使用狂犬病间接荧光抗体检测狂犬病 IgG 和 IgM 抗体

摘要

本手稿的目的是研究使用狂犬病间接荧光抗体检测来检测狂犬病特异性 IgG 和 IgM 抗体。

摘要

狂犬病间接荧光抗体 （IFA） 检测旨在检测血清或脑脊液中的各种狂犬病特异性抗体同种型。该测试可快速获得结果，可用于在几种不同情况下检测狂犬病抗体。狂犬病IFA检测对于快速和早期检测抗体以评估狂犬病患者的免疫反应特别有用。尽管其他生前狂犬病诊断方法优先，但该检测可用于通过抗体检测证明近期狂犬病病毒暴露情况。IFA 检测不提供病毒中和抗体 （VNA） 滴度，但可以通过抗体阳性或阴性来评估暴露前预防 （PrEP） 反应。该测试可用于各种情况，并且可以为许多不同的目标提供结果。在这项研究中，我们使用了来自接受PrEP的个体的几个配对血清样本，并使用IFA测试证明了他们狂犬病抗体随时间推移的存在。

引言

狂犬病间接荧光抗体（IFA）检测用于检测血清或脑脊液中的各种狂犬病特异性抗体同种型。它是可用于监测生前狂犬病患者的一系列测试之一。它对于早期检测抗体以评估患者对狂犬病感染的免疫反应特别有用。当与其他检测、病史和患者的疫苗接种状态结合使用时，IFA 检测可以帮助确定狂犬病病毒或疫苗的暴露情况¹.当 IFA 检测测量 IgM 和/或 IgG 时，特异性抗体的值可以指示从暴露于抗原¹ 开始的大致时间范围。该测试在列出的应用程序或其他尚未探索的应用程序中可能有用。

有几种狂犬病血清学检测方法可用。快速荧光聚焦抑制试验 （RFFIT）、荧光抗体病毒中和 （FAVN） 试验或这些试验的改良是测量狂犬病病毒中和抗体 （RVNA） 的主要方法¹。然而，这些测试不能区分 IgM 和 IgG 抗体。当鉴别抗体同种型对监测狂犬病免疫应答很重要时，可使用狂犬病 IFA 和狂犬病酶联免疫吸附测定 （ELISA） 检测，但不检测 RVNA。尽管 IFA 和 ELISA 检测可用于确定样本中是否存在狂犬病特异性抗体，但它们的执行方式存在一些差异。IFA 检测使用细胞培养的活病毒作为其抗原底物，而用于狂犬病检测的典型 ELISA 使用一种或多种病毒蛋白。在可以培养狂犬病病毒的实验室环境中，IFA 检测可能更容易进行，而不是购买或培养用于 ELISA 的单个病毒蛋白。....

研究方案

以下方案已被纽约州卫生部沃兹沃思中心批准用于人体样本的道德使用，用于检测开发，方案批准号#03-019。

1. 安全

1. 穿戴个人防护装备 （PPE），至少戴上护目镜（眼镜或面罩）、外科口罩和非乳胶手套。
2. 确保医务人员接种狂犬病疫苗，并且在过去 6 个月内证明滴度为 ≥0.5 IU/mL。

2.抗原载玻片制备

注意：使用通用预防措施在生物安全柜 （BSC） 中执行所有病毒、脑脊液和血清操作。

1. 在补充有 10% 胎牛血清 （EGM） 的 Eagle 最低必需培养基中制备 20 mL 小鼠神经母细胞瘤或 BHK-21 细胞，浓度为 3.0 x 10⁵ 个细胞/mL，并保持低温直至使用。
2. 通过在EGM中稀释至每毫升1.0 x^{10 6.5} 50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）的工作稀释度来制备CVS-11病毒，并保持低温直至准备使用。
   注：TCID₅₀ 由先前发表的 Reed 和 Muench 方法确定⁵.
3. 用70%乙醇清洁湿度载玻片室和聚四氟乙烯（PTFE）....

讨论

IFA 检测利用抗原-抗体复合物，允许标记位点可视化狂犬病特异性抗体。将神经母细胞瘤或BHK细胞接种在多孔PTFE涂层的显微镜载玻片上，并接种狂犬病病毒实验室菌株CVS-11。一旦单层汇合并且细胞达到约50%的所需感染性，载玻片将被储存直至准备使用⁶。

将患者血清或脑脊液涂在感染的单层细胞上并孵育，以使任何狂犬病特异性抗体附着在病毒抗原

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM