人外周淋巴细胞中γH2AX和53BP1的双重免疫荧光

摘要

该协议提出了一种通过同时检测博来霉素处理的人外周淋巴细胞的间期核中的γH 2AX和53BP1病灶来评估DNA双链断裂的形成和修复的方法。

摘要

双链断裂（DSB）是细胞核中可能发生的最严重的病变之一，如果不修复，它们可能导致严重的后果，包括癌症。因此，该细胞具有修复DSB的复杂机制，并且这些途径涉及组蛋白H2AX在Ser-139（即γH2AX）和p53结合蛋白1（53BP1）处磷酸化形式。由于这两种蛋白质都可以在DSB的位点形成病灶，因此鉴定这些标志物被认为是研究DSB及其修复动力学的合适方法。根据导致γH2AX和53BP1病灶形成的分子过程，研究它们在DSB附近的共定位可能更有用，以便建立一种替代方法，允许通过同时检测两个DNA损伤标记来量化DSB。因此，该协议旨在评估放射性模拟剂博来霉素通过在双重免疫荧光中存在γH 2AX和53BP1病灶诱导的人淋巴细胞中的基因组损伤。使用这种方法，我们还描绘了γH2AX和53BP1病灶数量随时间的变化，作为研究博来霉素诱导的DSB的修复动力学的初步尝试。

引言

DNA损伤由内源性物质持续诱导，例如细胞氧化代谢产生的ROS，或外源性，包括化学物质^和物理1。在最有害的病变中，双链断裂（DSBs）在导致基因组不稳定方面起着重要作用，因为它们会导致染色体畸变，进而引发致癌过程。因此，细胞被赋予了复杂而有效的DSB修复机制²。

当DSB发生时，细胞触发DNA损伤反应（DDR），其中与MRE11 / RAD50 / NBS1复合物一起招募ATM或ATR激酶以激活减缓或停止^{细胞周期的其他}蛋白质3。这些激酶的一个重要靶标是组蛋白H2AX，它在DSB的几个兆碱基（即γH2AX）内的Ser-139上磷酸化，从而允许募集几种修复因子，例如BRCA1和p53结合蛋白1（53BP1）³。之后，触发同源重组（HR），非同源末端连接（NHEJ）或单链退火（SSA）之间的一种途径来修复DSB^4，5。因此，53BP1参与决定HR或NHEJ之间的选择，主要促进NHEJ的激活而不是HR⁶。此外，H2AX组蛋白和53BP1的磷酸化形式都可以在DSB的位点形成病灶。由于这些病灶持续到双链的完整性恢复，因此在时间间隔内评估γH2AX或53BP1病灶的出现/消失被认为是评估细胞系统中DSB发生和修复的有用方法^6，7。然而，根据上述分子过程，由于γH2AX和53BP1病灶预计在DDR⁸，⁹期间在DSB附近共定位^，因此在双重免疫荧光中同时检测这些标志物的存在是有用的。

因此，本手稿的目的是评估同时定量γH2AX和53BP1病灶的适用性，以评估放射性模拟剂博来霉素诱导的人外周淋巴细胞的基因组损伤。使用相同的方法，我们还尝试根据先前设置的实验程序¹⁰描绘博来霉素诱导的DSB的修复动力学。

研究方案

该研究得到了比萨大学伦理委员会的批准，并获得了每个捐赠者的知情和签署同意。

1. γH2AX和53BP1病灶的形成

1. 样品制备和诱变处理
   1. 通过静脉穿刺从含有肝素锂作为抗凝剂的采血管（例如真空管）中收集健康成年人的全血样本。
   2. 为了保证适当的血液样本保存，请在采样后24小时内开始该程序。
   3. 将 300 μL 样品加入含有 4.7 mL 完全培养基（0.5% 青霉素-链霉素、0.75% 植物血凝素、10% 先前灭活的 FBS、88.75% RPMI 1640）的管中。
   4. 然后加入硫酸博来霉素至终浓度为 5 μg/mL。
      注意:硫酸博来霉素是一种诱变剂。避免皮肤接触和吸入。准备溶液并将样品添加到引擎盖下。
   5. 对于每个样品，设置阴性对照（无诱变剂）。
   6. 将管子置于37°C的恒温器中2小时。
2. 固定
   1. 在室温下以540× g 离心样品5分钟。
   2. 吸出上清液并用涡旋重悬沉淀。
   3. 加入 5 mL 低渗溶液（2.87 g KCl 溶于 500 mL 去离子水中）和 400 μL 固定前溶液（5:3 乙酸:甲醇）以引起红细胞溶血。
   4. 在室温下以540× g 离心样品5分钟。
   5. 吸出上清液并将沉淀在室温下重悬于5mL甲醇中至少30分钟以固定细胞。
   6. 或者，将细胞储存在-20°C直至使用。
3. 载玻片准备
   1. 在室温下以540× g 离心样品5分钟。
   2. 吸出上清液并将沉淀重悬于5mL的3:1甲醇:乙酸溶液中。再次重复这些步骤。
   3. 最后，在室温下再次以540× g 离心溶液5分钟。
   4. 再次吸出上清液，留下足够的溶液（0.5mL）以重悬沉淀，大力移液，将重悬的细胞沉淀滴在载玻片上，然后风干。将载玻片储存在4°C。
4. 免疫荧光
   注意:免疫荧光是一种免疫学方法，用于识别特定细胞靶标，使用结合靶标本身的一抗和结合一抗的荧光二抗，允许定位靶标¹¹。在这种情况下，小鼠单克隆抗-53BP1（1:50）和兔多克隆抗γH2AX（1:50）用作一抗，而AlexaFluor568抗小鼠（1:400）和DyLight488抗兔（1:200）分别用作二抗。
   1. 在 50 mL 的 1x PBS 中在耦合罐中洗涤载玻片 5 分钟（背靠背 16 张载玻片）。
   2. 然后将它们在封闭溶液（10 mL FBS、10 mL 10x PBS、80 mL 去离子水、300 μL Triton-X）中保持 30 分钟。
   3. 向每张载片中加入 10 μL 含有溶解在封闭溶液中的一抗的两种溶液中的一种。用石蜡带覆盖载玻片并在4°C孵育过夜。
   4. 孵育后，在1x PBS中进行三次洗涤5分钟。
   5. 向每张载片中加入 10 μL 含有溶解在封闭溶液中的二抗的两种溶液中的一种。用石蜡带覆盖载玻片，并在室温下孵育2小时。
   6. 在1x PBS中进行三次洗涤5分钟。
   7. 在组装前在盖玻片上加入 2.5 μL 带有 DAPI 的抗淬灭溶液，以复染细胞核。
      注意:为了评估病灶动力学，该过程与1.1至1.4中所述相同，注意细胞收获和双重免疫荧光在博来霉素治疗后2小时后0小时进行，然后在去除诱变剂后4小时，6小时和24小时处理后。

2. 通过荧光显微镜进行分析

注意:"荧光显微镜"是指使用荧光生成图像的任何显微镜。用特定波长（或多个波长）的光照射样品，该光被荧光团吸收，使它们发出更长波长的光¹²。AlexaFluor568和DyLight 488分别吸收约568和488 nm的光，并发射603和520 nm的光。因此，它们分别使用TRITC或FITC滤光片可见为红色或绿色荧光。

1. 在100倍浸没物镜下对每张载玻片中焦点的存在进行评分（图1）。
2. 对每张载玻片 200 个细胞核进行评分，并计算每个细胞核中 γH2AX/53BP1 病灶的数量。
3. 根据每个总核评分的平均病灶数来表达结果。这些包括γH2AX / 53BP1阳性（显示至少一个荧光信号）和阴性（未显示任何荧光信号）细胞核。

结果

通过荧光显微镜分析外周淋巴细胞获得的数据使我们能够评估三个主要方面:博来霉素治疗在增加γH2AX和53BP1病灶（以及DSB）数量方面的有效性，由于其诱变作用，两个病灶在DSB位点共定位的程度，以及γH2AX和53BP1病灶的时间过程，以描绘博来霉素诱导的DSB的修复动力学。正如预期的那样，在未处理和处理的细胞之间观察到γH2AX和53BP1病灶的频率非常高，从而证实了博来霉素诱导外周淋巴细胞中DSB的...

讨论

γH2AX和53BP1病灶的免疫荧光分析是评估细胞系统间期核中基因组损伤的合适方法。该程序有几个关键点可以影响实验的结果，主要是用于固定和透化的试剂，抗体的类型及其稀释因子以及诱变剂的浓度。

维持蛋白质完整性至关重要，因为免疫荧光方法期望识别主要是蛋白质的抗原。在该协议中，甲醇用于固定淋巴细胞。此步骤特别重要，因为酒精通过置换水并导致可溶性蛋白...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization