Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani

Riepilogo

Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.

Abstract

Le rotture del doppio filamento (DSB) sono una delle lesioni più gravi che possono verificarsi nei nuclei cellulari e, se non riparate, possono portare a esiti gravi, incluso il cancro. La cellula è quindi dotata di meccanismi complessi per riparare le DSB, e queste vie coinvolgono l'istone H2AX nella sua forma fosforilata a Ser-139 (cioè γH2AX) e p53 binding protein 1 (53BP1). Poiché entrambe le proteine possono formare focolai nei siti delle DSB, l'identificazione di questi marcatori è considerata un metodo adatto per studiare sia le DSB che la loro cinetica di riparazione. Secondo i processi molecolari che portano alla formazione di focolai di γH2AX e 53BP1, potrebbe essere più utile indagare la loro co-localizzazione vicino alle DSB al fine di impostare un approccio alternativo che consenta di quantificare le DSB mediante la rilevazione simultanea di due marcatori di danno al DNA. Pertanto, questo protocollo mira a valutare il danno genomico indotto nei linfociti umani dall'agente radiomimetico bleomicina attraverso la presenza di focolai di γH2AX e 53BP1 in una doppia immunofluorescenza. Utilizzando questa metodologia, abbiamo anche delineato la variazione del numero di focolai di γH2AX e 53BP1 nel tempo, come tentativo preliminare di studiare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina.

Introduzione

Il danno al DNA è continuamente indotto da agenti che possono essere endogeni, come i ROS generati dal metabolismo ossidativo cellulare, o esogeni, sia chimici che fisici¹. Tra le lesioni più dannose, le rotture a doppio filamento (DSB) svolgono un ruolo fondamentale nel contribuire all'instabilità genomica, poiché causano aberrazioni cromosomiche che a loro volta possono avviare il processo di carcinogenesi. Pertanto, le cellule sono dotate di meccanismi complessi ed efficienti di riparazione dei DSB².

Quando si verifica un DSB, la cellula innesca la risposta al danno del DNA (DDR) dove, insieme al complesso MRE11 / RAD50 / NBS1, vengono reclutate chinasi ATM o ATR per attivare altre proteine che rallentano o fermano il ciclo cellulare³. Un bersaglio essenziale di queste chinasi è l'istone H2AX, che è fosforilato su Ser-139 entro poche megabasi dai DSB (vale a dire γH2AX), consentendo così il reclutamento di diversi fattori di riparazione come, tra gli altri, BRCA1 e p53 binding protein 1 (53BP1)³. Successivamente, viene attivato un percorso tra ricombinazione omologa (HR), giunzione finale non omologa (NHEJ) o ricottura a singolo filamento (SSA) per riparare i DSB ^4,5. Pertanto, 53BP1 è coinvolto nel dettare la scelta tra HR o NHEJ, promuovendo principalmente l'attivazione di NHEJ piuttosto che HR⁶. Inoltre, sia la forma fosforilata dell'istone H2AX che il 53BP1 possono formare focolai nei siti delle DSB. Poiché questi focolai persistono fino a quando non viene ripristinata l'integrità del doppio filamento, valutare l'aspetto/scomparsa dei focolai di γH2AX o 53BP1 entro un intervallo di tempo è considerato un metodo utile per valutare l'insorgenza e la riparazione di DSB in un sistema cellulare ^6,7. Tuttavia, secondo i processi molecolari sopra descritti, poiché ci si aspetta che γH2AX e 53BP1 si co-localizzino vicino ai DSB durante DDR^8,9, può essere utile rilevare contemporaneamente la presenza di questi marcatori in una doppia immunofluorescenza.

Pertanto, lo scopo di questo manoscritto era quello di valutare l'idoneità della quantificazione simultanea dei focolai di γH2AX e 53BP1 per valutare il danno genomico indotto nei linfociti periferici umani dall'agente radiomimetico bleomicina. Utilizzando la stessa metodologia, abbiamo anche tentato di delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina secondo una procedura sperimentale precedentemente impostata¹⁰.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università di Pisa e il consenso informato e firmato è stato ottenuto da ciascun donatore.

1. Formazione di focolai γH2AX e 53BP1

1. Preparazione dei campioni e trattamento mutageno
   1. Raccogliere campioni di sangue intero mediante venipuntura da individui adulti sani in provette di raccolta del sangue (ad esempio, Vacutainer) contenenti eparina di litio come anticoagulante.
   2. Al fine di garantire una corretta conservazione del campione di sangue, avviare la procedura entro 24 ore dal prelievo.
   3. Aggiungere 300 μL del campione in una provetta contenente 4,7 mL di terreno completo (0,5% penicillina-streptomicina, 0,75% fitoemoagglutinina, 10% FBS precedentemente inattivato, 88,75% RPMI 1640).
   4. Quindi aggiungere bleomicina solfato ad una concentrazione finale di 5 μg/ml.
      ATTENZIONE: La bleomicina solfato è un mutageno. Evitare il contatto con la pelle e l'inalazione. Preparare la soluzione e aggiungere il campione sotto un cappuccio.
   5. Per ogni campione, impostare un controllo negativo (assenza di mutageno).
   6. Posizionare il tubo in un termostato a 37 °C per 2 ore.
2. Fissazione
   1. Centrifugare i campioni a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con vortice.
   3. Aggiungere 5 ml di soluzione ipotonica (2,87 g di KCl sciolto in 500 ml di acqua deionizzata) e 400 μL di soluzione prefissativa (acido acetico 5:3: metanolo) per provocare l'emolisi dei globuli rossi.
   4. Centrifugare i campioni a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di metanolo a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per fissare le cellule.
   6. In alternativa, conservare le celle a -20 °C fino all'uso.
3. Preparazione diapositive
   1. Centrifugare i campioni a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di una soluzione di metanolo 3:1: acido acetico. Ripeti questi passaggi ancora una volta.
   3. Alla fine, centrifugare nuovamente la soluzione a 540 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aspirare nuovamente il surnatante lasciando una soluzione sufficiente (0,5 ml) per risospendere il pellet, pipettare energicamente, far cadere il pellet cellulare risospeso sui vetrini e asciugare all'aria. Conservare i vetrini a 4 °C.
4. Immunofluorescenza
   NOTA: L'immunofluorescenza è un metodo immunologico per identificare bersagli cellulari specifici utilizzando un anticorpo primario che lega il bersaglio stesso e un anticorpo secondario fluorescente che lega il primario che consente di localizzare il bersaglio¹¹. In questo caso, un monoclonale di topo anti-53BP1 (1:50) e un policlonale di coniglio anti-γH2AX (1:50) sono usati come anticorpi primari, mentre AlexaFluor568 anti-mouse (1:400) e DyLight488 anti-coniglio (1:200) sono usati come anticorpi secondari, rispettivamente.
   1. Lavare i vetrini due volte in 50 ml di 1x PBS per 5 minuti in barattolo di couplin (16 vetrini uno dopo l'altro).
   2. Quindi tenerli per 30 minuti in soluzione bloccante (10 ml di FBS, 10 ml di 10x PBS, 80 ml di acqua deionizzata, 300 μL di Triton-X).
   3. Aggiungere a ciascun vetrino 10 μL di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi primari disciolti nella soluzione bloccante. Coprire i vetrini con nastro di paraffina e incubare a 4 °C per una notte.
   4. Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi in 1x PBS per 5 minuti.
   5. Aggiungere a ciascun vetrino 10 μL di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi secondari disciolti nella soluzione bloccante. Coprire i vetrini con nastro di paraffina e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
   6. Eseguire tre lavaggi in 1x PBS per 5 min.
   7. Aggiungere 2,5 μL di soluzione antisbiadimento con DAPI sui vetrini di copertura prima del montaggio per controcolorare i nuclei.
      NOTA: Al fine di valutare la cinetica dei fuochi, la procedura è la stessa descritta da 1.1 a 1.4, osservando che il prelievo cellulare e la doppia immunofluorescenza vengono eseguiti a 0 ore, dopo 2 ore di trattamento post-bleomicina e quindi, dopo aver rimosso il mutageno, a 4 ore, 6 ore e 24 ore post-trattamento.

2. Analisi al microscopio a fluorescenza

NOTA: "Microscopio a fluorescenza" si riferisce a qualsiasi microscopio che utilizza la fluorescenza per generare un'immagine. Il campione viene illuminato con luce di una specifica lunghezza d'onda (o lunghezze d'onda) che viene assorbita dai fluorofori, inducendoli ad emettere luce di lunghezze d'onda più lunghe¹². AlexaFluor568 e DyLight 488 assorbono luce di circa 568 e 488 nm ed emettono luce rispettivamente di 603 e 520 nm. Pertanto, sono visibili come fluorescenza rossa o verde utilizzando rispettivamente un filtro TRITC o FITC.

1. Assegna un punteggio alla presenza di fuochi in ogni diapositiva sotto un obiettivo di immersione 100x (Figura 1).
2. Assegna un punteggio a 200 nuclei per vetrino e conta il numero di focolai γH2AX/53BP1 in ciascun nucleo.
3. Esprimere i risultati in termini di numero medio di focolai per nuclei totali valutati. Questi includono sia γH2AX/53BP1 positivi (che mostrano almeno un segnale di fluorescenza) che negativi (che non mostrano alcun segnale di fluorescenza).

Risultati

I dati ottenuti dall'analisi al microscopio a fluorescenza dei linfociti periferici ci permettono di valutare tre aspetti principali: l'efficacia del trattamento con bleomicina nell'aumentare il numero di focolai di γH2AX e 53BP1 (e quindi di DSB) a causa del suo effetto mutageno, in che misura entrambi i focolai sono co-localizzati nel sito delle DSB e il decorso temporale dei focolai di γH2AX e 53BP1 per delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina. Come previsto, è stata osservata una frequenz...

Discussione

L'analisi di immunofluorescenza dei focolai di γH2AX e 53BP1 è un metodo adatto per valutare il danno genomico nei nuclei interfase di un sistema cellulare. Questa procedura presenta diversi punti critici che possono influenzare l'esito degli esperimenti, principalmente gli agenti utilizzati nella fissazione e permeabilizzazione, il tipo di anticorpi e i loro fattori di diluizione e la concentrazione del mutageno.

Il mantenimento dell'integrità proteica è fondamentale poiché il metodo del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization