التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة من خلال الكشف المتزامن عن بؤر γH2AX و 53BP1 في نوى الطور البيني للخلايا الليمفاوية الطرفية البشرية المعالجة بالبليوميسين.

Abstract

تعد فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) واحدة من أشد الآفات التي يمكن أن تحدث في نوى الخلية ، وإذا لم يتم إصلاحها ، فقد تؤدي إلى نتائج خطيرة ، بما في ذلك السرطان. لذلك ، يتم تزويد الخلية بآليات معقدة لإصلاح DSBs ، وتتضمن هذه المسارات هيستون H2AX في شكله المفسفر في Ser-139 (أي γH2AX) وبروتين ربط p53 1 (53BP1). نظرا لأن كلا البروتينين يمكن أن يشكلان بؤرا في مواقع DSBs ، فإن تحديد هذه العلامات يعتبر طريقة مناسبة لدراسة كل من DSBs وحركية إصلاحها. وفقا للعمليات الجزيئية التي تؤدي إلى تكوين بؤر γH2AX و 53BP1 ، قد يكون من المفيد أكثر التحقيق في توطينها المشترك بالقرب من DSBs من أجل إعداد نهج بديل يسمح بقياس DSBs عن طريق الكشف المتزامن عن علامتين لتلف الحمض النووي. وبالتالي ، يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الضرر الجينومي الناجم في الخلايا الليمفاوية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين من خلال وجود بؤر γH2AX و 53BP1 في تألق مناعي مزدوج. باستخدام هذه المنهجية ، حددنا أيضا التباين في عدد بؤر γH2AX و 53BP1 بمرور الوقت ، كمحاولة أولية لدراسة حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين.

Introduction

يحدث تلف الحمض النووي باستمرار بواسطة عوامل يمكن أن تكون داخلية المنشأ ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن التمثيل الغذائي التأكسدي الخلوي ، أو الخارجية ، سواء المواد الكيميائية أو الفيزيائية¹. من بين الآفات الأكثر ضررا ، تلعب فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) دورا أساسيا في المساهمة في عدم الاستقرار الجيني ، لأنها تسبب انحرافات الكروموسومات التي بدورها يمكن أن تبدأ عملية التسرطن. وبالتالي ، يتم تزويد الخلايا بآليات معقدة وفعالة لإصلاح DSBs².

عندما يحدث DSB ، تقوم الخلية بتشغيل استجابة تلف الحمض النووي (DDR) حيث ، جنبا إلى جنب مع مركب MRE11 / RAD50 / NBS1 ، يتم تجنيد كينازات ATM أو ATR لتنشيط البروتينات الأخرى التي تبطئ أو توقف دورة الخلية³. الهدف الأساسي لهذه الكينازات هو هيستون H2AX ، الذي يتم فسفرته على Ser-139 ضمن عدد قليل من القواعد الضخمة من DSBs (أي γH2AX) ، مما يسمح بتوظيف العديد من عوامل الإصلاح مثل ، من بين أمور أخرى ، BRCA1 و p53 بروتين الربط 1 (53BP1) ³. في وقت لاحق ، يتم تشغيل مسار واحد بين إعادة التركيب المتماثل (HR) ، أو الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، أو التلدين أحادي الشريط (SSA) لإصلاح DSBs ^4,5. لذلك ، تشارك 53BP1 في إملاء الاختيار بين HR أو NHEJ ، مما يعزز بشكل أساسي تنشيط NHEJ بدلا من HR⁶. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشكل كل من الشكل المفسفر لهستون H2AX و 53BP1 بؤرا في مواقع DSBs. مع استمرار هذه البؤر حتى يتم استعادة سلامة الشريط المزدوج ، يعتبر تقييم مظهر / اختفاء بؤر γH2AX أو 53BP1 خلال فترة زمنية طريقة مفيدة لتقييم حدوث وإصلاح DSBs في نظام الخلية ^6,7. ومع ذلك ، وفقا للعمليات الجزيئية الموصوفة أعلاه ، نظرا لأنه من المتوقع أن تتركز بؤر γH2AX و 53BP1 بالقرب من DSBs خلال DDR ^8,9 ، فقد يكون من المفيد الكشف بشكل متزامن عن وجود هذه العلامات في تألق مناعي مزدوج.

وبالتالي ، كان الهدف من هذه المخطوطة هو تقييم مدى ملاءمة القياس الكمي المتزامن لبؤر γH2AX و 53BP1 لتقييم الضرر الجيني الناجم في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين. باستخدام نفس المنهجية ، حاولنا أيضا تحديد حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين وفقا لإجراء تجريبي تم إعداده مسبقا¹⁰.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة بيزا ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة وموقعة من كل متبرع.

1. تشكيل بؤر γH2AX و 53BP1

1. تحضير العينات وعلاج الطفرات
   1. جمع عينات الدم الكامل عن طريق بزل الوريد من الأفراد البالغين الأصحاء في أنابيب جمع الدم (على سبيل المثال ، Vacutainer) التي تحتوي على الهيبارين الليثيوم كمضاد للتخثر.
   2. من أجل ضمان الحفاظ على عينة الدم بشكل صحيح ، ابدأ الإجراء في غضون 24 ساعة من أخذ العينات.
   3. أضف 300 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب يحتوي على 4.7 مل من الوسط الكامل (0.5٪ بنسلين-ستربتومايسين ، 0.75٪ فيتوهيماغلوتينين ، 10٪ FBS معطل سابقا ، 88.75٪ RPMI 1640).
   4. ثم أضف كبريتات بليوميسين إلى تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل.
      تنبيه: كبريتات بليوميسين هي مطفرة. تجنب ملامسة الجلد والاستنشاق. تحضير الحل وإضافة العينة تحت غطاء محرك السيارة.
   5. لكل عينة ، قم بإعداد عنصر تحكم سلبي (عدم وجود مطفر).
   6. ضع الأنبوب في ترموستات عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
2. تثبيت
   1. عينات الطرد المركزي عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. نضح طاف وإعادة تعليق بيليه مع دوامة.
   3. أضف 5 مل من محلول منخفض التوتر (2.87 جم من KCl المذاب في 500 مل من الماء منزوع الأيونات) و 400 ميكرولتر من محلول ما قبل التثبيت (5: 3 حمض الخليك: الميثانول) لإحداث انحلال الدم في خلايا الدم الحمراء.
   4. عينات الطرد المركزي عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل لإصلاح الخلايا.
   6. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الخلايا في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. إعداد الشرائح
   1. عينات الطرد المركزي عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من الميثانول 3: 1: محلول حمض الخليك. كرر هذه الخطوات مرة أخرى.
   3. في النهاية ، قم بطرد المحلول مرة أخرى عند 540 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. نضح المادة الطافية مرة أخرى مع ترك محلول كاف (0.5 مل) لإعادة تعليق الحبيبات ، والماصة بقوة ، وإسقاط حبيبات الخلية المعاد تعليقها على الشرائح ، وتجفيفها في الهواء. قم بتخزين الشرائح على حرارة 4 درجات مئوية.
4. التألق المناعي
   ملاحظة: التألق المناعي هو طريقة مناعية لتحديد أهداف خلية معينة باستخدام جسم مضاد أولي يربط الهدف نفسه وجسم مضاد ثانوي فلوري يربط الأساسي الذي يسمح بتحديد موقع الهدف¹¹. في هذه الحالة ، يتم استخدام فأر أحادي النسيلة مضاد 53BP1 (1:50) وأرنب متعدد النسيلة مضاد γH2AX (1:50) كأجسام مضادة أولية ، بينما يتم استخدام AlexaFluor568 المضاد للفأر (1: 400) و DyLight488 المضاد للأرانب (1: 200) كأجسام مضادة ثانوية ، على التوالي.
   1. اغسل الشرائح مرتين في 50 مل من 1x PBS لمدة 5 دقائق في جرة couplin (16 شريحة متتالية).
   2. ثم احتفظ بها لمدة 30 دقيقة في محلول مانع (10 مل من FBS ، 10 مل من 10x PBS ، 80 مل من الماء منزوع الأيونات ، 300 ميكرولتر من Triton-X).
   3. أضف إلى كل شريحة 10 ميكرولتر من كل من المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الأولية الذائبة في محلول الحظر. غطي الشرائح بشريط البارافين واحتضانها على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
   4. بعد الحضانة ، قم بإجراء ثلاث غسلات في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
   5. أضف إلى كل شريحة 10 ميكرولتر من كل من المحلولين اللذين يحتويان على الأجسام المضادة الثانوية الذائبة في محلول الحظر. تغطية الشرائح مع شريط البارافين واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
   6. أداء ثلاث غسلات في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
   7. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول مضاد للتلاشي مع DAPI على أغطية الغطاء قبل التجميع لمقاومة النوى.
      ملاحظة: من أجل تقييم حركية البؤر ، فإن الإجراء هو نفسه كما هو موضح من 1.1 إلى 1.4 ، مع ملاحظة أن حصاد الخلايا والتألق المناعي المزدوج يتم إجراؤه عند 0 ساعة ، بعد 2 ساعة بعد العلاج بالبليوميسين وبعد ذلك ، بعد إزالة المطفرات ، في 4 ساعات و 6 ساعات و 24 ساعة بعد العلاج.

2. التحليل من خلال المجهر الفلوري

ملاحظة: يشير "المجهر الفلوري" إلى أي مجهر يستخدم التألق لتوليد صورة. تضيء العينة بضوء ذي طول موجي محدد (أو أطوال موجية) تمتصه الفلوروفورات ، مما يجعلها تنبعث منها ضوء بأطوال موجية أطول¹². يمتص AlexaFluor568 و DyLight 488 الضوء من حوالي 568 و 488 نانومتر وينبعث منهما ضوء 603 و 520 نانومتر على التوالي. وبالتالي ، فهي مرئية على شكل مضان أحمر أو أخضر باستخدام مرشح TRITC أو FITC ، على التوالي.

1. سجل وجود بؤر في كل شريحة تحت هدف غمر 100x (الشكل 1).
2. سجل 200 نواة لكل شريحة واحسب عدد بؤر γH2AX / 53BP1 في كل نواة.
3. النتائج السريعة من حيث متوسط عدد البؤر لكل إجمالي النوى المسجلة. وتشمل هذه النوى كلا من γH2AX / 53BP1 الموجبة (تظهر إشارة مضان واحدة على الأقل) والنواة السلبية (لا تظهر أي إشارة مضان).

النتائج

تسمح لنا البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة تحليل المجهر الفلوري للخلايا الليمفاوية المحيطية بتقييم ثلاثة جوانب رئيسية: فعالية علاج بليوميسين في زيادة عدد بؤر γH2AX و 53BP1 (وبالتالي DSBs) بسبب تأثيره المطفر ، وإلى أي مدى تركزت كل من البؤر في موقع DSBs ، والمسار الزمني لبؤر γH2AX و 53BP1 لتحديد حركية ...

Discussion

يعد تحليل التألق المناعي لبؤر γH2AX و 53BP1 طريقة مناسبة لتقييم الضرر الجيني في نوى الطور البيني لنظام الخلية. يحتوي هذا الإجراء على العديد من النقاط الحرجة التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب ، بشكل أساسي ، العوامل المستخدمة في التثبيت والنفاذية ، ونوع الأجسام المضادة وعوامل تخفيفها ، وتركيز...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization