인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

요약

이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.

초록

이중 가닥 절단(DSB)은 세포핵에서 발생할 수 있는 가장 심각한 병변 중 하나이며, 복구하지 않으면 암을 포함한 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 세포에는 DSB를 복구하는 복잡한 메커니즘이 제공되며 이러한 경로는 Ser-139(즉, γH2AX) 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)에서 인산화된 형태의 히스톤 H2AX를 포함합니다. 두 단백질 모두 DSB 부위에서 병소를 형성할 수 있기 때문에 이러한 마커의 식별은 DSB와 복구 동역학을 모두 연구하는 데 적합한 방법으로 간주됩니다. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성으로 이어지는 분자 과정에 따르면, 두 개의 DNA 손상 마커를 동시에 검출하여 DSB를 정량화할 수 있는 대체 접근법을 설정하기 위해 DSB 근처의 공동 국소화를 조사하는 것이 더 유용할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 이중 면역형광에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 존재를 통해 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 또한 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 연구하기 위한 예비 시도로 시간 경과에 따른 γH2AX 및 53BP1 병소 수의 변화를 설명했습니다.

서문

DNA 손상은 세포 산화 대사에 의해 생성된 ROS와 같은 내인성일 수 있는 작용제에 의해 연속적으로 유도되거나, 또는 외인성, 화학적 및 물리적^둘 다1. 가장 해로운 병변 중 이중 가닥 절단(DSB)은 염색체 이상을 일으켜 발암 과정을 시작할 수 있기 때문에 게놈 불안정성에 기여하는 근본적인 역할을 합니다. 따라서, 세포는 DSBs를 복구하는 복잡하고 효율적인 메카니즘을 제공받는다².

DSB가 발생하면 세포는 MRE11/RAD50/NBS1 복합체와 함께 ATM 또는 ATR 키나아제를 모집하여 세포 주기를 늦추거나 멈추게 하는 다른 단백질을 활성화하는 DNA 손상 반응(DDR)을 유발합니다³. 이러한 키나아제의 필수 표적은 히스톤 H2AX이며, 이는 DSB(즉, γH2AX)로부터 몇 메가베이스 내에서 Ser-139에 인산화되어 BRCA1 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)³. 나중에, 상동 재조합 (HR), 비-상동 말단 접합 (NHEJ), 또는 단일-가닥 어닐링 (SSA) 중 하나의 경로가 DSB를 복구하기 위해 트리거된다 ^4,5. 따라서 53BP1은 HR 또는 NHEJ 중 하나를 선택하는 데 관여하며 주로 HR⁶보다는 NHEJ의 활성화를 촉진합니다. 또한, H2AX 히스톤과 53BP1의 인산화 된 형태는 모두 DSB 부위에서 병소를 형성 할 수 있습니다. 이들 병소는 이중 가닥의 완전성이 회복될 때까지 지속되므로, 시간 간격 내에 γH2AX 또는 53BP1 병소의 출현/소실을 평가하는 것은 셀 시스템에서 DSB의 발생 및 복구를 평가하는 유용한 방법으로 간주된다 ^6,7. 그러나, 상기 기술된 분자 과정에 따르면, γH2AX 및 53BP1 초점은 DDR^8,9 동안 DSB 근처에서 공동 국소화될 것으로 예상되기 때문에^, 이중 면역형광에서 이들 마커의 존재를 동시에 검출하는 것이 유용할 수 있다.

따라서, 이 원고의 목적은 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 말초 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하기 위해 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 정량화의 적합성을 평가하는 것이었습니다. 동일한 방법론을 사용하여 이전에 설정된 실험 절차¹⁰에 따라 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 설명하려고 시도했습니다.

프로토콜

이 연구는 피사 대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며 각 기증자로부터 정보에 입각하고 서명 된 동의를 얻었습니다.

1. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성

1. 시료 준비 및 돌연변이 유발 처리
   1. 항응고제로 리튬 헤파린이 포함된 혈액 수집(예: Vacutainer) 튜브에서 건강한 성인 개인의 정맥 천자에 의한 전혈 샘플을 수집합니다.
   2. 적절한 혈액 샘플 보존을 보장하려면 샘플링 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.
   3. 300μL의 샘플을 4.7mL의 완전 배지(0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 0.75% 식물성 헤마글루티닌, 이전에 비활성화된 10% FBS, 88.75% RPMI 1640)가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
   4. 그런 다음 블레오마이신 설페이트를 최종 농도 5μg/mL에 추가합니다.
      주의: 블레오마이신 설페이트는 돌연변이 유발 물질입니다. 피부 접촉 및 흡입을 피하십시오. 용액을 준비하고 후드 아래에 샘플을 추가하십시오.
   5. 각 샘플에 대해 음성 대조군(돌연변이원 없음)을 설정합니다.
   6. 튜브를 37°C의 온도 조절기에 2시간 동안 놓습니다.
2. 고정
   1. 실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.
   2. 상층액을 흡인하고 소용돌이로 펠릿을 다시 현탁하십시오.
   3. 5mL의 저삼투압 용액(500mL의 탈이온수에 용해된 2.87g의 KCl)과 400μL의 사전 고정 용액(5:3 아세트산: 메탄올)을 추가하여 적혈구의 용혈을 유발합니다.
   4. 실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.
   5. 상청액을 흡인하고 펠렛을 실온에서 메탄올 5mL에 최소 30분 동안 재현탁하여 세포를 고정합니다.
   6. 대안적으로, 사용할 때까지 세포를 -20°C에서 보관한다.
3. 슬라이드 준비
   1. 실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.
   2. 상층액을 흡인하고 펠릿을 3:1 메탄올:아세트산 용액 5mL에 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
   3. 마지막에, 용액을 실온에서 5분 동안 540 x g 에서 다시 원심분리한다.
   4. 펠릿을 재현탁하기에 충분한 용액(0.5mL)을 남기고 상청액을 다시 흡인하고, 격렬하게 피펫팅하고, 재현탁된 세포 펠릿을 슬라이드에 떨어뜨리고, 자연 건조합니다. 슬라이드를 4°C에서 보관합니다.
4. 면역형광
   참고: 면역형광법은 표적 자체에 결합하는 1차 항체와 표적에 국소화할 수 있는 1차 결합하는 형광 2차 항체를 사용하여 특정 세포 표적을 식별하는 면역학적 방법입니다¹¹. 이 경우 마우스 단클론 항-53BP1(1:50)과 토끼 다클론 항-γH2AX(1:50)를 1차 항체로 사용하고 AlexaFluor568 항-마우스(1:400) 및 DyLight488 항-토끼(1:200)를 각각 2차 항체로 사용합니다.
   1. 슬라이드를 커플플린 병에서 5분 동안 1x PBS 50mL로 두 번 세척합니다(연속 16개의 슬라이드).
   2. 그런 다음 블로킹 용액(FBS 10mL, 10x PBS 10mL, 탈이온수 80mL, Triton-X 300μL)에 30분 동안 보관합니다.
   3. 블로킹 용액에 용해된 1차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각의 10 μL를 각 슬라이드에 첨가한다. 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 4°C에서 밤새 배양합니다.
   4. 배양 후 1x PBS에서 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.
   5. 블로킹 용액에 용해된 2차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각의 10 μL를 각 슬라이드에 첨가한다. 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
   6. 1x PBS에서 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.
   7. 핵을 반대 염색하기 위해 조립 전에 커버슬립에 DAPI가 포함된 페이드 방지 용액 2.5μL를 추가합니다.
      참고: 초점 동역학을 평가하기 위해 절차는 1.1에서 1.4까지 설명된 것과 동일하며, 세포 수확 및 이중 면역형광은 블레오마이신 처리 후 0시간, 2시간 후, 그리고 돌연변이원을 제거한 후, 처리 후 4시간, 6시간 및 24시간.

2. 형광현미경을 통한 분석

참고: "형광 현미경"은 형광을 사용하여 이미지를 생성하는 모든 현미경을 의미합니다. 시편은 형광단에 흡수되는 특정 파장(또는 파장)의 빛으로 조명되어 더 긴 파장의 빛을 방출하게 한다¹². AlexaFluor568 및 DyLight 488은 각각 약 568 및 488 nm의 빛을 흡수하고 603 및 520 nm의 빛을 방출합니다. 따라서 각각 TRITC 또는 FITC 필터를 사용하여 적색 또는 녹색 형광으로 볼 수 있습니다.

1. 100x 몰입 대물렌즈에서 각 슬라이드의 초점의 존재 여부를 점수화합니다(그림 1).
2. 슬라이드당 200개의 핵을 채점하고 각 핵의 γH2AX/53BP1 병소 수를 계산합니다.
3. 점수가 매겨진 총 핵당 평균 병소 수로 결과를 표현합니다. 여기에는 γH2AX/53BP1 양성(적어도 하나의 형광 신호를 나타냄) 및 음성(형광 신호를 나타내지 않음) 핵이 모두 포함됩니다.

결과

말초 림프구의 형광 현미경 분석으로 얻은 데이터를 통해 우리는 세 가지 주요 측면을 평가할 수 있습니다: 돌연변이 유발 효과로 인해 γH2AX 및 53BP1 병소(따라서 DSB)의 수를 증가시키는 블레오마이신 치료의 효과, 두 병소가 DSB 부위에 공동 국한되는 정도, 블레오마이신 유도 DSB의 복구 동역학을 설명하기 위한 γH2AX 및 53BP1 병소의 시간 경과. 예상한 바와 같이, 처리되지 않은 세포와 처리된 세포 ?...

토론

γH2AX 및 53BP1 병소의 면역형광 분석은 세포 시스템의 간기 핵에서 게놈 손상을 평가하는 데 적합한 방법입니다. 이 절차에는 실험 결과, 주로 고정 및 투과에 사용되는 제제, 항체 유형 및 희석 인자, 돌연변이 유발 물질의 농도에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다.

면역형광법은 주로 단백질인 항원을 식별할 것으로 예상하기 때문에 단백질 무결성의 유지?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization