Détection des anticorps antirabiques IgG et IgM à l’aide du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage

Résumé

L’objectif de ce manuscrit est d’examiner l’utilisation du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage pour la détection des anticorps IgG et IgM spécifiques de la rage.

Résumé

Le test d’anticorps fluorescents indirects (IFA) contre la rage a été mis au point pour détecter divers isotypes d’anticorps spécifiques de la rage dans les sérums ou le liquide céphalo-rachidien. Ce test fournit des résultats rapides et peut être utilisé pour détecter les anticorps antirabiques dans plusieurs scénarios différents. Le test IFA de la rage est particulièrement utile pour la détection rapide et précoce des anticorps afin d’évaluer la réponse immunitaire chez un patient qui a développé la rage. Bien que d’autres méthodes de diagnostic de la rage ante-mortem aient la priorité, ce test peut être utilisé pour démontrer l’exposition récente au virus de la rage par la détection d’anticorps. Le test IFA ne fournit pas de titre d’anticorps neutralisant le virus (VNA), mais la réponse à la prophylaxie pré-exposition (PrEP) peut être évaluée par la présence d’anticorps positifs ou négatifs. Ce test peut être utilisé dans diverses situations et peut fournir des résultats pour un certain nombre de cibles différentes. Dans cette étude, nous avons utilisé plusieurs échantillons de sérum appariés provenant de personnes ayant reçu la PrEP et démontré leur présence d’anticorps antirabiques au fil du temps à l’aide du test IFA.

Introduction

Le test d’anticorps fluorescents indirects (IFA) antirabiques est utilisé pour détecter divers isotypes d’anticorps spécifiques de la rage dans le sérum ou le liquide céphalo-rachidien. Il fait partie d’un arsenal de tests disponibles pour le suivi d’un patient ante mortem de la rage. Il est particulièrement utile pour la détection précoce des anticorps afin d’évaluer la réponse immunitaire d’un patient à l’infection par la rage. Lorsqu’il est utilisé en conjonction avec d’autres tests, les antécédents et le statut vaccinal du patient, le test IFA peut aider à déterminer l’exposition au virus de la rage ou à un vaccin¹. Comme le test IFA mesure les IgM et/ou les IgG, les valeurs de l’anticorps spécifique peuvent indiquer un laps de temps approximatif à partir de l’exposition à l’antigène¹. Ce test peut être utile dans les applications répertoriées ou d’autres qui n’ont pas encore été explorées.

Il existe plusieurs tests sérologiques de la rage. Le test rapide d’inhibition de la focalisation fluorescente (RFFIT), le test de neutralisation du virus par anticorps fluorescents (FAVN) ou des modifications de ceux-ci sont les principales méthodes de mesure des anticorps neutralisants du virus de la rage (ARNV)¹. Cependant, ces tests ne différencient pas les anticorps IgM et IgG. Lorsque la différenciation de l’isotype de l’anticorps est importante dans la surveillance de la réponse immunitaire de la rage, les tests IFA de la rage et ELISA (test immuno-enzymatique lié à la rage) sont utilisés, mais ils ne mesurent pas les ARNV. Bien que les tests IFA et ELISA puissent être utilisés pour déterminer la présence d’anticorps spécifiques de la rage dans un échantillon, il existe certaines différences dans la façon dont ils sont exécutés. Le test IFA utilise un virus vivant cultivé en cellule comme substrat antigène, alors qu’un test ELISA typique pour la détection de la rage utilise une ou plusieurs des protéines virales. Dans un laboratoire où le virus de la rage peut être cultivé, le test IFA peut être plus facile à effectuer au lieu d’acheter ou de cultiver des protéines virales individuelles pour le test ELISA. L’objectif du test et l’information recueillie à partir des résultats de tout test sérologique de la rage doivent être pris en compte pour déterminer lequel choisir².

Les IgM sont les premières à réagir, augmentant jusqu’à ce que l’on observe un changement de classe vers le 28e jour, moment où les IgG deviennent l’anticorps circulant prédominant³. Par conséquent, on ne s’attendrait à ce que les IgM durent une période limitée après l’exposition au virus de la rage ou la vaccination. L’analyse du sérum et du liquide céphalorachidien (LCR) peut indiquer si l’exposition a été faite par la vaccination, dans laquelle les anticorps ne seraient visibles que dans les sérums, ou par une infection virale, qui montrerait potentiellement des anticorps dans le LCR¹.

Il a été établi que les anticorps antirabiques persistent pendant plusieurs années après la prophylaxie pré-exposition (PrEP)⁴. Le test IFA peut être un outil utile pour le démontrer à différents moments après la vaccination ou l’exposition.

Protocole

Le protocole suivant a été approuvé pour l’utilisation éthique d’échantillons humains par le Wadsworth Center du Département de la santé de l’État de New York pour le développement de tests, numéro d’approbation du protocole #03-019.

1. Sécurité

1. Enfilez un équipement de protection individuelle (EPI), au moins une protection oculaire (lunettes ou écran facial), un masque chirurgical et des gants sans latex.
2. S’assurer que le personnel est vacciné contre la rage et qu’un titre de ≥0,5 UI/mL a été démontré au cours des 6 derniers mois.

2. Préparation des lames antigéniques

REMARQUE : Effectuer toutes les manipulations de virus, de LCR et de sérum dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) en utilisant les précautions universelles.

1. Préparer 20 mL de neuroblastome de souris ou de cellules BHK-21 à une concentration de 3,0 x 10⁵ cellules/mL dans le milieu essentiel minimum d’Eagle complété par 10 % de sérum de veau fœtal (EGM) et garder au froid jusqu’à utilisation.
2. Préparer le virus CVS-11 en le diluant dans de l’EGM jusqu’à une dilution de travail de 1,0 x 10^6,5 50 % de dose infectieuse de culture tissulaire (TCID₅₀) par millilitre et garder au froid jusqu’au moment de l’utiliser.
   NOTE : Le TCID₅₀ est déterminé par la méthode de Reed et Muench publiée précédemment⁵.
3. Nettoyez une chambre de lame humide et des lames de microscope à puits enduites de polytétrafluoroéthylène (PTFE) avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre dans le BSC.
4. Ajouter de l’eau distillée (dH₂O) aux bandes de papier absorbant dans la chambre de la lame pour s’assurer que l’humidité reste constante tout au long de la procédure.
5. À l’aide d’un crayon, étiquetez chaque lame à utiliser avec le numéro de lot, la date, le type de cellule et toute autre information d’identification requise pour l’entreposage, et placez-la dans la chambre de la lame.
   REMARQUE : La plupart des marqueurs, stylos ou étiquettes ne résisteront pas à la future étape de fixation de l’acétone (étape 2.9).
6. Appliquer 50 μL de dilution virale sur chaque puits sur les lames de microscope à l’aide d’une pipette répétitive. Ensuite, appliquez 50 μL de dilution cellulaire sur chaque puits, en prenant soin de ne pas contaminer l’embout de la pipette avec le virus déjà présent sur le puits.
7. Fermez la chambre de la glissière d’humidité et placez-la dans l’incubateur humide à 34-36 °C. Évaluer l’infectiosité cellulaire après 24 h.
   REMARQUE : Effectuez les étapes 2.8 à 2.12 sur une seule diapositive.
8. Retirez la lame de la chambre d’humidité et aspirez soigneusement le surnageant. Lavez la lame dans un bocal Coplin rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 2 minutes, puis laissez la lame sécher à l’air libre.
9. Placez la lame dans le bocal Coplin et fixez-la dans de l’acétone froide pendant au moins 1 h dans un congélateur à -20 °C homologué pour les matériaux inflammables. Effectuez toutes les procédures de versement d’acétone et de séchage à l’air dans une hotte.
10. Laissez l’acétone s’évaporer et faites-la glisser pour sécher. Appliquer un conjugué antirabique à fluorescence directe (DFA) préparé selon les instructions du fabricant sur les puits de la lame et incuber pendant 30 min dans un incubateur humide à 34-36 °C.
11. Lavez la lame dans des pots Coplin de PBS deux fois pendant 2 minutes chacun. Séchez la glissière à l’air libre.
12. Montez une lamelle avec 0,05 M de Tris, 0,15 M de NaCl (pH 9,0) et 20 % de glycérol de montage, et lisez la lame à l’aide d’un microscope fluorescent à un grossissement de 200x pour évaluer l’infectivité. Si les cellules ne sont pas infectées à environ 50 %, répétez les étapes 2.7 à 2.12 le lendemain jusqu’à ce que l’infectiosité souhaitée soit atteinte.
    REMARQUE : L’infectivité cellulaire est estimée en fonction de l’évaluation visuelle du rapport entre les cellules négatives et les cellules positives pour la rage sur le puits de lames. Les cellules négatives apparaissent de couleur rouge, tandis que les cellules positives présentent une coloration fluorescente verte.
13. Retirez les lames restantes de l’incubateur et de la chambre d’humidité. Aspirez soigneusement le surnageant de chaque puits, puis placez les lames dans un ou plusieurs bocaux Coplin avec PBS pendant 1 à 2 minutes. Faites sécher les lames à l’air libre pendant environ 30 minutes. Conservez les lames à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.

3. Préparation de l’échantillon

1. Préparer les dilutions d’échantillons de sérum ou de LCR du patient pour les tests. Préparez le conjugué nécessaire pour obtenir une concentration de travail appropriée dilué dans du PBS avec 0,05 % de bleu Evans.
   REMARQUE : Conservez le conjugué dans l’obscurité pour maintenir l’intégrité du fluorophore avant l’application

4. Procédure de l’IFA

1. Retirez le nombre nécessaire de lames d’antigène préparées nécessaires pour chaque test et laissez les lames décongeler et sécher complètement.
2. Placez les lames dans un ou plusieurs bocaux Coplin et fixez-les dans de l’acétone froide pendant 2 h à une nuit dans un congélateur à -20 °C approuvé pour les matériaux inflammables. Retirez les lames de l’acétone et laissez-les sécher à l’air libre.
3. Placez les lames dans une boîte de chambre d’humidité à l’intérieur du BSC avec des bandes absorbantes imbibées_{de 2 O}pour maintenir l’humidité. Appliquer 50 μL de chaque dilution d’échantillon, échantillon témoin ou PBS dans le puits prédéterminé.
   REMARQUE : Chaque lame doit contenir un nombre approprié de puits d’échantillon de patient, de témoins positifs, de témoins négatifs et de puits de contrôle de cellules PBS.
4. Placez la chambre coulissante fermée dans un incubateur humide à 37 °C, 5 % de CO₂ . Incubez les lames pendant 30 minutes, puis retirez la chambre de la lame d’humidité de l’incubateur et placez-la dans un BSC.
5. À l’aide d’un embout d’aspirateur, aspirez soigneusement le surnageant de chaque puits, en veillant à ne pas perturber la monocouche cellulaire. À l’aide d’une pipette compte-gouttes stérile, appliquez une goutte de PBS sur chaque puits.
6. Répétez l’aspiration soigneuse, puis placez chaque lame dans un bocal Coplin rempli de PBS et lavez-la deux fois pendant un total de 15 minutes.
7. Replacez les lames dans la boîte de la chambre d’humidité et appliquez 50 μL de conjugué d’anticorps anti-humains approprié dans chaque puits. Répétez les étapes 4.4 à 4.6.
8. Laissez les lames sécher à l’air libre, montez une lamelle avec du support de montage et lisez les lames au microscope fluorescent.

5. Analyse des lames

1. Classer les échantillons en fonction du profil de coloration et de l’intensité de fluorescence par rapport aux échantillons témoins positifs avec un titre élevé d’anticorps antirabiques confirmé.
2. Classez les échantillons sur une échelle de négatif, 1+, 2+, 3+ et 4+, avec un résultat négatif ne montrant aucune coloration fluorescente et 4+ représentant une fluorescence de couleur pomme vert vif avec un motif de coloration similaire à celui des échantillons témoins positifs¹.
   REMARQUE : La couleur vert pomme ne s’applique qu’aux anticorps marqués FITC ; La couleur varie en fonction de la sélection du fluorophore.
3. Attribuez aux échantillons une valeur finale représentée par le facteur de dilution auquel l’échantillon affiche une teneur de 1 à 2+. Testez les échantillons à un facteur de dilution plus élevé si le point final n’est pas atteint lors de l’essai initial.

Résultats

Tous les échantillons de sérum ont été prélevés sur les patients à peu près au même moment après la PrEP. Les échantillons ont été testés sur cinq patients différents aux moments suivants : 2 semaines après l’inoculation finale du vaccin antirabique, 6 mois après la série de vaccins antirabiques et 18 mois après la série de vaccins antirabiques. Chaque échantillon de sérum a été dilué en série et classé en fonction de la présence d’IgM et d’IgG, comme décrit dans les étapes 5.2 et 5.3 ...

Discussion

Le test IFA tire parti d’un complexe antigène-anticorps, ce qui permet à un site de marquage de visualiser les anticorps spécifiques de la rage. Les cellules de neuroblastome ou BHK sont ensemencées sur des lames de microscope à plusieurs puits recouvertes de PTFE et inoculées avec la souche de laboratoire CVS-11 du virus de la rage. Une fois que la monocouche est confluente et que les cellules atteignent l’infectivité souhaitée d’environ 50 %, les lames sont stockées jusqu’à ce qu’elles soient prête...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM