Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos

Resumen

Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.

Resumen

Las roturas de doble cadena (DSB) son una de las lesiones más graves que pueden ocurrir en los núcleos celulares y, si no se reparan, pueden conducir a resultados graves, incluido el cáncer. Por lo tanto, la célula está provista de mecanismos complejos para reparar DSB, y estas vías involucran histona H2AX en su forma fosforilada en Ser-139 (es decir, γH2AX) y la proteína de unión a p53 1 (53BP1). Como ambas proteínas pueden formar focos en los sitios de los DSB, la identificación de estos marcadores se considera un método adecuado para estudiar tanto los DSB como su cinética de reparación. De acuerdo con los procesos moleculares que conducen a la formación de focos γH2AX y 53BP1, podría ser más útil investigar su colocalización cerca de los DSB para establecer un enfoque alternativo que permita cuantificar los DSB mediante la detección simultánea de dos marcadores de daño en el ADN. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar el daño genómico inducido en linfocitos humanos por el agente radiomimético bleomicina a través de la presencia de focos γH2AX y 53BP1 en una inmunofluorescencia dual. Usando esta metodología, también delineamos la variación en el número de focos γH2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo, como un intento preliminar de estudiar la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina.

Introducción

El daño del ADN es inducido continuamente por agentes que pueden ser endógenos, como ROS generados por el metabolismo oxidativo celular, o exógenos, tanto químicos como físicos¹. Entre las lesiones más dañinas, las roturas de doble cadena (DSB) juegan un papel fundamental para contribuir a la inestabilidad genómica, ya que causan aberraciones cromosómicas que a su vez pueden iniciar el proceso de carcinogénesis. Por lo tanto, las células están provistas de mecanismos complejos y eficientes de reparación de DSB².

Cuando se produce un DSB, la célula desencadena la respuesta al daño del ADN (DDR) donde, junto con el complejo MRE11/RAD50/NBS1, se reclutan quinasas ATM o ATR para activar otras proteínas que ralentizan o detienen el ciclo celular³. Una diana esencial de estas quinasas es la histona H2AX, que se fosforila en Ser-139 dentro de unas pocas megabases de los DSB (a saber, γH2AX), lo que permite el reclutamiento de varios factores de reparación como, entre otros, BRCA1 y la proteína de unión a p53 1 (53BP1)³. Más tarde, se activa una vía entre la recombinación homóloga (HR), la unión final no homóloga (NHEJ) o el recocido de una sola hebra (SSA) para reparar los DSB ^4,5. Por lo tanto, 53BP1 está involucrado en dictar la elección entre HR o NHEJ, promoviendo principalmente la activación de NHEJ en lugar de HR⁶. Además, tanto la forma fosforilada de la histona H2AX como la 53BP1 pueden formar focos en los sitios de los DSB. Como estos focos persisten hasta que se restaura la integridad de la doble cadena, la evaluación de la aparición/desaparición de focos γH2AX o 53BP1 dentro de un intervalo de tiempo se considera un método útil para evaluar la ocurrencia y reparación de DSB en un sistema celular ^6,7. Sin embargo, de acuerdo con los procesos moleculares descritos anteriormente, dado que se espera que los focos γH2AX y 53BP1 se colocalicen cerca de los DSB durante la DDR^8,9, puede ser útil detectar simultáneamente la presencia de estos marcadores en una inmunofluorescencia dual.

Por lo tanto, el objetivo de este manuscrito fue evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de los focos γH2AX y 53BP1 para evaluar el daño genómico inducido en linfocitos periféricos humanos por el agente radiomimético bleomicina. Utilizando la misma metodología, también intentamos delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina de acuerdo con un procedimiento experimental previamente establecido¹⁰.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Pisa, y se obtuvo el consentimiento informado y firmado de cada donante.

1. Formación de focos γH2AX y 53BP1

1. Preparación de muestras y tratamiento mutagénico
   1. Recolectar muestras de sangre total por venopunción de individuos adultos sanos en tubos de recolección de sangre (por ejemplo, Vacutainer) que contienen heparina de litio como anticoagulante.
   2. Para garantizar la conservación adecuada de la muestra de sangre, comience el procedimiento dentro de las 24 h posteriores al muestreo.
   3. Añadir 300 μL de la muestra a un tubo que contenga 4,7 mL de medio completo (0,5% penicilina-estreptomicina, 0,75% fitohemaglutinina, 10% FBS previamente inactivado, 88,75% RPMI 1640).
   4. Luego agregue sulfato de bleomicina a una concentración final de 5 μg / ml.
      PRECAUCIÓN: El sulfato de bleomicina es un mutágeno. Evite el contacto con la piel y la inhalación. Prepare la solución y agregue la muestra debajo de una campana.
   5. Para cada muestra, establecer un control negativo (ausencia de mutágeno).
   6. Colocar el tubo en un termostato a 37 °C durante 2 h.
2. Fijación
   1. Centrifugar muestras a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet con vórtice.
   3. Añadir 5 ml de solución hipotónica (2,87 g de KCl disuelto en 500 ml de agua desionizada) y 400 μL de solución prefijadora (ácido acético 5:3: metanol) para causar hemólisis de los glóbulos rojos.
   4. Centrifugar muestras a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 ml de metanol a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para fijar las células.
   6. Alternativamente, almacenar las celdas a -20 °C hasta su uso.
3. Preparación de diapositivas
   1. Centrifugar muestras a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 mL de una solución de ácido acético 3:1 metanol. Repita estos pasos una vez más.
   3. Al final, centrifugar la solución de nuevo a 540 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Aspirar de nuevo el sobrenadante dejando suficiente solución (0,5 ml) para resuspender el pellet, pipetear vigorosamente, dejar caer el pellet de células resuspendidas sobre los portaobjetos y secar al aire. Conservar los portaobjetos a 4 °C.
4. Inmunofluorescencia
   NOTA: La inmunofluorescencia es un método inmunológico para identificar dianas celulares específicas utilizando un anticuerpo primario que se une al objetivo en sí y un anticuerpo secundario fluorescente que se une al primario que permite localizar el objetivo¹¹. En este caso, un anti-53BP1 monoclonal de ratón (1:50) y un anti-γH2AX policlonal de conejo (1:50) se utilizan como anticuerpos primarios, mientras que AlexaFluor568 anti-ratón (1:400) y DyLight488 anti-conejo (1:200) se utilizan como anticuerpos secundarios, respectivamente.
   1. Lave los portaobjetos dos veces en 50 ml de 1x PBS durante 5 minutos en un frasco de cuplin (16 portaobjetos seguidos).
   2. Luego manténgalos durante 30 minutos en solución de bloqueo (10 ml de FBS, 10 ml de 10x PBS, 80 ml de agua desionizada, 300 μL de Triton-X).
   3. Añadir a cada portaobjetos 10 μL de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos primarios disueltos en la solución bloqueante. Cubrir los portaobjetos con cinta adhesiva de parafina e incubar a 4 °C durante la noche.
   4. Después de la incubación, realice tres lavados en 1x PBS durante 5 min.
   5. Añadir a cada portaobjetos 10 μL de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos secundarios disueltos en la solución de bloqueo. Cubrir los portaobjetos con cinta adhesiva de parafina e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
   6. Realice tres lavados en 1x PBS durante 5 min.
   7. Añadir 2,5 μL de solución antidecoloración con DAPI en los cubreobjetos antes del montaje para contrarrestar los núcleos.
      NOTA: Para evaluar la cinética de los focos, el procedimiento es el mismo que el descrito de 1,1 a 1,4, teniendo en cuenta que la recolección celular y la inmunofluorescencia dual se realizan a las 0 h, después de 2 h después del tratamiento con bleomicina y luego, después de haber eliminado el mutágeno, a las 4 h, 6 h y 24 h después del tratamiento.

2. Análisis a través de un microscopio de fluorescencia

NOTA: "Microscopio de fluorescencia" se refiere a cualquier microscopio que utiliza fluorescencia para generar una imagen. La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica (o longitudes de onda) que es absorbida por los fluoróforos, haciendo que emitan luz de longitudes de onda más largas¹². AlexaFluor568 y DyLight 488 absorben luz de aproximadamente 568 y 488 nm y emiten luz de 603 y 520 nm, respectivamente. Por lo tanto, son visibles como fluorescencia roja o verde utilizando un filtro TRITC o FIFC, respectivamente.

1. Puntúe la presencia de focos en cada diapositiva bajo un objetivo de inmersión de 100x (Figura 1).
2. Puntúe 200 núcleos por portaobjetos y cuente el número de focos γH2AX/53BP1 en cada núcleo.
3. Exprese los resultados en términos del número promedio de focos por núcleo total puntuado. Estos incluyen núcleos γH2AX/53BP1 positivos (que muestran al menos una señal de fluorescencia) y negativos (que no muestran ninguna señal de fluorescencia).

Resultados

Los datos obtenidos por el análisis con microscopio de fluorescencia de linfocitos periféricos nos permiten evaluar tres aspectos principales: la efectividad del tratamiento con bleomicina para aumentar el número de focos de γH2AX y 53BP1 (y por lo tanto de DSB) debido a su efecto mutagénico, en qué medida ambos focos colocalizados en el sitio de los DSB, y el curso temporal de los focos de γH2AX y 53BP1 para delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina. Como era de esperar, se observó...

Discusión

El análisis de inmunofluorescencia de los focos γH2AX y 53BP1 es un método adecuado para evaluar el daño genómico en los núcleos de interfase de un sistema celular. Este procedimiento tiene varios puntos críticos que pueden afectar el resultado de los experimentos, principalmente, los agentes utilizados en la fijación y permeabilización, el tipo de anticuerpos y sus factores de dilución, y la concentración del mutágeno.

El mantenimiento de la integridad de las proteínas es fundame...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization