Rilevamento degli anticorpi IgG e IgM della rabbia utilizzando il test degli anticorpi fluorescenti indiretti della rabbia

Riepilogo

Lo scopo di questo manoscritto è quello di esaminare l'uso del test degli anticorpi fluorescenti indiretti per la rabbia per la rilevazione di anticorpi IgG e IgM specifici per la rabbia.

Abstract

Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) per la rabbia è stato sviluppato per rilevare vari isotipi di anticorpi anti-rabbia specifici nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Questo test fornisce risultati rapidi e può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi antirabbici in diversi scenari. Il test antirabbico IFA è particolarmente utile per la diagnosi rapida e precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria in un paziente che ha sviluppato la rabbia. Sebbene altri metodi per la diagnosi di rabbia ante mortem abbiano la precedenza, questo test può essere utilizzato per dimostrare la recente esposizione al virus della rabbia attraverso il rilevamento degli anticorpi. Il test IFA non fornisce un titolo anticorpale neutralizzante il virus (VNA), ma la risposta della profilassi pre-esposizione (PrEP) può essere valutata attraverso la presenza di anticorpi positivi o negativi. Questo test può essere utilizzato in varie situazioni e può fornire risultati per una serie di obiettivi diversi. In questo studio, abbiamo utilizzato diversi campioni di siero accoppiati di individui che hanno ricevuto la PrEP e abbiamo dimostrato la loro presenza di anticorpi antirabbici nel tempo utilizzando il test IFA.

Introduzione

Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) della rabbia viene utilizzato per rilevare vari isotipi di anticorpi specifici per la rabbia nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Fa parte di un arsenale di test disponibili per il monitoraggio di un paziente con rabbia ante mortem. È particolarmente utile per la diagnosi precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria di un paziente all'infezione da rabbia. Se utilizzato in combinazione con altri test, l'anamnesi e lo stato di vaccinazione del paziente, il test IFA può aiutare a determinare l'esposizione al virus della rabbia o a un vaccino¹. Poiché il test IFA misura le IgM e/o le IgG, i valori dell'anticorpo specifico possono indicare un lasso di tempo approssimativo dall'esposizione all'antigene¹. Questo test può essere utile nelle applicazioni elencate o in altre non ancora esplorate.

Sono disponibili diversi test sierologici per la rabbia. Il test rapido di inibizione della concentrazione fluorescente (RFFIT), il test di neutralizzazione del virus degli anticorpi fluorescenti (FAVN) o le modifiche di questi sono i metodi principali per misurare gli anticorpi neutralizzanti il virus della rabbia (RVNA)¹. Tuttavia, questi test non differenziano gli anticorpi IgM e IgG. Quando la differenziazione dell'isotipo anticorpale è importante nel monitoraggio della risposta immunitaria della rabbia, vengono utilizzati i test IFA della rabbia e il test ELISA (Rabies Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), che però non misurano le RVNA. Sebbene i test IFA ed ELISA possano essere utilizzati per determinare la presenza di anticorpi specifici per la rabbia in un campione, ci sono alcune differenze nel modo in cui vengono eseguiti. Il test IFA utilizza un virus vivo in coltura cellulare come substrato dell'antigene, mentre un tipico test ELISA per il rilevamento della rabbia utilizza una o più proteine virali. In un ambiente di laboratorio in cui il virus della rabbia può essere coltivato, il test IFA può essere eseguito più facilmente invece di acquistare o coltivare singole proteine virali per l'ELISA. Lo scopo del test e le informazioni raccolte dai risultati di qualsiasi test sierologico della rabbia devono essere presi in considerazione quando si determina quale scegliere².

Le IgM sono le prime a rispondere, aumentando fino a quando non si osserva il cambio di classe intorno al giorno 28, a quel punto le IgG diventano l'anticorpo circolante³ predominante. Pertanto, le IgM sarebbero previste solo per un periodo di tempo limitato dopo l'esposizione al virus della rabbia o la vaccinazione. L'analisi sia del siero che del liquido cerebrospinale (CSF) può indicare se l'esposizione è avvenuta attraverso la vaccinazione, in cui gli anticorpi sarebbero visibili solo nel siero, o da un'infezione virale, che potenzialmente mostrerebbe anticorpi nel CSF¹.

È stato stabilito che gli anticorpi antirabbici persistono per diversi anni dopo la profilassi pre-esposizione (PrEP)⁴. Il test IFA può essere uno strumento utile per dimostrarlo in diversi momenti successivi alla vaccinazione o all'esposizione.

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Protocollo

Il seguente protocollo è stato approvato per l'uso etico di campioni umani dal Wadsworth Center del Dipartimento della Salute dello Stato di New York per lo sviluppo di test, numero di approvazione del protocollo #03-019.

1. Sicurezza

1. Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), una protezione minima per gli occhi (occhiali o visiera), una mascherina chirurgica e guanti non in lattice.
2. Assicurarsi che il personale sia vaccinato per la rabbia e che sia stato dimostrato un titolo di ≥0,5 UI/mL negli ultimi 6 mesi.

2. Preparazione dei vetrini antigenici

NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni di virus, liquor e siero in una cabina di biosicurezza (BSC) utilizzando le precauzioni universali.

1. Preparare 20 mL di neuroblastoma di topo o cellule BHK-21 a una concentrazione di 3,0 x 10⁵ cellule/mL nei terreni minimi essenziali di Eagle integrati con il 10% di siero fetale bovino (EGM) e conservare al freddo fino all'uso.
2. Preparare il virus CVS-11 diluendo in EGM a una diluizione di lavoro di 1,0 x 10^6,5 50% di dose infettiva di coltura tissutale (TCID₅₀) per millilitro e conservare al freddo fino al momento dell'uso.
   NOTA: TCID₅₀ è determinato dal metodo Reed e Muench pubblicato in precedenza⁵.
3. Pulire una camera di controllo dell'umidità e i vetrini per microscopio rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE) con etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria nel BSC.
4. Aggiungere acqua distillata (dH₂O) alle strisce di carta assorbente nella camera dei vetrini per garantire che l'umidità rimanga costante durante tutta la procedura.
5. Utilizzando una matita, etichettare ogni vetrino da utilizzare con il numero di lotto, la data, il tipo di cella e qualsiasi altra informazione identificativa necessaria per la conservazione e posizionarlo nella camera del vetrino.
   NOTA: La maggior parte dei pennarelli, delle penne o delle etichette non resisterà alla futura fase di fissazione dell'acetone (passaggio 2.9).
6. Applicare 50 μL di diluizione virale su ciascun pozzetto sui vetrini del microscopio con una pipetta a ripetizione. Quindi, applicare 50 μL di diluizione cellulare su ciascun pozzetto, facendo attenzione a non contaminare il puntale della pipetta con il virus già presente nel pozzetto.
7. Chiudere la camera del vetrino di umidità e posizionarla nell'incubatrice umida a 34-36 °C. Valutare l'infettività cellulare dopo 24 ore.
   NOTA: Eseguire i passaggi 2.8-2.12 su una sola diapositiva.
8. Rimuovere il vetrino dalla camera di umidità e aspirare con cautela il surnatante. Lavare il vetrino in un barattolo Coplin riempito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 2 minuti, quindi lasciare asciugare il vetrino all'aria.
9. Mettere il vetrino nel barattolo Coplin e fissarlo in acetone freddo per almeno 1 ora in un congelatore a -20 °C approvato per materiali infiammabili. Eseguire tutte le procedure di versamento e asciugatura all'aria dell'acetone in una cappa aspirante.
10. Lasciare che l'acetone appaspia e scivolare ad asciugare. Applicare il coniugato anticorpo fluorescente diretto antirabbico (DFA) preparato secondo le istruzioni del produttore sui pozzetti del vetrino e incubare per 30 minuti in un'incubatrice umida a 34-36 °C.
11. Lavare il vetrino in barattoli Coplin di PBS due volte per 2 minuti ciascuno. Asciugare il vetrino all'aria.
12. Montare un vetrino coprioggetto con 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) e 20% di montante di glicerolo e leggere il vetrino utilizzando un microscopio fluorescente con ingrandimento 200x per valutare l'infettività. Se le cellule non sono infette per circa il 50%, ripetere i passaggi 2.7-2.12 il giorno successivo fino a raggiungere l'infettività desiderata.
    NOTA: L'infettività cellulare è approssimata in base alla valutazione visiva del rapporto tra cellule negative e cellule positive alla rabbia sul pozzetto del vetrino. Le cellule negative appaiono di colore rosso, mentre le cellule positive mostrano una colorazione fluorescente verde.
13. Rimuovere i vetrini rimanenti dall'incubatrice e dalla camera di umidità. Aspirare con cura il surnatante da ciascun pozzetto, quindi posizionare i vetrini in uno o più barattoli Coplin con PBS per 1-2 minuti. Asciugare i vetrini all'aria per circa 30 minuti. Conservare i vetrini a -80 °C fino al momento dell'uso.

3. Preparazione del campione

1. Preparare le diluizioni del campione di siero o di liquido cerebrospinale del paziente per il test. Preparare il coniugato necessario per una corretta concentrazione di lavoro diluito in PBS con blu Evans allo 0,05%.
   NOTA: Tenere il coniugato al buio per mantenere l'integrità del fluoroforo prima dell'applicazione

4. Procedura IFA

1. Rimuovere il numero necessario di vetrini antigenici preparati necessari per ciascun test e lasciare che i vetrini si scongelino e si asciughino completamente.
2. Mettere i vetrini in uno o più barattoli Coplin e fissarli in acetone freddo per un periodo compreso tra 2 ore e una notte in un congelatore a -20 °C approvato per materiali infiammabili. Rimuovere i vetrini dall'acetone e lasciarli asciugare all'aria.
3. Posizionare i vetrini in una scatola della camera di umidità all'interno del BSC con strisce assorbenti imbevute di dH₂O per mantenere l'umidità. Applicare 50 μL di ciascuna diluizione del campione, campione di controllo o PBS al pozzetto predeterminato.
   NOTA: Ogni vetrino deve contenere un numero appropriato di pozzetti per campioni del paziente, controllo positivo, controllo negativo e pozzetto di controllo delle cellule PBS.
4. Posizionare la camera chiusa del vetrino di umidità in un'incubatrice umida a 37 °C, 5% di CO₂ . Incubare i vetrini per 30 minuti, quindi rimuovere la camera dei vetrini di umidità dall'incubatrice e posizionarla in un BSC.
5. Utilizzare una punta di aspirazione per aspirare con cura il surnatante da ciascun pozzetto, assicurandosi di non disturbare il monostrato cellulare. Utilizzare una pipetta contagocce sterile per applicare una goccia di PBS su ciascun pozzetto.
6. Ripetere l'aspirazione accurata, quindi mettere ogni vetrino in un barattolo Coplin riempito di PBS e lavare due volte per un totale di 15 minuti.
7. Riposizionare i vetrini nella scatola della camera di umidità e applicare 50 μL di coniugato anticorpale anti-umano appropriato a ciascun pozzetto. Ripetere i passaggi da 4.4 a 4.6.
8. Lasciare asciugare i vetrini all'aria, montare un vetrino coprioggetti con i supporti di montaggio e leggere i vetrini al microscopio a fluorescenza.

5. Analisi dei vetrini

1. Classificare i campioni in base al modello di colorazione e all'intensità della fluorescenza rispetto ai campioni di controllo positivi con un titolo anticorpale antirabbico elevato confermato.
2. Classificare i campioni su una scala di negativo, 1+, 2+, 3+ e 4+, con un risultato negativo che non mostra alcuna colorazione fluorescente e 4+ che rappresenta una fluorescenza di colore mela verde brillante con un modello di colorazione simile ai campioni di controllo positivo¹.
   NOTA: Il colore verde mela si applica solo agli anticorpi marcati con FITC; Il colore varia a seconda della selezione del fluoroforo.
3. Assegnare ai campioni un valore del punto finale rappresentato dal fattore di diluizione in corrispondenza del quale il campione visualizza un grado 1-2+. Testare i campioni con un fattore di diluizione più elevato se il punto finale non viene raggiunto nel saggio iniziale.

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Risultati

Tutti i campioni di siero sono stati raccolti dai pazienti all'incirca nello stesso periodo di tempo dopo la PrEP. I campioni sono stati testati da cinque diversi pazienti nei seguenti momenti: 2 settimane dopo l'inoculazione finale del vaccino antirabbico, 6 mesi dopo la serie di vaccini antirabbici e 18 mesi dopo la serie di vaccini antirabbici. Ogni campione di siero è stato diluito in serie e classificato sia per la presenza di IgM che di IgG, come descritto nelle fasi 5.2 e 5.3 del protocollo. Il valore anticorpale...

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Discussione

Il test IFA sfrutta un complesso antigene-anticorpo, consentendo a un sito di marcatura di visualizzare gli anticorpi specifici per la rabbia. Le cellule di neuroblastoma o BHK vengono seminate su vetrini da microscopio rivestiti in PTFE a più pozzetti e inoculate con il ceppo di laboratorio CVS-11 del virus della rabbia. Una volta che il monostrato è confluente e le cellule raggiungono l'infettività desiderata di circa il 50%, i vetrini vengono conservati fino al momento dell'uso⁶.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well PTFE coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM