İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Özet

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

Özet

Çift iplikçik kopmaları (DSB'ler), hücre çekirdeğinde meydana gelebilecek en ciddi lezyonlardan biridir ve onarılmazsa, kanser de dahil olmak üzere ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, hücreye DSB'leri onarmak için karmaşık mekanizmalar sağlanır ve bu yollar Ser-139 (yani γH2AX) ve p53 bağlayıcı protein 1'de (53BP1) fosforile edilmiş formunda histon H2AX'i içerir. Her iki protein de DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabildiğinden, bu belirteçlerin tanımlanması hem DSB'leri hem de onarım kinetiğini incelemek için uygun bir yöntem olarak kabul edilir. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumuna yol açan moleküler süreçlere göre, iki DNA hasar belirtecinin aynı anda tespiti ile DSB'lerin nicelleştirilmesine izin veren alternatif bir yaklaşım oluşturmak için DSB'lerin yakınındaki ko-lokalizasyonlarını araştırmak daha yararlı olabilir. Bu nedenle, bu protokol, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı, ikili immünofloresansta γH2AX ve 53BP1 odaklarının varlığı yoluyla değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini incelemek için bir ön girişim olarak, zaman içinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının sayısındaki değişimi de tanımladık.

Giriş

DNA hasarı, hücresel oksidatif metabolizma tarafından üretilen ROS veya hem kimyasallar hem de fiziksel¹ gibi eksojen olabilen ajanlar tarafından sürekli olarak indüklenir. En zararlı lezyonlar arasında, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) genomik instabiliteye katkıda bulunmada temel bir rol oynar, çünkü bunlar karsinogenez sürecini başlatabilen kromozom anormalliklerine neden olurlar. Böylece hücrelere DSB'lerin onarımı^2'nin karmaşık ve verimli mekanizmaları sağlanır.

Bir DSB meydana geldiğinde, hücre, MRE11 / RAD50 / NBS1 kompleksi ile birlikte, hücre döngüsü^3'ü yavaşlatan veya durduran diğer proteinleri aktive etmek için ATM veya ATR kinazların işe alındığı DNA hasar yanıtını (DDR) tetikler. Bu kinazların temel bir hedefi, DSB'lerden (yani γH2AX) birkaç megabaz içinde Ser-139 üzerinde fosforile edilen histon H2AX'tir, böylece diğerlerinin yanı sıra BRCA1 ve p53 bağlayıcı protein 1 (53BP1)³ gibi çeşitli onarım faktörlerinin işe alınmasına izin verir. Daha sonra,^{DSB'leri 4,5'i} onarmak için homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya tek iplikli tavlama (SSA) arasında bir yol tetiklenir. Bu nedenle, 53BP1, İK veya NHEJ arasındaki seçimi dikte etmede, esas olarak HR⁶ yerine NHEJ'nin aktivasyonunu teşvik etmede rol oynar. Dahası, hem H2AX histonun hem de 53BP1'in fosforile edilmiş formu, DSB'lerin bölgelerinde odaklar oluşturabilir. Bu odaklar, çift ipliğin bütünlüğü geri kazanılana kadar devam ettiğinden, γH2AX veya 53BP1 odaklarının bir zaman aralığında ortaya çıkışını / kaybolmasını değerlendirmek, bir hücre sisteminde DSB'lerin oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için yararlı bir yöntem olarak kabul edilir ^6,7. Bununla birlikte, yukarıda tarif edilen moleküler süreçlere göre, γH2AX ve 53BP1 odaklarının DDR^8,9 sırasında DSB'lerin yakınında birlikte lokalize olması beklendiğinden^, bu belirteçlerin varlığını çift immünofloresanda eşzamanlı olarak tespit etmek yararlı olabilir.

Bu nedenle, bu makalenin amacı, radyomimetik ajan bleomisin tarafından insan periferik lenfositlerinde indüklenen genomik hasarı değerlendirmek için γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı nicelleştirilmesinin uygunluğunu değerlendirmektir. Aynı metodolojiyi kullanarak, bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini daha önce kurulmuş deneysel bir prosedür^10'a göre tanımlamaya çalıştık.

Protokol

Çalışma Pisa Üniversitesi etik kurulu tarafından onaylanmış, her donörden bilgilendirilmiş ve imzalı onam alınmıştır.

1. γH2AX ve 53BP1 odaklarının oluşumu

1. Numunelerin hazırlanması ve mutajenik tedavi
   1. Antikoagülan olarak lityum heparin içeren kan toplama (örneğin, Vacutainer) tüplerinde sağlıklı yetişkin bireylerden venipunktur yoluyla tam kan örnekleri toplayın.
   2. Uygun kan örneği korumasını garanti etmek için, numune alımından sonraki 24 saat içinde prosedürü başlatın.
   3. Numunenin 300 μL'sini 4.7 mL tam ortam içeren bir tüpe ekleyin (% 0.5 penisilin-streptomisin,% 0.75 fitohemaglutinin,% 10 FBS daha önce inaktive edilmiş,% 88.75 RPMI 1640).
   4. Daha sonra bleomisin sülfatı 5 μg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin.
      DİKKAT: Bleomisin sülfat bir mutajendir. Cilt temasından ve solumaktan kaçının. Çözeltiyi hazırlayın ve numuneyi bir başlık altına ekleyin.
   5. Her numune için negatif bir kontrol ayarlayın (mutajen yokluğu).
   6. Tüpü 2 saat boyunca 37 ° C'de bir termostata yerleştirin.
2. Fiksasyon
   1. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
   2. Süpernatantı aspire edin ve peleti vorteks ile yeniden askıya alın.
   3. Kırmızı kan hücrelerinin hemolizine neden olmak için 5 mL hipotonik çözelti (500 mL deiyonize suda çözünmüş 2.87 g KCl) ve 400 μL pre-fiksatif çözelti (5: 3 asetik asit: metanol) ekleyin.
   4. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
   5. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri sabitlemek için peleti oda sıcaklığında 5 mL metanol içinde en az 30 dakika boyunca yeniden askıya alın.
   6. Alternatif olarak, hücreleri kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
3. Slayt hazırlama
   1. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de santrifüj edin.
   2. Süpernatantı aspire edin ve peleti 3: 1 metanolün 5 mL'sinde yeniden askıya alın: asetik asit çözeltisi. Bu adımları bir kez daha yineleyin.
   3. Sonunda, çözeltiyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 540 x g'de tekrar santrifüj edin.
   4. Pelet, pipeti kuvvetli bir şekilde askıya almak, yeniden askıya alınmış hücre peletini slaytlara bırakmak ve havayla kurutmak için yeterli çözelti (0.5 mL) bırakarak süpernatantı tekrar aspire edin. Slaytları 4 °C'de saklayın.
4. İmmünofloresan
   NOT: İmmünofloresan, hedefin kendisini bağlayan bir primer antikor ve hedef^11'in lokalizasyonuna izin veren primere bağlanan bir floresan sekonder antikor kullanarak spesifik hücre hedeflerini tanımlamak için immünolojik bir yöntemdir. Bu durumda, birincil antikorlar olarak bir fare monoklonal anti-53BP1 (1:50) ve bir tavşan poliklonal anti-γH2AX (1:50) kullanılırken, ikincil antikorlar olarak sırasıyla AlexaFluor568 anti-fare (1:400) ve DyLight488 anti-tavşan (1:200) kullanılır.
   1. Slaytları iki kez 50 mL 1x PBS içinde 5 dakika boyunca kuplin kavanozda yıkayın (arka arkaya 16 slayt).
   2. Daha sonra bunları bloke edici çözeltide 30 dakika bekletin (10 mL FBS, 10 mL 10x PBS, 80 mL deiyonize su, 300 μL Triton-X).
   3. Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş birincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   4. Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.
   5. Her slayta, blokaj çözeltisinde çözünmüş ikincil antikorları içeren iki çözeltinin her birinin 10 μL'sini ekleyin. Slaytları parafin bantla örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   6. 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkama yapın.
   7. Çekirdekleri boyamak için montajdan önce kapaklara DAPI ile 2,5 μL antifade çözeltisi ekleyin.
      NOT: Fok kinetiği değerlendirmek için, prosedür 1.1 ila 1.4 arasında tarif edilenle aynıdır, hücre hasadı ve ikili immünofloresansın 0 saatte, bleomisin tedavisinden 2 saat sonra ve daha sonra mutajeni çıkardıktan sonra, tedavi sonrası 4 saat, 6 saat ve 24 saatte gerçekleştirildiğini belirtmektedir.

2. Floresan mikroskobu ile analiz

NOT: "Floresan mikroskobu", bir görüntü oluşturmak için floresan kullanan herhangi bir mikroskopu ifade eder. Örnek, floroforlar tarafından emilen belirli bir dalga boyundaki (veya dalga boylarındaki) ışıkla aydınlatılır ve bu da daha uzun dalga boylarında ışık yaymalarına neden olur¹². AlexaFluor568 ve DyLight 488, sırasıyla yaklaşık 568 ve 488 nm ışığı emer ve sırasıyla 603 ve 520 nm ışık yayar. Böylece, sırasıyla bir TRITC veya bir FITC filtresi kullanılarak kırmızı veya yeşil floresan olarak görülebilirler.

1. Her slayttaki odakların varlığını 100x daldırma hedefi altında puanlayın (Şekil 1).
2. Slayt başına 200 çekirdek puanlayın ve her çekirdekteki γH2AX/53BP1 odaklarının sayısını sayın.
3. Ekspresyon sonuçları, puanlanan toplam çekirdek başına ortalama odak sayısı açısından ifade eder. Bunlar arasında hem γH2AX/53BP1 pozitif (en az bir floresan sinyali gösteren) hem de negatif (herhangi bir floresan sinyali göstermeyen) çekirdekler bulunur.

Sonuçlar

Periferik lenfositlerin floresan mikroskop analizi ile elde edilen veriler, üç ana yönü değerlendirmemize izin verir: bleomisin tedavisinin, mutajenik etkisinden dolayı γH2AX ve 53BP1 odaklarının (ve dolayısıyla DSB'lerin) sayısını arttırmadaki etkinliği, her iki odağın da DSB'lerin bölgesinde ne ölçüde birlikte lokalize olduğu ve bleomisin kaynaklı DSB'lerin onarım kinetiğini tanımlamak için γH2AX ve 53BP1 odaklarının zaman seyri. Beklendiği gibi, tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hüc...

Tartışmalar

γH2AX ve 53BP1 odaklarının immünofloresan analizi, bir hücre sisteminin fazlar arası çekirdeklerinde genomik hasarı değerlendirmek için uygun bir yöntemdir. Bu prosedür, deneylerin sonucunu, özellikle fiksasyon ve geçirgenlikte kullanılan ajanları, antikorların tipini ve seyreltme faktörlerini ve mutajenin konsantrasyonunu etkileyebilecek birkaç kritik noktaya sahiptir.

İmmünofloresan yöntemi, esas olarak protein olan antijenleri tanımlamayı beklediği için protein bü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)	Invitrogen	A21124	53BP1 secondary antibody
Bleoprim	Sanofi		bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X	Euroclone	ECB3001D	antibiotics for culture medium
PBS 10X	Termofisher	14200075	Phosphate-buffered saline
FBS	Euroclone	EC20180L	Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody	Merck	MAB 3802	53BP1 primary antibody
Labophot 2	Nikon		Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody	Cell Signaling	#2577	γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin	Termofisher	R30852801	component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Cell Signaling	#8961	Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640	Euroclone	ECB9006L	Culture medium
Triton-X100	Sigma	T9284	Nonionic detergent for permeabilization