Detección de anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia

Resumen

El objetivo de este manuscrito es examinar el uso de la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia para la detección de anticuerpos IgG e IgM específicos contra la rabia.

Resumen

La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) contra la rabia se desarrolló para detectar varios isotipos de anticuerpos específicos contra la rabia en sueros o líquido cefalorraquídeo. Esta prueba proporciona resultados rápidos y se puede utilizar para detectar anticuerpos contra la rabia en varios escenarios diferentes. La prueba de rabia IFA es especialmente útil para la detección rápida y temprana de anticuerpos para evaluar la respuesta inmune en un paciente que ha desarrollado rabia. Aunque otros métodos para el diagnóstico de la rabia antemortem tienen prioridad, esta prueba se puede utilizar para demostrar la exposición reciente al virus de la rabia a través de la detección de anticuerpos. La prueba IFA no proporciona un título de anticuerpos neutralizantes del virus (VNA), pero la respuesta de profilaxis previa a la exposición (PrEP) puede evaluarse a través de la presencia positiva o negativa de anticuerpos. Esta prueba se puede utilizar en diversas situaciones y puede proporcionar resultados para varios objetivos diferentes. En este estudio, utilizamos varias muestras de suero pareadas de individuos que recibieron PrEP y demostramos su presencia de anticuerpos contra la rabia a lo largo del tiempo utilizando la prueba IFA.

Introducción

La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) contra la rabia se utiliza para detectar varios isotipos de anticuerpos específicos contra la rabia en sueros o líquido cefalorraquídeo. Forma parte de un arsenal de pruebas disponibles para el seguimiento de un paciente con rabia antemortem. Es especialmente útil para la detección temprana de anticuerpos para evaluar la respuesta inmunitaria de un paciente a la infección por rabia. Cuando se utiliza junto con otras pruebas, la historia clínica y el estado de vacunación del paciente, la prueba IFA puede ayudar a determinar la exposición al virus de la rabia o a una vacuna¹. Como la prueba IFA mide IgM y/o IgG, los valores del anticuerpo específico pueden indicar un período de tiempo aproximado desde la exposición al antígeno¹. Esta prueba puede ser útil en las aplicaciones enumeradas u otras aún no exploradas.

Existen varios ensayos serológicos contra la rabia. La prueba rápida de inhibición del foco fluorescente (RFFIT), la prueba de neutralización del virus de anticuerpos fluorescentes (FAVN) o las modificaciones de estas son los principales métodos para medir los anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia (RVNA)¹. Sin embargo, estas pruebas no diferencian los anticuerpos IgM e IgG. Cuando la diferenciación del isotipo de los anticuerpos es importante para monitorizar la respuesta inmunitaria de la rabia, se utilizan las pruebas de IFA antirrábica y de ensayo de inmunoabsorción enzimática de la rabia (ELISA), pero no miden los AVR. Aunque las pruebas IFA y ELISA se pueden utilizar para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra la rabia en una muestra, existen algunas diferencias en la forma en que se ejecutan. La prueba IFA utiliza un virus vivo cultivado en células como sustrato de antígeno, mientras que un ELISA típico para la detección de la rabia utiliza una o más de las proteínas virales. En un entorno de laboratorio donde se puede cultivar el virus de la rabia, la prueba de IFA se puede realizar más fácilmente en lugar de comprar o cultivar proteínas virales individuales para el ELISA. El propósito de la prueba y la información obtenida de los resultados de cualquier ensayo serológico de rabia deben tenerse en cuenta al determinar cuál elegir².

La IgM es la primera en responder, aumentando hasta que se observa el cambio de clase alrededor del día 28, momento en el que la IgG se convierte en el anticuerpo circulante predominante³. Por lo tanto, la IgM solo se esperaría durante un período de tiempo limitado después de la exposición al virus de la rabia o la vacunación. Las pruebas tanto en suero como en líquido cefalorraquídeo (LCR) pueden indicar si la exposición fue a través de la vacunación, en la que los anticuerpos se verían solo en los sueros, o de una infección viral, que potencialmente mostraría anticuerpos en el LCR¹.

Se ha establecido que los anticuerpos antirrábicos persisten durante varios años después de la profilaxis previa a la exposición (PrEP)⁴. La prueba IFA puede ser una herramienta útil para demostrar esto en diferentes momentos después de la vacunación o la exposición.

Protocolo

El siguiente protocolo ha sido aprobado para el uso ético de muestras humanas por el Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York para el desarrollo de ensayos, número de aprobación del protocolo #03-019.

1. Seguridad

1. Use equipo de protección personal (EPP), protección ocular mínima (anteojos o protector facial), una mascarilla quirúrgica y guantes que no sean de látex.
2. Asegúrese de que el personal esté vacunado contra la rabia y que se haya demostrado un título de ≥0.5 UI/ml en los últimos 6 meses.

2. Preparación del portaobjetos de antígeno

NOTA: Realice todas las manipulaciones de virus, LCR y suero en una cabina de bioseguridad (BSC) utilizando las precauciones universales.

1. Prepare 20 ml de neuroblastoma de ratón o células BHK-21 a una concentración de 3,0 x 10⁵ células/ml en los medios esenciales mínimos de Eagle suplementados con suero fetal bovino (EGM) al 10 % y manténgalos fríos hasta su uso.
2. Prepare el virus CVS-11 diluyéndolo en EGM hasta una dilución de trabajo de 1,0 x 10^6,5 50 % de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID₅₀) por mililitro y manténgalo frío hasta que esté listo para su uso.
   NOTA: El TCID₅₀ se determina mediante el método de Reed y Muench publicado anteriormente⁵.
3. Limpie una cámara de portaobjetos de humedad y portaobjetos de pocillo recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE) con etanol al 70% y deje secar al aire en el BSC.
4. Agregue agua destilada (dH₂O) a las tiras de papel absorbente en la cámara del portaobjetos para asegurarse de que la humedad permanezca constante durante todo el procedimiento.
5. Con un lápiz, etiquete cada portaobjetos que se va a utilizar con el número de lote, la fecha, el tipo de celda y cualquier otra información de identificación necesaria para el almacenamiento, y colóquelos en la cámara de portaobjetos.
   NOTA: La mayoría de los marcadores, bolígrafos o etiquetas no resistirán el futuro paso de fijación de acetona (paso 2.9).
6. Aplique 50 μL de dilución de virus a cada pocillo de los portaobjetos del microscopio con una pipeta de repetición. A continuación, aplique 50 μL de dilución celular en cada pocillo, teniendo cuidado de no contaminar la punta de la pipeta con el virus que ya está en el pocillo.
7. Cierre la cámara del portaobjetos de humedad y colóquela en la incubadora húmeda a 34-36 °C. Evaluar la infectividad celular después de 24 h.
   NOTA: Realice los pasos 2.8-2.12 en una sola diapositiva.
8. Retire el portaobjetos de la cámara de humedad y aspire con cuidado el sobrenadante. Lave el portaobjetos en un frasco Coplin lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 minutos, luego deje que el portaobjetos se seque al aire.
9. Coloque el portaobjetos en el frasco Coplin y fije el portaobjetos en acetona fría durante un mínimo de 1 h en un congelador de -20 °C aprobado para materiales inflamables. Realice todos los procedimientos de vertido de acetona y secado al aire en una campana extractora.
10. Deja que la acetona se desprenda y se seque. Aplicar anticuerpo fluorescente directo (DFA) antirrábico preparado según las instrucciones del fabricante en los pocillos del portaobjetos e incubar durante 30 min en una incubadora húmeda a 34-36 °C.
11. Lave el portaobjetos en frascos Coplin de PBS dos veces durante 2 minutos cada uno. Seque el portaobjetos al aire.
12. Monte un cubreobjetos con 0,05 M de Tris, 0,15 M de NaCl (pH 9,0) y un 20% de glicerol, y lea el portaobjetos con un microscopio fluorescente con un aumento de 200x para evaluar la infectividad. Si las células no están infectadas aproximadamente en un 50%, repita los pasos 2.7-2.12 al día siguiente hasta alcanzar la infectividad deseada.
    NOTA: La infectividad celular se aproxima en función de la evaluación visual de la proporción de células negativas a células positivas para la rabia en el pocillo portaobjetos. Las células negativas aparecen de color rojo, mientras que las células positivas muestran una tinción fluorescente verde.
13. Retire los portaobjetos restantes de la incubadora y de la cámara de humedad. Aspire con cuidado el sobrenadante de cada pocillo, luego coloque los portaobjetos en un frasco Coplin con PBS durante 1-2 minutos. Seque los portaobjetos al aire durante aproximadamente 30 minutos. Guarde los portaobjetos a -80 °C hasta que estén listos para su uso.

3. Preparación de la muestra

1. Prepare las diluciones de muestras de suero o LCR del paciente para su análisis. Preparar el conjugado necesario para una concentración de trabajo adecuada diluido en PBS con azul de Evans al 0,05%.
   NOTA: Mantenga el conjugado en la oscuridad para mantener la integridad del fluoróforo antes de la aplicación

4. Procedimiento IFA

1. Retire el número necesario de portaobjetos de antígeno preparados necesarios para cada ensayo y deje que los portaobjetos se descongelen y se sequen por completo.
2. Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin y fije los portaobjetos en acetona fría durante 2 h a toda la noche en un congelador de -20 °C aprobado para materiales inflamables. Retire los portaobjetos de la acetona y déjelos secar al aire.
3. Coloque los portaobjetos en una caja de cámara de humedad dentro del BSC con tiras absorbentes empapadas en O_{dH 2}para mantener la humedad. Aplique 50 μL de cada dilución de muestra, muestra de control o PBS al pocillo predeterminado.
   NOTA: Cada portaobjetos debe contener un número adecuado de pocillos de muestra de pacientes, pocillos de control positivo, control negativo y pocillo de control de células PBS.
4. Coloque la cámara de portaobjetos de humedad cerrada en una incubadora húmeda a 37 °C y 5% de CO₂ . Incube los portaobjetos durante 30 minutos, luego retire la cámara de humedad de los portaobjetos de la incubadora y colóquela en un BSC.
5. Utilice una punta de aspiración para aspirar cuidadosamente el sobrenadante de cada pocillo, asegurándose de no perturbar la monocapa celular. Utilice una pipeta cuentagotas estéril para aplicar una gota de PBS en cada pocillo.
6. Repita la aspiración cuidadosa, luego coloque cada portaobjetos en un frasco Coplin lleno de PBS y lave dos veces durante un total de 15 minutos.
7. Vuelva a colocar los portaobjetos en la caja de la cámara de humedad y aplique 50 μL de conjugado de anticuerpos antihumanos apropiado a cada pocillo. Repita los pasos 4.4 a 4.6.
8. Deje que los portaobjetos se sequen al aire, monte un cubreobjetos con medios de montaje y lea los portaobjetos bajo un microscopio fluorescente.

5. Análisis de diapositivas

1. Clasificar las muestras en función del patrón de tinción y la intensidad de fluorescencia en comparación con las muestras de control positivas con un título de anticuerpos antirrábicos alto confirmado.
2. Califique las muestras en una escala de negativo, 1+, 2+, 3+ y 4+, con un resultado negativo que muestre que no hay tinción fluorescente y 4+ que representa una fluorescencia de color manzana verde brillante con un patrón de tinción similar al de las muestras de control positivas¹.
   NOTA: El color verde manzana se aplica solo a los anticuerpos marcados con FITC; El color varía dependiendo de la selección de fluoróforos.
3. Asigne a las muestras un valor de punto final representado por el factor de dilución en el que la muestra muestra un grado 1-2+. Pruebe las muestras con un factor de dilución más alto si no se alcanza el punto final en el ensayo inicial.

Resultados

Todas las muestras de suero se recolectaron de los pacientes aproximadamente en los mismos períodos de tiempo después de la PrEP. Las muestras se analizaron de cinco pacientes diferentes en los siguientes momentos: 2 semanas después de la inoculación final de la vacuna antirrábica, 6 meses después de la serie de vacunas antirrábicas y 18 meses después de la serie de vacunas antirrábicas. Cada muestra de suero se diluyó en series y se clasificó según la presencia de IgM e IgG, como se describe en los pasos 5.2...

Discusión

La prueba IFA aprovecha un complejo antígeno-anticuerpo, lo que permite un sitio de marcaje para visualizar los anticuerpos específicos de la rabia. El neuroblastoma o las células BHK se siembran en portaobjetos de microscopio recubiertos de PTFE de varios pocillos y se inoculan con la cepa de laboratorio CVS-11 del virus de la rabia. Una vez que la monocapa es confluente y las células alcanzan la infectividad deseada de aproximadamente el 50%, los portaobjetos se almacenan hasta que estén listos para su uso

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM