Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern

Zusammenfassung

Ziel dieses Manuskripts ist es, den Einsatz des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests für Tollwut zum Nachweis von tollwutspezifischen IgG- und IgM-Antikörpern zu untersuchen.

Zusammenfassung

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) wurde entwickelt, um verschiedene tollwutspezifische Antikörper-Isotypen in Seren oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit nachzuweisen. Dieser Test liefert schnelle Ergebnisse und kann zum Nachweis von Tollwut-Antikörpern in verschiedenen Szenarien verwendet werden. Der Tollwut-IFA-Test ist besonders nützlich für den schnellen und frühen Nachweis von Antikörpern, um die Immunantwort bei einem Patienten, der an Tollwut erkrankt ist, zu bewerten. Obwohl andere Methoden zur antemortalen Tollwutdiagnostik Vorrang haben, kann dieser Test verwendet werden, um eine kürzliche Exposition gegenüber dem Tollwutvirus durch Antikörpernachweis nachzuweisen. Der IFA-Test liefert keinen virusneutralisierenden Antikörpertiter (VNA), aber die Reaktion auf die Präexpositionsprophylaxe (PrEP) kann durch positives oder negatives Antikörpervorhandensein bewertet werden. Dieser Test kann in verschiedenen Situationen eingesetzt werden und Ergebnisse für eine Reihe verschiedener Ziele liefern. In dieser Studie verwendeten wir mehrere gepaarte Serumproben von Personen, die PrEP erhielten und ihre Tollwut-Antikörperpräsenz im Laufe der Zeit mit dem IFA-Test nachweisen konnten.

Einleitung

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) dient zum Nachweis verschiedener tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder im Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Er gehört zu einem Arsenal von Tests, die für die Überwachung eines antemortalen Tollwutpatienten zur Verfügung stehen. Es ist besonders nützlich für die Früherkennung von Antikörpern, um die Immunantwort eines Patienten auf eine Tollwutinfektion zu bewerten. In Verbindung mit anderen Tests, der Anamnese und dem Impfstatus des Patienten kann der IFA-Test bei der Bestimmung der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einem Impfstoff helfen¹. Da der IFA-Test IgM und/oder IgG misst, können die Werte des spezifischen Antikörpers einen ungefähren Zeitrahmen von der Exposition gegenüber dem Antigen¹ anzeigen. Dieser Test kann in den aufgeführten Anwendungen oder anderen, die noch nicht untersucht wurden, nützlich sein.

Es stehen mehrere serologische Tollwuttests zur Verfügung. Der Fluoreszenz-Fokus-Inhibitions-Schnelltest (RFFIT), der Fluoreszenz-Antikörper-Virus-Neutralisationstest (FAVN) oder deren Modifikationen sind die primären Methoden zur Messung von Tollwutvirus-neutralisierenden Antikörpern (RVNAs)¹. Diese Tests unterscheiden jedoch nicht zwischen IgM- und IgG-Antikörpern. Wenn die Differenzierung des Antikörper-Isotyps für die Überwachung der Tollwut-Immunantwort wichtig ist, werden die Tollwut-IFA- und die Tollwut-ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) verwendet, die jedoch keine RVNAs messen. Obwohl die IFA- und ELISA-Tests verwendet werden können, um das Vorhandensein von tollwutspezifischen Antikörpern in einer Probe zu bestimmen, gibt es einige Unterschiede in der Art und Weise, wie sie durchgeführt werden. Der IFA-Test verwendet ein zellkultiviertes lebendes Virus als Antigensubstrat, während ein typischer ELISA für den Tollwutnachweis eines oder mehrere der viralen Proteine verwendet. In einer Laborumgebung, in der das Tollwutvirus kultiviert werden kann, kann der IFA-Test einfacher durchgeführt werden, anstatt einzelne virale Proteine für den ELISA zu kaufen oder zu kultivieren. Der Zweck der Untersuchung und die Informationen, die aus den Ergebnissen eines serologischen Tollwuttests gewonnen werden, sollten bei der Entscheidung berücksichtigt werden, welche zu wählen^{ist 2}.

IgM reagiert zuerst und steigt an, bis etwa am 28. Tag ein Klassenwechsel beobachtet wird, an dem IgG zum vorherrschenden zirkulierenden Antikörper^{wird 3}. Daher wäre IgM nur für einen begrenzten Zeitraum nach der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einer Impfung zu erwarten. Die Untersuchung von Serum und Liquor cerebrospinalis (CSF) kann darauf hinweisen, ob die Exposition durch eine Impfung erfolgte, bei der Antikörper nur in Seren zu sehen sind, oder durch eine Virusinfektion, die möglicherweise Antikörper im Liquor¹ aufweisen würde.

Es wurde festgestellt, dass Tollwut-Antikörper nach einer Präexpositionsprophylaxe (PrEP) mehrere Jahre ^{persistieren4}. Der IFA-Test kann ein nützliches Instrument sein, um dies zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung oder Exposition nachzuweisen.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde vom Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Entwicklung von Assays für die ethische Verwendung von menschlichen Proben genehmigt, Protokollgenehmigungsnummer #03-019.

1. Sicherheit

1. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), mindestens Augenschutz (Brille oder Gesichtsschutz), eine chirurgische Maske und latexfreie Handschuhe.
2. Stellen Sie sicher, dass das Personal gegen Tollwut geimpft ist und dass innerhalb der letzten 6 Monate ein Titer von ≥0,5 IE/ml nachgewiesen wurde.

2. Vorbereitung des Antigen-Objektträgers

HINWEIS: Führen Sie alle Virus-, Liquor- und Serummanipulationen in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) unter Verwendung universeller Vorsichtsmaßnahmen durch.

1. Bereiten Sie 20 ml Maus-Neuroblastom- oder BHK-21-Zellen auf eine Konzentration von 3,0 x 10⁵ Zellen/ml in den minimal essentiellen Medien von Eagle vor, die mit 10 % fötalem Kälberserum (EGM) ergänzt werden, und lassen Sie sie bis zur Verwendung kalt.
2. Bereiten Sie das CVS-11-Virus vor, indem Sie es in EGM auf eine Arbeitsverdünnung von 1,0 x 10^6,5 50 % infektiöser Gewebekulturdosis (TCID₅₀) pro Milliliter verdünnen und bis zur Verwendung kalt stellen.
   ANMERKUNG: TCID₅₀ wird nach der zuvor veröffentlichten Reed- und Muench-Methode bestimmt⁵.
3. Reinigen Sie eine Feuchtigkeits-Objektträgerkammer und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichtete Objektträger mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie in der BSC an der Luft trocknen.
4. Geben Sie destilliertes Wasser (dH₂O) zu saugfähigen Papierstreifen in der Objektträgerkammer, um sicherzustellen, dass die Luftfeuchtigkeit während des gesamten Verfahrens konstant bleibt.
5. Beschriften Sie jeden zu verwendenden Objektträger mit einem Bleistift mit der Chargennummer, dem Datum, dem Zellentyp und allen anderen für die Lagerung erforderlichen identifizierenden Informationen und legen Sie sie in die Objektträgerkammer.
   HINWEIS: Die meisten Marker, Stifte oder Etiketten halten dem zukünftigen Aceton-Fixierungsschritt (Schritt 2.9) nicht stand.
6. Tragen Sie 50 μl Virusverdünnung mit einer sich wiederholenden Pipette auf jedes Well auf den Objektträgern auf. Tragen Sie dann 50 μl Zellverdünnung auf jede Vertiefung auf und achten Sie darauf, die Pipettenspitze nicht mit dem Virus zu kontaminieren, das sich bereits auf der Vertiefung befindet.
7. Schließen Sie die Feuchte-Objektträgerkammer und stellen Sie sie bei 34-36 °C in den feuchten Inkubator. Beurteilen Sie die Zellinfektiosität nach 24 Stunden.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.8 bis 2.12 nur auf einer Folie aus.
8. Nehmen Sie den Objektträger aus der Feuchtigkeitskammer und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Waschen Sie den Objektträger 2 Minuten lang in einem mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllten Coplin-Glas und lassen Sie den Objektträger dann an der Luft trocknen.
9. Legen Sie den Objektträger in das Coplin-Glas und fixieren Sie den Objektträger mindestens 1 Stunde lang in kaltem Aceton in einem Gefrierschrank bei -20 °C, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Führen Sie alle Acetongieß- und Lufttrocknungsvorgänge in einem Abzug durch.
10. Lassen Sie das Aceton ablüften und trocknen lassen. Tollwut-Direktfluoreszenz-Antikörper-Konjugat (DFA), das gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde, auf die Vertiefungen des Objektträgers auftragen und 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 34-36 °C inkubieren.
11. Waschen Sie den Objektträger zweimal für jeweils 2 Minuten in Coplin-Gläsern mit PBS. Trocknen Sie die Folie an der Luft.
12. Montieren Sie ein Deckglas mit 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) und 20 % Glycerin-Eindeckmittel und lesen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung ab, um die Infektiosität zu beurteilen. Wenn die Zellen nicht zu etwa 50 % infiziert sind, wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.12 am nächsten Tag, bis die gewünschte Infektiosität erreicht ist.
    HINWEIS: Die Zellinfektiosität wird auf der Grundlage der visuellen Bewertung des Verhältnisses von negativen Zellen zu tollwutpositiven Zellen auf der Objektträgervertiefung angenähert. Negative Zellen erscheinen rot, während positive Zellen eine grüne Fluoreszenzfärbung aufweisen.
13. Entfernen Sie die restlichen Objektträger aus dem Inkubator und der Feuchtigkeitskammer. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung an und legen Sie die Objektträger dann für 1-2 Minuten in ein oder mehrere Coplin-Gläser mit PBS. Lassen Sie die Objektträger ca. 30 Minuten an der Luft trocknen. Lagern Sie die Objektträger bis zur Verwendung bei -80 °C.

3. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie die Verdünnungen von Patientenserum oder Liquorproben für den Test vor. Bereiten Sie das notwendige Konjugat für eine ordnungsgemäße Arbeitskonzentration vor, verdünnt in PBS mit 0,05 % Evansblau.
   HINWEIS: Bewahren Sie das Konjugat vor der Anwendung im Dunkeln auf, um die Integrität des Fluorophors zu erhalten

4. IFA-Verfahren

1. Entfernen Sie die erforderliche Anzahl von vorbereiteten Antigen-Objektträgern, die für jeden Assay benötigt werden, und lassen Sie die Objektträger auftauen und vollständig trocknen.
2. Legen Sie die Objektträger in ein oder mehrere Coplin-Gläser und fixieren Sie die Objektträger in kaltem Aceton für 2 Stunden bis über Nacht in einem Gefrierschrank bei -20 °C, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Aceton und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
3. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammerbox im Inneren des BSC mit dH₂O-getränkten Saugstreifen, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Tragen Sie 50 μl jeder Probenverdünnung, Kontrollprobe oder PBS auf die vorbestimmte Vertiefung auf.
   HINWEIS: Jeder Objektträger muss eine angemessene Anzahl von Patientenproben, Positivkontroll-, Negativkontroll- und PBS-Zellkontroll-Wells enthalten.
4. Die geschlossene Feuchte-Objektträgerkammer wird in einen 37 °C warmen, 5 % CO₂ -feuchten Inkubator gestellt. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang, nehmen Sie dann die Feuchtigkeitsobjektträgerkammer aus dem Inkubator und legen Sie sie in einen BSC.
5. Verwenden Sie eine Absaugspitze, um den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung anzusaugen, und stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht nicht gestört wird. Verwenden Sie eine sterile Tropfpipette, um einen Tropfen PBS auf jede Vertiefung aufzutragen.
6. Wiederholen Sie die sorgfältige Aspiration, legen Sie dann jeden Objektträger in ein mit PBS gefülltes Coplin-Glas und waschen Sie es zweimal für insgesamt 15 Minuten.
7. Legen Sie die Objektträger zurück in die Feuchtigkeitskammer und tragen Sie 50 μl geeignetes Anti-Human-Antikörper-Konjugat auf jede Vertiefung auf. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.6.
8. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen, montieren Sie ein Deckglas mit Eindeckmedien und lesen Sie die Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop ab.

5. Analyse der Objektträger

1. Einstufung der Proben auf der Grundlage des Färbemusters und der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu positiven Kontrollproben mit bestätigtem hohen Antikörpertiter gegen Tollwut.
2. Bewerten Sie die Proben auf einer Skala von negativ, 1+, 2+, 3+ und 4+, wobei ein negatives Ergebnis keine Fluoreszenzfärbung zeigt und 4+ eine hellgrüne apfelfarbene Fluoreszenz mit einem Färbemuster ähnlich wie bei positiven Kontrollproben^{darstellt 1}.
   HINWEIS: Die Farbe des grünen Apfels gilt nur für FITC-markierte Antikörper. Die Farbe variiert je nach Auswahl des Fluorophors.
3. Weisen Sie den Proben einen Endpunktwert zu, der durch den Verdünnungsfaktor dargestellt wird, bei dem die Probe einen Gehalt von 1-2+ aufweist. Testen Sie die Proben mit einem höheren Verdünnungsfaktor, wenn der Endpunkt im ersten Assay nicht erreicht wird.

Ergebnisse

Alle Serumproben wurden den Patienten in etwa gleichen Zeiträumen nach der PrEP entnommen. Die Proben wurden von fünf verschiedenen Patienten zu folgenden Zeitpunkten getestet: 2 Wochen nach der letzten Tollwutimpfung, 6 Monate nach der Tollwutimpfserie und 18 Monate nach der Tollwutimpfserie. Jede Serumprobe wurde nacheinander verdünnt und sowohl für das Vorhandensein von IgM als auch für IgG eingestuft, wie in den Protokollschritten 5.2 und 5.3 beschrieben. Der zugewiesene Antikörperwert stellt den Verdünnungsfa...

Diskussion

Der IFA-Test nutzt einen Antigen-Antikörper-Komplex, der eine Markierungsstelle zur Visualisierung tollwutspezifischer Antikörper ermöglicht. Neuroblastom- oder BHK-Zellen werden auf PTFE-beschichtete Objektträger mit mehreren Wells gesetzt und mit dem Tollwutvirus-Laborstamm CVS-11 inokuliert. Sobald die Monoschicht konfluiert ist und die Zellen die gewünschte Infektiosität von ca. 50 % erreicht haben, werden die Objektträger bis zur Gebrauchsbereitschaft gelagert⁶.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM