Выявление антител IgG и IgM к бешенству с помощью непрямого флуоресцентного теста на антитела к бешенству

Резюме

Целью данной статьи является изучение использования теста на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству для выявления антител IgG и IgM, специфичных для бешенства.

Аннотация

Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) был разработан для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Этот тест дает быстрые результаты и может быть использован для обнаружения антител к бешенству в нескольких различных сценариях. Тест на бешенство IFA особенно полезен для быстрого и раннего выявления антител для оценки иммунного ответа у пациента, у которого развилось бешенство. Несмотря на то, что другие методы посмертной диагностики бешенства имеют приоритет, этот тест может быть использован для демонстрации недавнего контакта с вирусом бешенства путем обнаружения антител. Тест IFA не дает титра вируснейтрализующих антител (VNA), но ответ на доконтактную профилактику (ДКП) можно оценить по положительному или отрицательному наличию антител. Этот тест может быть использован в различных ситуациях и может дать результаты для ряда различных целей. В этом исследовании мы использовали несколько парных образцов сыворотки крови людей, получавших ДКП и продемонстрировавших наличие у них антител к бешенству с течением времени с помощью теста IFA.

Введение

Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) используется для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Это один из арсенала тестов, доступных для наблюдения за посмертным пациентом с бешенством. Это особенно полезно для раннего выявления антител для оценки иммунного ответа пациента на инфекцию бешенства. При использовании в сочетании с другими тестами, историей болезни и статусом вакцинации пациента тест IFA может помочь определить контакт с вирусом бешенства или вакциной¹. Поскольку тест IFA измеряет IgM и/или IgG, значения специфических антител могут указывать на приблизительные временные рамки с момента контакта с антигеном¹. Этот тест может быть полезен в перечисленных приложениях или других, которые еще не изучены.

Существует несколько серологических тестов на бешенство. Основными методами измерения нейтрализующих антител к вирусу бешенства (РВНК^{) являются} экспресс-тест на ингибирование флуоресцентного фокуса (RFFIT), тест на нейтрализацию вируса бешенства (FAVN) или их модификации. Однако эти тесты не дифференцируют антитела IgM и IgG. Когда дифференциация изотипа антител важна для мониторинга иммунного ответа на бешенство, используются тесты на ИФА бешенства и иммуноферментный анализ на бешенство (ИФА), но они не измеряют РВНК. Несмотря на то, что тесты IFA и ELISA могут быть использованы для определения наличия антител, специфичных для бешенства, в образце существуют некоторые различия в том, как они выполняются. В тесте IFA в качестве антигенного субстрата используется живой вирус, культивируемый в клетках, в то время как типичный ИФА для выявления бешенства использует один или несколько вирусных белков. В лабораторных условиях, где вирус бешенства может быть культивирован, тест IFA может быть более простым вместо покупки или культивирования отдельных вирусных белков для ИФА. Цель тестирования и информация, полученная из результатов любого серологического анализа на бешенство, должны учитываться при принятии решения о том, какой из них^{выбрать.}

IgM реагирует первым, увеличиваясь до тех пор, пока не будет наблюдаться смена класса примерно на 28-й день, после чего IgG становится преобладающим циркулирующим антителом³. Следовательно, IgM можно ожидать только в течение ограниченного периода времени после контакта с вирусом бешенства или вакцинации. Тестирование как сыворотки, так и спинномозговой жидкости (ликвора) может показать, был ли контакт через вакцинацию, при которой антитела будут видны только в сыворотке, или от вирусной инфекции, которая потенциально может показать антитела в спинномозговой жидкости¹.

Установлено, что антитела к бешенству сохраняются в течение нескольких лет после доконтактной профилактики (ДКП)⁴. Тест IFA может быть полезным инструментом, чтобы продемонстрировать это в различные моменты времени после вакцинации или контакта.

протокол

Следующий протокол был одобрен для этичного использования образцов на людях Центром Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк для разработки анализов, номер одобрения протокола #03-019.

1. Безопасность

1. Наденьте средства индивидуальной защиты (СИЗ), как минимум средства защиты глаз (очки или лицевой щиток), хирургическую маску и нелатексные перчатки.
2. Убедитесь, что персонал вакцинирован против бешенства и что титр ≥0,5 МЕ/мл был продемонстрирован в течение последних 6 месяцев.

2. Подготовка антигена к предметному стеклу

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все манипуляции с вирусами, спинномозговой жидкостью и сывороткой крови в кабинете биобезопасности (BSC), используя универсальные меры предосторожности.

1. Приготовьте 20 мл мышиной нейробластомы или клеток BHK-21 до концентрации 3,0 x 10⁵ клеток/мл в минимально необходимой среде Eagle с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (EGM) и храните в холоде до использования.
2. Приготовьте вирус CVS-11 путем разведения в EGM до рабочего разведения 1,0 x 10^6,5 50% инфекционной дозы тканевой культуры (TCID₅₀) на миллилитр и храните в холоде до готовности к использованию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TCID₅₀ определяется по методу Рида и Мюнха, опубликованному ранее⁵.
3. Очистите предметную камеру влажности и хорошо покрытые политетрафторэтиленом (ПТФЭ) предметные стекла микроскопа 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе в BSC.
4. Добавьте дистиллированную воду (dH₂O) на полоски впитывающей бумаги в камере предметного стекла, чтобы влажность оставалась постоянной на протяжении всей процедуры.
5. Карандашом подпишите каждый слайд, который будет использоваться, номером партии, датой, типом ячейки и любой другой идентифицирующей информацией, необходимой для хранения, и поместите его в камеру слайдов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство маркеров, ручек или этикеток не выдержат будущего этапа фиксации ацетона (шаг 2.9).
6. Нанесите 50 мкл вирусного разведения в каждую лунку на предметных стеклах микроскопа с помощью повторяющейся пипетки. Затем нанесите 50 мкл клеточного разведения на каждую лунку, стараясь не загрязнить наконечник пипетки вирусом, уже находящимся на лунке.
7. Закройте камеру влажности и поместите ее во влажный инкубатор при температуре 34-36 °C. Оценивают инфекционность клеток через 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.8-2.12 только на одном слайде.
8. Извлеките предметное стекло из камеры влажности и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость. Вымойте предметное стекло в банке Coplin с фосфатным буфером (PBS) в течение 2 минут, затем дайте предметному стеколу высохнуть на воздухе.
9. Поместите предметное стекло в банку Coplin и зафиксируйте предметное стекло в холодном ацетоне минимум на 1 час в морозильной камере с температурой -20 °C, разрешенной для легковоспламеняющихся материалов. Все процедуры заливки ацетоном и сушки на воздухе выполняйте в вытяжном шкафу.
10. Дайте ацетону испариться и высохнуть. Конъюгат антител прямого действия против бешенства (ДФА), приготовленный в соответствии с инструкцией производителя, нанести на лунки предметного стекла и инкубировать в течение 30 мин во влажном инкубаторе 34-36 °С.
11. Вымойте предметное стекло в банках Coplin PBS дважды по 2 минуты каждая. Высушите слайд на воздухе.
12. Установите покровное стекло с 0,05 М Tris, 0,15 М NaCl (pH 9,0) и 20% глицериновым креплением и считывают предметное стекло с помощью флуоресцентного микроскопа при 200-кратном увеличении, чтобы оценить инфекционность. Если клетки не инфицированы примерно на 50%, повторяйте шаги 2.7-2.12 на следующий день до тех пор, пока не будет достигнута желаемая инфекционность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекционность клеток аппроксимируется на основе визуальной оценки соотношения отрицательных клеток к бешенству-положительным клеткам на предметном стекле. Отрицательные клетки имеют красный цвет, в то время как положительные клетки имеют зеленое флуоресцентное окрашивание.
13. Удалите оставшиеся предметные стекла из инкубатора и камеры влажности. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из каждой лунки, затем поместите предметные стекла в банку (банки) Coplin с PBS на 1-2 минуты. Сушите предметные стекла на воздухе в течение примерно 30 минут. Храните предметные стекла при температуре -80 °C до использования.

3. Пробоподготовка

1. Подготовьте разведения сыворотки крови пациента или образца спинномозговой жидкости для исследования. Приготовьте необходимый конъюгат для правильной рабочей концентрации, разбавленный в PBS 0,05% синего Эванса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением держите конъюгат в темноте, чтобы сохранить целостность флуорофора

4. Процедура IFA

1. Удалите необходимое количество подготовленных антигенных стекол, необходимых для каждого анализа, и дайте предметным стеклам полностью разморозиться и высохнуть.
2. Поместите предметные стекла в банку (банки) Coplin и зафиксируйте их в холодном ацетоне на срок от 2 часов до ночи в морозильной камере с температурой -20 °C, одобренной для легковоспламеняющихся материалов. Выньте предметные стекла из ацетона и дайте высохнуть на воздухе.
3. Поместите предметные стекла в коробку с камерой влажности внутри BSC с впитывающими полосками, пропитанными dH₂O, для поддержания влажности. Нанесите 50 мкл каждого разведения пробы, контрольного образца или PBS в предварительно определенную лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый предметный камень должен содержать соответствующее количество лунок для образцов пациента, положительный контроль, отрицательный контроль и контрольный колодец PBS.
4. Поместите закрытую камеру влажности во влажный инкубатор с температурой 37 °C, 5%_CO2 . Инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут, затем извлеките камеру влажности из инкубатора и поместите ее в BSC.
5. Используйте наконечник аспиратора, чтобы осторожно отсасывать надосадочную жидкость из каждой лунки, следя за тем, чтобы не нарушить монослой клетки. Используйте стерильную пипетку-капельницу, чтобы нанести по одной капле PBS на каждую лунку.
6. Повторите тщательную аспирацию, затем поместите каждое предметное стекло в банку Coplin, наполненную PBS, и промойте дважды в общей сложности 15 минут.
7. Поместите предметные стекла обратно во влажную камеру и нанесите 50 мкл соответствующего конъюгата античеловеческих антител на каждую лунку. Повторите шаги 4.4–4.6.
8. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе, установите защитный лист с монтажным материалом и считайте предметные стекла под флуоресцентным микроскопом.

5. Анализ слайдов

1. Классифицируйте образцы на основе характера окрашивания и интенсивности флуоресценции в сравнении с положительными контрольными образцами с подтвержденным высоким титром антител к бешенству.
2. Оценивайте образцы по шкале отрицательных, 1+, 2+, 3+ и 4+, при этом отрицательный результат показывает отсутствие флуоресцентного окрашивания, а 4+ представляет ярко-зеленую флуоресценцию цвета яблока с рисунком окрашивания, похожим на положительные контрольные образцы¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый цвет яблока относится только к антителам, меченным FITC; Цвет варьируется в зависимости от выбора флуорофора.
3. Присвойте образцам значение конечной точки, представленное коэффициентом разбавления, при котором образец имеет степень 1-2+. Испытайте образцы с более высоким коэффициентом разбавления, если конечная точка не была достигнута при первоначальном анализе.

Результаты

Все образцы сыворотки крови были взяты у пациентов примерно в те же сроки после приема ДКП. Образцы были протестированы от пяти разных пациентов в следующие моменты времени: через 2 недели после последней прививки вакцины против бешенства, через 6 месяцев после серии вакцинации против б...

Обсуждение

В тесте IFA используется комплекс антиген-антитело, позволяющий визуализировать антитела, специфичные для бешенства. Клетки нейробластомы или BHK высевают на предметные стекла микроскопа с многолуночным покрытием из ПТФЭ и инокулируют лабораторным штаммом вируса бешенства CVS-11. После т?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM