לזהם את קצה פיפטה עם הנגיף כבר על הבאר.
7. סגור את תא מגלשת הלחות והנח אותו באינקובטור הלח ב 34-36 מעלות צלזיוס. להעריך את זיהום התא לאחר 24 שעות.
   הערה: בצע את שלבים 2.8-2.12 בשקופית אחת בלבד.
8. הסירו את המגלשה מתא הלחות ושאפו בזהירות את הסופרנאטנט. שטפו את המגלשה בצנצנת קופלין מלאה במי מלח חוצצים בפוספט (PBS) למשך 2 דקות, ולאחר מכן הניחו למגלשה להתייבש באוויר.
9. מניחים את המגלשה בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשה באצטון קר למשך שעה לפחות במקפיא של -20°C המאושר לחומרים דליקים. יש לבצע את כל הליכי יציקת האצטון וייבוש האוויר במכסה אדים.
10. הניחו לאצטון להבהב והחליקו לייבוש. יש למרוח נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) מצומד שהוכן על פי הוראות היצרן על בארות המגלשה ולדגור במשך 30 דקות באינקובטור לח של 34-36 מעלות צלזיוס.
11. שטפו את המגלשה בצנצנות קופלין של PBS פעמיים למשך 2 דקות כל אחת. יבשו את המגלשה באוויר.
12. הרכיבו מכסה עם 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) ו-20% גליצרול, וקראו את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 200x כדי להעריך את הזיהום. אם התאים אינם נגועים בכ-50%, חזרו על שלבים 2.7-2.12 למחרת עד להגעה להדבקה הרצויה.
    הערה: הדבקה בתאים משוערת בהתבסס על הערכה חזותית של היחס בין תאים שליליים לתאים חיוביים לכלבת בשקופית היטב. תאים שליליים מופיעים בצבע אדום, בעוד תאים חיוביים מראים צביעה פלואורסצנטית ירוקה.
13. הסר את שאר המגלשות מהאינקובטור ומתא הלחות. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מכל באר, ואז הניחו את המגלשות בצנצנת קופלין עם PBS למשך 1-2 דקות. ייבשו את המגלשות באוויר למשך כ-30 דקות. אחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות לשימוש.

3. הכנת מדגם

1. הכינו דילול מדגם של סרום המטופל או CSF לבדיקה. הכינו את הצמידות הדרושה לריכוז עבודה תקין מדולל ב-PBS עם 0.05% כחול אוונס.
   הערה: שמור את המצומד בחושך כדי לשמור על שלמות הפלואורופור לפני היישום

4. נוהל IFA

1. הסר את המספר הדרוש של שקופיות אנטיגן מוכנות הדרושות לכל בדיקה ואפשר לשקופיות להפשיר ולהתייבש לחלוטין.
2. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ומקבעים את המגלשות באצטון קר למשך בין שעתיים ללילה במקפיא בטמפרטורה של -20°C המאושר לשימוש בחומרים דליקים. הסר את המגלשות מהאצטון ואפשר להן להתייבש באוויר.
3. הניחו את המגלשות בקופסת לחות בתוך ה-BSC עם רצועות סופגות ספוגות dH₂O לשמירה על לחות. יש למרוח 50 μL מכל דילול דגימה, דגימת בקרה או PBS על הבאר שנקבעה מראש.
   הערה: כל שקופית חייבת להכיל מספר מתאים של בארות דגימת מטופלים, בקרה חיובית, בקרה שלילית ובקרת תאי PBS היטב.
4. מקם את תא מגלשת הלחות הסגור באינקובטור לח של 37°C, 5% CO₂ . דגרו על המגלשות במשך 30 דקות, ואז הוציאו את תא מגלשות הלחות מהאינקובטור והכניסו אותו ל-BSC.
5. השתמש בקצה שואף כדי לשאוף בזהירות את supernatant מכל באר, להבטיח לא להפריע monolayer התא. השתמש פיפטה טפטפת סטרילית כדי להחיל טיפה אחת של PBS על כל באר.
6. חזרו על השאיפה הזהירה, ואז הניחו כל מגלשה בצנצנת קופלין מלאה ב-PBS ושטפו פעמיים במשך 15 דקות בסך הכל.
7. החזירו את המגלשות לקופסת תא הלחות ומרחו 50 מיקרוליטר של נוגדנים אנטי-אנושיים מתאימים מצומדים לכל באר. חזור על שלבים 4.4 עד 4.6.
8. אפשרו לשקופיות להתייבש באוויר, הרכיבו משטח כיסוי עם אמצעי הרכבה וקראו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. ניתוח שקופיות

1. דגימות כיתה המבוססות על דפוס הצביעה ועוצמת הפלואורסצנטיות בהשוואה לדגימות ביקורת חיוביות עם נוגדנים נגד כלבת שאומתו כגבוהים.
2. דרגו את הדגימות בסולם של שלילי, 1+, 2+, 3+ ו-4+, כאשר תוצאה שלילית אינה מראה צביעה פלואורסצנטית ו-4+ מייצגת פלואורסצנטיות בצבע ירוק בהיר עם דפוס צביעה דומה לדגימות ביקורת חיוביות¹.
   הערה: צבע התפוח הירוק חל רק על נוגדנים המסומנים בתווית FITC; הצבע משתנה בהתאם לבחירת הפלואורופור.
3. הקצה לדגימות ערך נקודת קצה המיוצג על-ידי גורם הדילול שבו הדגימה מציגה ציון 1-2+. בדוק את הדגימות בגורם דילול גבוה יותר אם לא הגיעו לנקודת הסיום בבדיקה הראשונית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כל דגימות הסרום נאספו מהמטופלים בערך באותן מסגרות זמן לאחר PrEP. הדגימות נבדקו מחמישה חולים שונים בנקודות הזמן הבאות: שבועיים לאחר החיסון הסופי נגד כלבת, 6 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת ו-18 חודשים לאחר סדרת חיסוני הכלבת. כל דגימת סרום דוללה בסדרות ודורגה הן עבור נוכחות IgM והן עבור נוכחות IgG, כמ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בדיקת IFA מנצלת קומפלקס נוגדנים אנטיגן, המאפשר אתר תיוג כדי להמחיש נוגדנים ספציפיים לכלבת. תאי נוירובלסטומה או BHK נזרעים על שקופיות מיקרוסקופ מרובות בארות מצופות PTFE ומחוסנים בזן מעבדה של נגיף הכלבת CVS-11. ברגע שהחד-שכבה מתמזגת והתאים מגיעים להדבקה הרצויה של כ-50%, השקופיות מאוחסנות עד שהן מוכנ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well PTFE coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM