광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출

요약

이 원고의 목적은 광견병 특이적 IgG 및 IgM 항체 검출을 위한 광견병 간접 형광 항체 검사의 사용을 조사하는 것입니다.

초록

광견병 간접 형광 항체(IFA) 검사는 혈청 또는 뇌척수액에서 다양한 광견병 특이적 항체 동형을 검출하기 위해 개발되었습니다. 이 검사는 빠른 결과를 제공하며 여러 가지 시나리오에서 광견병 항체를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 광견병 IFA 검사는 광견병이 발병한 환자의 면역 반응을 평가하기 위한 항체를 빠르고 조기에 발견하는 데 특히 유용합니다. 광견병 사전 진단을 위한 다른 방법이 우선하지만, 이 검사는 항체 검출을 통해 최근의 광견병 바이러스 노출을 입증하는 데 활용될 수 있습니다. IFA 검사는 바이러스 중화 항체(VNA) 역가를 제공하지 않지만, 노출 전 예방(PrEP) 반응은 양성 또는 음성 항체 존재를 통해 평가할 수 있습니다. 이 테스트는 다양한 상황에서 활용될 수 있으며 다양한 대상에 대한 결과를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 PrEP를 투여받은 개인의 여러 쌍을 이루는 혈청 샘플을 사용하고 IFA 테스트를 사용하여 시간이 지남에 따라 광견병 항체의 존재를 입증했습니다.

서문

광견병 간접 형광 항체(IFA) 검사는 혈청 또는 뇌척수액에서 다양한 광견병 특이적 항체 동형을 검출하는 데 사용됩니다. 그것은 부검 전 광견병 환자를 모니터링하는 데 사용할 수 있는 다양한 검사 중 하나입니다. 광견병 감염에 대한 환자의 면역 반응을 평가하기 위해 항체를 조기에 발견하는 데 특히 유용합니다. 다른 검사, 증례 기록 및 환자의 백신 접종 상태와 함께 사용할 경우, IFA 검사는 광견병 바이러스 또는 백신에 대한 노출을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다¹. IFA 검사는 IgM 및/또는 IgG를 측정하기 때문에 특정 항체의 값은 항원¹에 노출된 시점의 대략적인 기간을 나타낼 수 있습니다. 이 테스트는 나열된 응용 프로그램이나 아직 탐색되지 않은 다른 응용 프로그램에서 유용할 수 있습니다.

몇 가지 광견병 혈청학적 분석이 있습니다. 신속 형광 초점 억제 검사(RFFIT), 형광 항체 바이러스 중화 검사(FAVN) 검사 또는 이들의 변형은 광견병 바이러스 중화 항체(RVNA^)를 측정하는 주요 방법입니다1. 그러나 이러한 검사는 IgM 항체와 IgG 항체를 구별하지 않습니다. 광견병 면역 반응을 모니터링하는 데 항체 동형을 구별하는 것이 중요한 경우 광견병 IFA 및 광견병 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 검사가 사용되지만 RVNA를 측정하지는 않습니다. IFA 및 ELISA 검사는 샘플에서 광견병 특이 항체의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있지만 실행 방법에는 몇 가지 차이점이 있습니다. IFA 검사는 세포 배양 살아있는 바이러스를 항원 기질로 사용하는 반면, 광견병 검출을 위한 일반적인 ELISA는 하나 이상의 바이러스 단백질을 사용합니다. 광견병 바이러스를 배양할 수 있는 실험실 환경에서, ELISA를 위한 개별 바이러스 단백질을 구매하거나 배양하는 대신 IFA 테스트를 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 검사 목적과 광견병 혈청학적 분석 결과에서 얻은 정보는 어떤 것을 선택할지 결정할 때 고려해야 합니다².

IgM이 가장 먼저 반응하며, 약 28일째에 클래스 전환이 관찰될 때까지 증가하며, 이 시점에서 IgG가 우세한 순환 항체가 됩니다³. 따라서 IgM은 광견병 바이러스에 노출되거나 백신 접종을 받은 후 제한된 시간 동안만 나타날 수 있습니다. 혈청과 뇌척수액(CSF)을 모두 검사하면 혈청에서만 항체가 나타나는 백신 접종을 통해 노출되었는지 아니면 뇌척수액¹에서 항체가 나타날 수 있는 바이러스 감염으로 인한 것인지 알 수 있습니다.

광견병 항체는 노출 전 예방(PrEP^{) 후} 몇 년 동안 지속되는 것으로 확인되었습니다4. IFA 테스트는 백신 접종 또는 노출 후 다양한 시점에서 이를 입증하는 유용한 도구가 될 수 있습니다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 분석 개발을 위해 뉴욕주 보건부 워즈워스 센터(Wadsworth Center for assay development)에서 인체 샘플의 윤리적 사용을 승인했으며, 프로토콜 승인 번호 #03-019입니다.

1. 안전

1. 개인 보호 장비(PPE), 최소한의 눈 보호 장비(안경 또는 안면 보호대), 수술용 마스크 및 비라텍스 장갑을 착용하십시오.
2. 직원이 광견병 예방 접종을 받고 지난 6개월 이내에 ≥0.5IU/mL의 역가가 입증되었는지 확인합니다.

2. 항원 슬라이드 준비

알림: 모든 바이러스, CSF 및 혈청 조작은 범용 예방 조치를 사용하여 생물 안전 캐비닛(BSC)에서 수행합니다.

1. 10% 소 태아 혈청(EGM)이 보충된 Eagle의 최소 필수 배지에 3.0 x 10⁵ cells/mL 농도로 마우스 신경모세포종 또는 BHK-21 세포 20mL를 준비하고 사용할 때까지 차갑게 보관합니다.
2. EGM에서 밀리리터당 1.0 x 10^6.5 50% 조직 배양 감염 선량(TCID₅₀)의 작업 희석으로 희석하여 CVS-11 바이러스를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 차갑게 보관합니다.
   참고: TCID₅₀ 은 이전에 발표된 Reed and Muench 방법에 의해 결정됩니다⁵.
3. 습도 슬라이드 챔버와 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 코팅된 웰 현미경 슬라이드를 70% 에탄올로 세척하고 BSC에서 자연 건조합니다.
4. 슬라이드 챔버의 흡수성 종이 스트립에 증류수(dH₂O)를 추가하여 절차 내내 습도가 일정하게 유지되도록 합니다.
5. 연필을 사용하여 사용할 각 슬라이드에 로트 번호, 날짜, 셀 유형 및 보관에 필요한 기타 식별 정보와 함께 레이블을 지정하고 슬라이드 챔버에 넣습니다.
   알림: 대부분의 마커, 펜 또는 라벨은 향후 아세톤 고정 단계(2.9단계)를 견디지 못합니다.
6. 반복 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드의 각 웰에 50μL의 바이러스 희석액을 적용합니다. 그런 다음 각 웰에 50μL의 세포 희석액을 적용하고 웰에 이미 있는 바이러스로 피펫 팁을 오염시키지 않도록 주의합니다.
7. 습도 슬라이드 챔버를 닫고 34-36°C의 습한 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 후 세포 감염성을 평가합니다.
   참고: 하나의 슬라이드에서만 2.8-2.12단계를 수행합니다.
8. 습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 코플린 항아리에서 슬라이드를 2분 동안 세척한 다음 슬라이드를 자연 건조시킵니다.
9. 슬라이드를 코플린 병에 넣고 가연성 물질에 대해 승인된 -1°C 냉동고에서 최소 20시간 동안 차가운 아세톤으로 슬라이드를 고정합니다. 흄 후드에서 모든 아세톤 주입 및 공기 건조 절차를 수행하십시오.
10. 아세톤이 번쩍이고 밀어 건조시키십시오. 제조업체의 지침에 따라 준비한 광견병 직접 형광 항체(DFA) 접합체를 슬라이드의 웰에 적용하고 34-36°C의 습한 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
11. PBS의 코플린 병에 슬라이드를 각각 2분 동안 두 번 씻습니다. 슬라이드를 자연 건조시킵니다.
12. 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) 및 20 % 글리세롤 마운터로 커버 슬립을 장착하고 200 배 배율의 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 읽고 감염성을 평가합니다. 세포가 약 50% 감염되지 않은 경우 원하는 감염도에 도달할 때까지 다음 날 2.7-2.12단계를 반복합니다.
    알림: 세포 감염률은 슬라이드 웰에서 음성 세포와 광견병 양성 세포의 비율을 시각적으로 평가하여 근사치입니다. 음성 세포는 빨간색으로 나타나고 양성 세포는 녹색 형광 염색을 나타냅니다.
13. 인큐베이터와 습도 챔버에서 나머지 슬라이드를 제거합니다. 각 웰에서 상층액을 조심스럽게 흡인한 다음 슬라이드를 PBS가 있는 코플린 병에 1-2분 동안 넣습니다. 슬라이드를 약 30분 동안 자연 건조시킵니다. 슬라이드를 사용할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.

3. 샘플 준비

1. 테스트를 위해 환자 혈청 또는 CSF 샘플 희석액을 준비합니다. PBS에 0.05% Evans blue로 희석된 적절한 작업 농도에 필요한 접합체를 준비합니다.
   NOTE: 적용하기 전에 형광단 무결성을 유지하기 위해 접합체를 어두운 곳에 보관하십시오.

4. IFA 절차

1. 각 분석에 필요한 준비된 항원 슬라이드를 필요한 수만큼 제거하고 슬라이드를 해동하고 완전히 건조시킵니다.
2. 슬라이드를 코플린 병에 넣고 가연성 물질에 대해 승인된 -20°C 냉동고에서 2시간에서 하룻밤 동안 차가운 아세톤으로 슬라이드를 고정합니다. 아세톤에서 슬라이드를 제거하고 자연 건조시킵니다.
3. 습도를 유지하기 위해 dH₂O-적신 흡수 스트립이 있는 BSC 내부의 습도 챔버 상자에 슬라이드를 놓습니다. 각 시료 희석액, 대조군 시료 또는 PBS의 50μL를 미리 결정된 웰에 적용합니다.
   참고: 각 슬라이드에는 적절한 수의 환자 샘플 웰, 양성 대조군, 음성 대조군 및 PBS 세포 대조군 웰이 포함되어야 합니다.
4. 밀폐된 습도 슬라이드 챔버를 37°C, 5% CO₂ 습한 인큐베이터에 놓습니다. 슬라이드를 30분 동안 배양한 다음 인큐베이터에서 습도 슬라이드 챔버를 제거하고 BSC에 넣습니다.
5. 아스피레이터 팁을 사용하여 각 웰에서 상층액을 조심스럽게 흡입하여 세포 단층을 방해하지 않도록 합니다. 멸균 스포이드 피펫을 사용하여 PBS 한 방울을 각 웰에 도포합니다.
6. 조심스럽게 흡인을 반복한 다음 각 슬라이드를 PBS로 채워진 코플린 병에 넣고 총 15분 동안 두 번 씻습니다.
7. 슬라이드를 습도 챔버 상자에 다시 넣고 50μL의 적절한 항인간 항체 접합체를 각 웰에 적용합니다. 4.4단계부터 4.6단계까지 반복합니다.
8. 슬라이드를 자연 건조시키고 장착 매체가 있는 커버슬립을 장착하고 형광 현미경으로 슬라이드를 읽습니다.

5. 슬라이드 분석

1. 높은 항광견병 항체 역가가 확인된 양성 대조군 샘플과 비교하여 염색 패턴 및 형광 강도를 기준으로 샘플을 등급화합니다.
2. 샘플의 등급을 음성, 1+, 2+, 3+, 4+의 척도로 매기고, 음성 결과는 형광 염색이 없음을 나타내고 4+는 양성 대조군 샘플¹과 유사한 염색 패턴의 밝은 녹색 사과색 형광을 나타냅니다.
   참고: 녹색 사과 색상은 FITC 표지 항체에만 적용됩니다. 색상은 형광단 선택에 따라 달라집니다.
3. 샘플이 1-2+ 등급을 표시하는 희석 계수로 표시되는 끝점 값을 샘플에 할당합니다. 초기 분석에서 종말점에 도달하지 못한 경우 더 높은 희석 계수에서 샘플을 테스트합니다.

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결과

모든 혈청 샘플은 PrEP 후 거의 동일한 시간대에 환자로부터 수집되었습니다. 샘플은 최종 광견병 백신 접종 후 2주, 광견병 백신 시리즈 후 6개월, 광견병 백신 시리즈 후 18개월의 시점에서 5명의 다른 환자로부터 테스트되었습니다. 각 혈청 샘플은 직렬로 희석하고 프로토콜 단계 5.2 및 5.3에 설명된 대로 IgM 및 IgG 존재 모두에 대해 등급을 매겼습니다. 할당된 항체 값은 샘플이 1-2+의 종말점 등급에...

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토론

IFA 검사는 항원-항체 복합체를 이용하여 표지 부위에서 광견병 특이적 항체를 시각화할 수 있습니다. 신경모세포종 또는 BHK 세포를 멀티웰 PTFE 코팅 현미경 슬라이드에 파종하고 광견병 바이러스 실험실 균주 CVS-11을 접종합니다. 단층이 합류하고 세포가 약 50%의 원하는 감염도에 도달하면 슬라이드를 사용할 준비가 될 때까지 보관합니다⁶.

환자 혈청 또는 CS...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well PTFE coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM