Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.

Zusammenfassung

Doppelstrangbrüche (DSBs) sind eine der schwersten Läsionen, die in Zellkernen auftreten können, und wenn sie nicht repariert werden, können sie zu schweren Folgen, einschließlich Krebs, führen. Die Zelle ist daher mit komplexen Mechanismen zur Reparatur von DSBs ausgestattet, und diese Signalwege beinhalten Histon H2AX in seiner phosphorylierten Form an Ser-139 (nämlich γH2AX) und das p53-bindende Protein 1 (53BP1). Da beide Proteine an den Stellen von DSBs Herde bilden können, wird die Identifizierung dieser Marker als geeignete Methode angesehen, um beide DSBs und ihre Reparaturkinetik zu untersuchen. Entsprechend den molekularen Prozessen, die zur Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci führen, könnte es sinnvoller sein, ihre Kolokalisation in der Nähe der DSBs zu untersuchen, um einen alternativen Ansatz zu etablieren, der die Quantifizierung von DSBs durch die gleichzeitige Detektion von zwei DNA-Schadensmarkern ermöglicht. Daher zielt dieses Protokoll darauf ab, die genomische Schädigung in humanen Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin durch die Anwesenheit von γH2AX- und 53BP1-Foci in einer dualen Immunfluoreszenz zu untersuchen. Mit dieser Methodik haben wir auch die Variation in der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci im Laufe der Zeit beschrieben, als vorläufigen Versuch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs zu untersuchen.

Einleitung

DNA-Schäden werden kontinuierlich durch Substanzen induziert, die endogen sein können, wie z. B. ROS, die durch den zellulären oxidativen Stoffwechsel erzeugt werden, oder durch exogene, sowohl chemische als auch physikalische Stoffe¹. Zu den schädlichsten Läsionen gehören Doppelstrangbrüche (DSBs), die eine grundlegende Rolle bei der genomischen Instabilität spielen, da sie Chromosomenaberrationen verursachen, die wiederum den Prozess der Krebsentstehung in Gang setzen können. Auf diese Weise werden Zellen mit komplexen und effizienten Mechanismen der Reparatur von DSBs ausgestattet².

Wenn ein DSB auftritt, löst die Zelle die DNA-Schadensantwort (DDR) aus, bei der zusammen mit dem MRE11/RAD50/NBS1-Komplex ATM- oder ATR-Kinasen rekrutiert werden, um andere Proteine zu aktivieren, die den Zellzyklus verlangsamen oder stoppen³. Ein wesentliches Ziel dieser Kinasen ist das Histon H2AX, das auf Ser-139 innerhalb weniger Megabasen aus den DSBs phosphoryliert ist (nämlich γH2AX), wodurch die Rekrutierung verschiedener Reparaturfaktoren wie u.a. BRCA1 und p53-bindendes Protein 1 (53BP1)³ ermöglicht wird. Später wird ein Weg zwischen homologer Rekombination (HR), nicht-homologem Endverknüpfen (NHEJ) oder Single-Strang-Annealing (SSA) ausgelöst, um die DSBs zu reparieren ^4,5. Daher ist 53BP1 an der Wahl zwischen HR und NHEJ beteiligt und fördert hauptsächlich die Aktivierung von NHEJ anstelle von HR⁶. Darüber hinaus können sowohl die phosphorylierte Form des H2AX-Histons als auch von 53BP1 Foci an den Stellen von DSBs bilden. Da diese Foci so lange bestehen bleiben, bis die Integrität des Doppelstrangs wiederhergestellt ist, wird die Beurteilung des Auftretens/Verschwindens von γH2AX- oder 53BP1-Foci innerhalb eines Zeitintervalls als nützliche Methode angesehen, um das Auftreten und die Reparatur von DSBs in einem Zellsystem zu beurteilen ^6,7. Da jedoch nach den oben beschriebenen molekularen Prozessen davon auszugehen ist, dass γH2AX- und 53BP1-Foci während DDR ^8,9 in der Nähe der DSBs kolokalisiert werden, kann es sinnvoll sein, gleichzeitig das Vorhandensein dieser Marker in einer dualen Immunfluoreszenz nachzuweisen.

Ziel dieses Manuskripts war es daher, die Eignung der simultanen Quantifizierung von γH2AX- und 53BP1-Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu untersuchen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch den radiomimetischen Wirkstoff Bleomycin induziert wird. Mit der gleichen Methodik versuchten wir auch, die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs gemäß einem zuvor aufgebauten experimentellen Verfahren¹⁰ zu beschreiben.

Protokoll

Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Pisa genehmigt, und von jedem Spender wurde eine informierte und unterschriebene Zustimmung eingeholt.

1. Bildung von γH2AX- und 53BP1-Foci

1. Probenvorbereitung und erbgutverändernde Behandlung
   1. Entnahme von Vollblutproben durch Venenpunktion von gesunden erwachsenen Personen in Blutentnahmeröhrchen (z. B. Vacutainer), die Lithiumheparin als Antikoagulans enthalten.
   2. Um eine ordnungsgemäße Konservierung der Blutprobe zu gewährleisten, müssen Sie innerhalb von 24 Stunden nach der Probenahme mit dem Verfahren beginnen.
   3. 300 μl der Probe werden in ein Röhrchen gegeben, das 4,7 ml komplettes Medium enthält (0,5 % Penicillin-Streptomycin, 0,75 % Phytohämagglutinin, 10 % FBS zuvor inaktiviert, 88,75 % RPMI 1640).
   4. Anschließend wird Bleomycinsulfat bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml zugegeben.
      ACHTUNG: Bleomycinsulfat ist ein Mutagen. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Bereiten Sie die Lösung vor und geben Sie die Probe unter eine Haube.
   5. Richten Sie für jede Probe eine Negativkontrolle (keine Mutagene) ein.
   6. Legen Sie das Röhrchen für 2 h in einen Thermostat bei 37 °C.
2. Fixierung
   1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Pellet mit Wirbel.
   3. Fügen Sie 5 ml hypotone Lösung (2,87 g KCl, gelöst in 500 ml deionisiertem Wasser) und 400 μl präfixative Lösung (5:3 Essigsäure: Methanol) hinzu, um eine Hämolyse der roten Blutkörperchen zu bewirken.
   4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   5. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Methanol bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, um die Zellen zu fixieren.
   6. Alternativ können Sie die Zellen bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
3. Vorbereitung der Objektträger
   1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml einer 3:1-Methanol-Essigsäure-Lösung. Wiederholen Sie diese Schritte noch einmal.
   3. Zum Schluss zentrifugieren Sie die Lösung erneut bei 540 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   4. Saugen Sie den Überstand wieder an und lassen Sie genügend Lösung (0,5 ml) übrig, um das Pellet zu resuspendieren, pipettieren Sie kräftig, lassen Sie das resuspendierte Zellpellet auf die Objektträger fallen und lassen Sie es an der Luft trocknen. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C.
4. Immunfluoreszenz
   HINWEIS: Immunfluoreszenz ist eine immunologische Methode zur Identifizierung spezifischer Zellziele, bei der ein primärer Antikörper, der das Ziel selbst bindet, und ein fluoreszierender sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper bindet, verwendet wird, der die Lokalisierung des Ziels^{ermöglicht 11}. In diesem Fall werden ein monoklonaler Maus-Anti-53BP1 (1:50) und ein polyklonaler Kaninchen-Anti-γH2AX (1:50) als Primärantikörper verwendet, während AlexaFluor568 Anti-Maus (1:400) bzw. DyLight488 Anti-Kaninchen (1:200) als Sekundärantikörper verwendet werden.
   1. Waschen Sie die Objektträger zweimal in 50 ml 1x PBS für 5 Minuten im Coupur-Glas (16 Objektträger hintereinander).
   2. Bewahren Sie sie dann 30 Minuten lang in Blockierlösung auf (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml deionisiertes Wasser, 300 μl Triton-X).
   3. Geben Sie zu jedem Objektträger 10 μl jeder der beiden Lösungen, die die in der Blockierungslösung gelösten primären Antikörper enthalten. Die Objektträger mit Paraffinband abdecken und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Nach der Inkubation dreimal 5 Minuten lang in 1x PBS waschen.
   5. Fügen Sie jedem Objektträger 10 μl jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in der Blockierungslösung gelösten sekundären Antikörper enthalten. Die Objektträger mit Paraffinband abdecken und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   6. Führen Sie drei Wäschen in 1x PBS für 5 Minuten durch.
   7. Geben Sie vor dem Zusammenbau 2,5 μl Antifade-Lösung mit DAPI auf die Deckgläser, um die Kerne gegenzufärben.
      ANMERKUNG: Um die Herdkinetik zu beurteilen, ist das Verfahren das gleiche wie in 1.1 bis 1.4 beschrieben, wobei zu beachten ist, dass die Zellernte und die duale Immunfluoreszenz um 0 h, nach 2 h nach der Bleomycin-Behandlung und dann, nach der Entfernung des Mutagens, nach 4 h, 6 h und 24 h nach der Behandlung durchgeführt werden.

2. Analyse durch ein Fluoreszenzmikroskop

HINWEIS: "Fluoreszenzmikroskop" bezieht sich auf jedes Mikroskop, das Fluoreszenz verwendet, um ein Bild zu erzeugen. Die Probe wird mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (oder Wellenlängen) beleuchtet, das von den Fluorophoren absorbiert wird, wodurch sie Licht längerer Wellenlängen emittieren¹². AlexaFluor568 und DyLight 488 absorbieren Licht von ca. 568 bzw. 488 nm und emittieren Licht von 603 bzw. 520 nm. So sind sie als rote oder grüne Fluoreszenz mit einem TRITC- bzw. FITC-Filter sichtbar.

1. Bewerten Sie das Vorhandensein von Brennpunkten in jeder Objektträger unter einem 100-fachen Immersionsobjektiv (Abbildung 1).
2. Bewerten Sie 200 Kerne pro Objektträger und zählen Sie die Anzahl der γH2AX/53BP1-Foci in jedem Kern.
3. Express-Ergebnisse in Bezug auf die durchschnittliche Anzahl von Foci pro Gesamtkern bewertet. Dazu gehören sowohl γH2AX/53BP1-positive (mit mindestens einem Fluoreszenzsignal) als auch negative (ohne Fluoreszenzsignal) Kerne.

Ergebnisse

Die durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse peripherer Lymphozyten gewonnenen Daten ermöglichen es uns, drei Hauptaspekte zu bewerten: die Wirksamkeit der Bleomycin-Behandlung bei der Erhöhung der Anzahl der γH2AX- und 53BP1-Foci (und damit der DSBs) aufgrund ihrer mutagenen Wirkung, das Ausmaß, in dem beide Foci am Ort der DSBs kolokalisiert sind, und der zeitliche Verlauf von γH2AX- und 53BP1-Foci, um die Reparaturkinetik von Bleomycin-induzierten DSBs abzugrenzen. Erwartungsgemäß wurde eine sehr höhere Hä...

Diskussion

Die Immunfluoreszenzanalyse von γH2AX- und 53BP1-Foci ist eine geeignete Methode zur Beurteilung genomischer Schäden in Interphasenkernen eines Zellsystems. Dieses Verfahren weist mehrere kritische Punkte auf, die das Ergebnis der Experimente beeinflussen können, vor allem die bei der Fixierung und Permeabilisierung verwendeten Wirkstoffe, die Art der Antikörper und ihre Verdünnungsfaktoren sowie die Konzentration des Mutagens.

Die Aufrechterhaltung der Proteinintegrität ist von grundleg...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization