JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نصف بناء نظام نموذج خط الخلايا المعوية الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) وبروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لمكافئات الأمعاء الثابتة. يسمح تلطيخ البروتينات المختارة بتحليل معلمات بصرية متعددة من تجربة واحدة للاستخدام المحتمل في دراسات فحص الأدوية قبل السريرية.

Abstract

كانت هناك زيادة في استخدام النماذج المعوية في الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المعوية الالتهابية ، للفحص الدوائي للمواد المفيدة المحتملة ، ولدراسات السمية على المكونات الغذائية التي يحتمل أن تكون ضارة. ومما له صلة بالموضوع أن هناك طلبا حاليا على تطوير نماذج في المختبر تعتمد على الخلايا لتحل محل النماذج الحيوانية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لنموذج مكافئ معوي ثلاثي الأبعاد (3D) أساسي "الأنسجة السليمة" باستخدام خطوط الخلايا مع فائدة مزدوجة تتمثل في توفير كل من البساطة التجريبية (نظام موحد وقابل للتكرار بسهولة) والتعقيد الفسيولوجي (الخلايا المعوية Caco-2 مع مكون مناعي داعم من الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929). يتضمن البروتوكول أيضا تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي للمكافئات المعوية الثابتة ، وبالتالي توفير ميزة تحليل المعلمات البصرية المتعددة من تجربة واحدة. يتم استخدام مقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) تظهر الخلايا العمودية Caco-2 التي تشكل طبقة أحادية ضيقة ومنتظمة في معالجات التحكم للتحقق من فعالية النموذج كنظام تجريبي. باستخدام الغلوتين كمكون غذائي مؤيد للالتهابات ، تشمل المعلمات التي تم تحليلها من الأقسام انخفاض سمك الطبقة الأحادية ، بالإضافة إلى الاضطراب والانفصال عن المصفوفة الأساسية (H&E) ، وانخفاض تعبير بروتين الوصلة الضيقة كما هو موضح من تلطيخ الأوكلودين (قابل للقياس الكمي إحصائيا) ، والتنشيط المناعي لخلايا U937 المهاجرة كما يتضح من مجموعة التمايز 14 (CD14) والتمايز المرتبط ب CD11b إلى البلاعم. كما هو موضح باستخدام عديد السكاريد الدهني لمحاكاة التهاب الأمعاء ، فإن المعلمات الإضافية التي يمكن قياسها هي زيادة تلطيخ المخاط وتعبير السيتوكين (مثل midkine) الذي يمكن استخلاصه من الوسط قبل التثبيت. يمكن التوصية بنموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) والأقسام الثابتة لدراسات الحالة الالتهابية وسلامة الحاجز مع إمكانية تحليل معلمات بصرية متعددة قابلة للقياس الكمي.

Introduction

يشكل الحاجز الظهاري المعوي ، وهو بطانة داخلية بسمك خلية واحدة تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية ، أول حاجز دفاعي مادي أو واجهة بين الخارج والوسط الداخلي للجسم 1,2. تشكل الخلايا المعوية من النوع العمودي النوع الأكثر وفرة من الخلايا الظهارية. هذه هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري من خلال التفاعلات بين العديد من مكونات الحاجز ، بما في ذلك التقاطعات الضيقة (TJs) ، وتلعب دورا مهما في تشديد الحاجز 1,3. يتكون هيكل TJ من بروتينات البلاك داخل الخلايا ، مثل انسداد المنطقة (ZO) والسينغولين ، بالتعاون مع البروتينات عبر الغشاء ، بما في ذلك الإطباق ، والكلاودين ، وجزيئات الالتصاق الموصلية (JAMs) التي تشكل بنية تشبه السوستة تربط بإحكام الخلايا المجاورة 3,4. تنظم البروتينات عبر الغشاء الانتشار السلبي للمركبات الصغيرة وتستبعد الجزيئات الكبيرة السامة.

تحفز المركبات الغذائية السامة المحتملة وملوثات الطعام إنتاج السيتوكين الالتهابي الذي يعطل نفاذية الظهارة ، وينشط الخلايا المناعية ويسبب التهاب الأنسجة المعوية المزمن5،6،7. في المقابل ، تم الإبلاغ عن العديد من المواد الكيميائية النباتية المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات لتقليل تعبير السيتوكين الالتهابي وتعزيز سلامة حاجز TJ المعوي من خلال استعادة تعبير بروتين TJ وتجميعه4،6،8. ومن ثم ، فإن تنظيم سلامة الحاجز الظهاري بواسطة كل من المركبات المفيدة والضارة قد شهد زيادة في استخدام كل من النماذج في الجسم الحي وفي المختبر التي تهدف إلى محاكاة الحاجز المعوي للفحص الصيدلاني ودراسات السمية. هذا مهم بشكل خاص بالنظر إلى الاهتمام المتزايد بفهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الأمعاء المعوية (IBD) ، والتهاب الأمعاء والقولون الناخر ، والسرطان ، والتي يمكن محاكاتها في النماذج التجريبية8،9،10.

كان هناك طلب على تطوير نماذج قائمة على الخلايا في المختبر من أجل تحقيق هدف "3Rs" في التجارب على. وتشمل هذه بدائل بديلة لاستخدام ، والحد من عدد المستخدمة ، والصقل في اعتماد الأساليب التي تخفف من الضيق11،12،13. علاوة على ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية والفسيولوجية الأساسية بين النماذج البشرية والفئران (القوارض هي الأنواع الأكثر استخداما) مميزة ، مما يؤدي إلى جدل حول فعالية نماذج الفئران كتنبؤات في الاستجابات البشرية12,13. تشمل المزايا العديدة لنماذج خط الخلايا البشرية في المختبر التجريب المقيد بالهدف والملاحظة المباشرة والتحليل المستمر13.

كانت الطبقات الأحادية من نوع الخلية الواحدة في الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) بمثابة نماذج قوية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه إعادة إنتاج التعقيد الفسيولوجي للأنسجة البشريةبدقة 8،13،14. نتيجة لذلك ، يتم تطوير أنظمة زراعة ثلاثية الأبعاد مع تحسينات متزايدة باستمرار لتلخيص التعقيد الفسيولوجي لكل من الأنسجة المعوية السليمة والمريضة كأدوات تقييم المخاطر من الجيل التالي13،14. تشمل هذه النماذج سقالات 3D Transwell ذات خطوط الخلايا المتنوعة ، والثقافات العضوية ، وأجهزة الموائع الدقيقة (الأمعاء على الرقاقة) باستخدام كل من خطوط الخلايا والمواد العضوية (المشتقة من الأنسجة السليمة والمريضة)8،13،14.

استند بروتوكول المكافئ المعوي ثلاثي الأبعاد "الأنسجة السليمة" المقدم في الدراسة الحالية إلى تحقيق توازن بين التعقيد الفسيولوجي والبساطة التجريبية13. يمثل النموذج سقالة 3D Transwell ، التي تتألف من ثلاثة خطوط خلوية (الخلايا المعوية [خط سرطان القولون الغدي القياسي الذهبي Caco-2] مع مكون مناعي داعم [الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929]) ، مما يشكل نظاما موحدا وقابلا للتكرار بسهولة ينطبق على الفحص الأولي للجزيئات الغذائية ذات الأهمية على سلامة الحاجز الظهاري المعوي والاستجابة المناعية. يتضمن البروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لسلامة الحاجز الظهاري باستخدام مكافئات معوية ثابتة. ميزة النهج الحالي هي أنه يمكن جعل أقسام عديدة من الأنسجة المدمجة تلطخ لمعلمات متعددة من تجربة واحدة.

Protocol

1. إعداد نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D المعاد بناؤه

ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء بأكمله في غطاء تدفق رقائقي معقم. تشير جميع الخطوات في الإجراء الذي يتضمن استخدام حاضنة الخلايا إلى أن الثقافات يتم تحضينها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO2 (ما لم ينص على خلاف ذلك في البروتوكول).

  1. التحضير المسبق لخطوط الخلايا المستخدمة في نظام نموذج الأمعاء
    1. خلايا الخلايا الليفية للفأر L929 بتركيز 5 × 105 في 5 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 2 mM L-glutamine ، 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (Pen-Strep) في قارورة F25 واستزراعه في حاضنة قبل 4 أيام من بناء النماذج المعوية. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الوسيط باستخدام ماصة. ثم أضف وسطا جديدا (5 مل) ، واحتضن الخلايا أكثر لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ قبل استخدامها.
    2. خلايا البذور Caco-2 (تركيز 2 × 106) في 10 مل من وسط DMEM (مع 10٪ FBS و 1٪ Pen-Strep) في قارورة خلية F75 واستزراعها في حاضنة قبل 4 أيام من بناء نموذج الغشاء المخاطي في الأمعاء. بعد 48 ساعة ، قم بتغيير الوسيط كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 واحتضان لمدة 48 ساعة إلى التقاء 80٪.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا في مرحلة تكاثر نشطة: ليست متناثرة جدا ولا متقاربة جدا. يوصى بالتقاء 50-60٪. يجب ألا تزرع الخلايا في اليوم السابق لصنع النموذج لأن هذا قد يبطئ القدرة التكاثرية للخلايا ، والتي لن تتجذر بعد ذلك بشكل مثالي في نموذج 3D المعاد بناؤه.
    3. أضف خلايا U937 التي تنمو في تعليق (تركيز 1 × 106) إلى 10 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) (يحتوي على 2 مللي مول L-glutamine ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، 10٪ FBS ، و 1٪ Pen-Strep) في قارورة خلية F75 قبل يومين من إعداد النموذج ، وضعها في حاضنة لمدة 48 ساعة.
  2. تحضير حشوات لوحة الاستزراع المشترك لشركة Transwell
    1. حدد لوحة 24 بئرا تحتوي على إدخالات مع مرشحات 0.4 ميكرومتر.
      ملاحظة: مرشح 0.4 ميكرومتر هو خيار قياسي في دراسات نقل الأدوية. لا ينصح بأحجام المرشح 3 ميكرومتر و 8 ميكرومتر لمنع أي خسائر محتملة للخلايا المدمجة بالكولاجين.
    2. باستخدام ماصة ، قم بترطيب مرشحات Transwell (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم إدخالات الغشاء) ب 500 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن من Hanks (HBSS) أسفل وفوق ملحق المرشح.
    3. أغلق اللوحة متعددة الآبار وضعها في حاضنة لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
      ملاحظة: يمكن أن تبقى حشوات الغشاء في HBSS لمدة تصل إلى 24 ساعة. يمكن إجراء هذه العملية في اليوم السابق لبناء النموذج. من المهم أن تكون حشوات الغشاء رطبة تماما وأن المرشح لا يجف ، لأن هذا قد يجعل من الصعب على العينة الالتصاق بشكل صحيح.
    4. أخرج الألواح من الحاضنة بعد 2 ساعة (أو 24 ساعة). قم بشفط HBSS بعناية من أعلى وأسفل حشوات الغشاء باستخدام ماصة واتركها حتى تجف لمدة 10 دقائق.
  3. إعداد البروبريا الصفيحة الكولاجين الخالية من الخلايا لنظام نموذج الأمعاء 3D الأساسي (DAY 1)
    1. تحضير محلول كولاجين خال من الخلايا في أنبوب معقم سعة 50 مل على ثلج يحتوي على المكونات التالية في DMEM: مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 200 مللي متر L-glutamine ، 1٪ بيكربونات الصوديوم و 1.35 مجم / مل من النوع الأول من ذيل الفئران الكولاجين.
      ملاحظة: يجب حفظ كل هذه المكونات على الثلج وإضافتها إلى DMEM بأطراف ماصة مبردة. يجب إضافة كولاجين ذيل الفئران من النوع 1 أخيرا لأن هذا يتبلمر مع زيادة درجة الحرارة ودرجة الحموضة. تعتمد كمية محلول الكولاجين الخالي من الخلايا المحضرة على عدد المكافئات المعوية المطلوبة.
    2. أضف 250 ميكرولتر من المحلول إلى كل ملحق لوحة (فوق مرشح الغشاء) لعدد المكافئات المعوية المختارة وضع الغطاء فوق اللوحة متعددة الآبار. اترك محلول الكولاجين يتبلمر في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت غطاء التدفق الصفحي.
      ملاحظة: بصرف النظر عن الانتقال إلى مرحلة أكثر صلابة ، فإن البلمرة واضحة أيضا من تغير اللون من الأصفر إلى الوردي. عادة ما تكتمل البلمرة في غضون 10-15 دقيقة.
  4. تحضير وعد الخلايا وإضافة الخلايا الليفية (L929) والخلايا الوحيدة (U937) إلى النظام النموذجي (DAY 1)
    1. قم بإزالة ثقافة الخلية L929 (الخطوة 1.1.1) من الحاضنة. باستخدام مضخة تفريغ ، قم باستنشاق الوسط ، واستبدله ب 5 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات المعقم (PBS ؛ بدون Ca و Mg) ، وشطف الخلايا.
    2. نضح برنامج تلفزيوني باستخدام مضخة تفريغ. أضف 2 مل من محلول التربسين-EDTA المحضر مسبقا (0.05٪ تربسين و 0.02٪ EDTA في PBS) وضعه في حاضنة لمدة 3-5 دقائق.
    3. استخدم مجهرا مقلوبا (على سبيل المثال ، Eclipse Ts2 ، نيكون) لتحديد ما إذا كانت الخلايا تنفصل عن سطح الالتصاق. في حالة حدوث ذلك ، أضف على الفور 2 مل من DMEM (تحتوي على 10٪ FBS) لمنع تفاعل التربسين وشطف الخلايا.
    4. انقل محلول الخلية إلى أنبوب معقم سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 645 × جم لمدة 5 دقائق. باستخدام مضخة فراغ ، نضح طاف طاف.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. تم اختبار تأثير DMEM على خلايا L929 و U937 ولم يظهر أن لها آثارا ضارة على النمو.
    5. أضف 1 مل من DMEM إلى الحبيبات وقم بتعليق الخلايا.
      ملاحظة: يجب تعليق الخلايا بشكل متجانس في المحلول.
    6. قم بإزالة 20 ميكرولتر من الخلايا في DMEM وأضف 20 ميكرولتر من محلول Trypan الأزرق. قم بإزالة 20 ميكرولتر من المزيج وتقييم كثافة الخلية مجهريا باستخدام غرفة عد الخلايا.
    7. إزالة ثقافة الخلية U937 (الخطوة 1.1.3) من الحاضنة. جهاز طرد مركزي محلول الخلية عند 645 × جم لمدة 5 دقائق. باستخدام مضخة تفريغ ، نضح الطافي لتجنب إزعاج الحبيبات.
    8. تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI. كما هو الحال مع خلايا L929 ، تأكد من تعليق الخلايا بشكل متجانس في المحلول.
    9. وبالمثل ، حدد كثافة الخلية كما هو موضح في الخطوة 1.4.6.
    10. تحضير محلول الكولاجين كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
      ملاحظة: يجب أن تأخذ كمية المحلول المراد تصنيعها في الاعتبار 450 ميكرولتر لكل ملحق (أو طراز).
    11. قم بإعداد محلول DMEM لاحتواء عدد 50000 خلية L929 و 15000 خلية U937 ، على التوالي ، بحجم 50 ميكرولتر لكل نموذج مكافئ معوي يتم بناؤه.
      ملاحظة: عدد الخلايا عامل حاسم. قد يؤدي وجود عدد كبير جدا من كلا النوعين من الخلايا إلى صفيحة مصفحة ممتلئة بشكل مفرط بالخلايا التي لن تكون منظمة بشكل كاف. سيؤدي عدد أقل من الخلايا الليفية (التي تولد الكولاجين) إلى صفيحة بريوريا أقل إحكاما ، في حين أن عددا قليلا جدا من الخلايا الوحيدة من شأنه أن يعيق الاستجابة المناعية للمنبهات. شريطة أن يكون العدد الصحيح للخلايا موجودا داخل كل حصة 50 ميكرولتر - يمكن تحضير حجم إجمالي قدره 600 ميكرولتر لإدراج المرشح ال 12 الموجود في كل 24 لوحة بئر.
    12. أضف كل 50 ميكرولتر من الأليكويت التي تحتوي على الخلايا إلى 450 ميكرولتر من محلول الكولاجين في الخطوة 1.4.10. تخلط جيدا.
    13. قم بتراكب الصفيحة البروبريا الكولاجين الخالية من الخلايا المطلية مسبقا مع 500 ميكرولتر من محلول الخلايا المحتوي على الكولاجين لكل نموذج.
      ملاحظة: من المهم إضافة وحدات التخزين بسرعة إلى كل ملحق ، وعلى هذا النحو ، ينصح بالحد من عدد نماذج الغشاء المخاطي المعوي المعاد بناؤها إلى 12 أو أقل في المرة الواحدة.
    14. أغلق اللوحة وضعها في حاضنة لمدة 2 ساعة للسماح للحل بالضبط.
  5. تحضير خلايا Caco-2 الظهارية وعدها وإضافة خلايا Caco-2 الظهارية إلى النموذج المعوي (اليوم 1)
    1. قم بإزالة ثقافة الخلايا Caco-2 (الخطوة 1.1.2) من الحاضنة. كرر الإجراءات من الخطوة 1.4.1 باستخدام 10 مل من PBS للشطف الأولي. ثم أضف 5 مل من محلول التربسين-EDTA المحضر مسبقا (0.05٪ تربسين و 0.02٪ EDTA في برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم) وضعه في حاضنة لمدة 5-8 دقائق.
    2. كرر الخطوات 1.4.3 (ولكن باستخدام 5 مل من DMEM لمنع تفاعل التربسين) حتى 1.4.6 لحساب الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا.
    3. تحضير محلول DMEM لاحتواء عدد خلايا Caco-2 150,000 في 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: عدد الخلايا المستخدمة نقطة حرجة. يمكن أن يؤدي تجاوز 150000 خلية إلى طبقة ظهارية مدمجة غير منظمة ، بينما مع وجود القليل جدا (أقل من 100000) ، تكافح الخلايا من أجل النمو ولا تغطي الغشاء القاعدي بشكل كاف مما يخلق طبقة ظهارية معوية متقطعة. تأكد من تعليق الخلايا بشكل فعال. يمكن استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر لضمان التوزيع المتجانس. بالنظر إلى أنه يمكن بناء 12 نموذجا في أي وقت ، يمكن تحضير محلول خلية 600 ميكرولتر.
    4. بعد ساعتين المطلوبتين في الخطوة 1.4.14 ، أضف 50 ميكرولتر من خلايا Caco-2 المعلقة في DMEM إلى منتصف كل غشاء قاعدي. أغلق غطاء اللوحة متعددة الآبار.
    5. احتضان تحت غطاء التدفق الصفحي المعقم لمدة 10 دقائق. ثم نقل إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة.
    6. قم بإعداد محلول DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ قلم / بكتيريا .
      ملاحظة: قم بإعداد حل كاف لاستخدام وحدة تخزين 1 مل لكل طراز.
    7. أضف 500 ميكرولتر من الوسط فوق النموذج المعاد بناؤه و 500 ميكرولتر أسفل الفلتر.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند إضافة الوسط فوق الفلتر لتجنب فصل الخلايا أو إجهادها.
    8. أغلق نظام الألواح متعددة الآبار وضعه في الحاضنة.
  6. إعداد / تشكيل النموذج واستخدامه (اليوم 2 إلى اليوم 6)
    1. اليوم 2: قم بإزالة المحلول بعناية من أعلى النموذج المعاد بناؤه وأسفل المرشح باستخدام ماصة. استبدل ب 500 ميكرولتر من DMEM الطازج (10٪ FBS و 1٪ قلم / بكتيريا العقدية) أعلى وأسفل الفلتر ، على التوالي.
    2. اليوم 3: كرر ما ورد أعلاه في الخطوة 1.6.1.
    3. اليوم 4: كرر ما ورد أعلاه في الخطوة 1.6.1.
      ملاحظة: هذا النموذج المعوي هو نموذج خلوي ثابت. لذلك ، لصالح إطلاق الجزيئات ونمو الخلايا وتحفيزها ، من المهم جدا تغيير الوسط كل يوم.
    4. اليوم 5: في هذه المرحلة ، يتم تشكيل / تطوير النموذج بالكامل. استخدم هذه النماذج لمزيد من الدراسات.
      ملاحظة: أفضل وقت لاستخدام النموذج هو 5 أيام. على الرغم من أنه يمكن الاحتفاظ بالخلايا في حاضنة لفترات أطول ، فكلما مر الوقت ، زاد احتمال نمو الخلايا الظهارية بطريقة غير منضبطة ، مما يؤدي إلى طبقة غير منظمة ومضغوطة يصعب استخدامها.
    5. في 5 أيام ، احتضان النماذج إما سامة (الغلوتين أو عديد السكاريد الدهني [LPS]) أو المكونات المفيدة (البوليفينول) ذات الأهمية. أضف هذه إلى الجزء العلوي من النموذج المعاد بناؤه المعلق في وسط DMEM.
      ملاحظة: يجب حساب التركيز المناسب لكل مكون من مكونات الاهتمام وتعليقه في وسط DMEM. يجب إعداد عناصر التحكم غير المعالجة التي تحتوي على وسيط DMEM فقط للمقارنة مع النماذج التجريبية.
    6. احتضان نماذج التحكم والتجريبية لمدة 24 ساعة في حاضنة.
    7. يوم 6: قم بإزالة الوسيط أعلى وأسفل الفلتر باستخدام ماصة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسط لاختبارات مقايسة الممتز المناعي المرتبطة بالإنزيم (ELISA) اللاحقة لقياس إطلاق السيتوكينات الالتهابية. لهذا الغرض ، يجب إضافة الوسيط إلى قوارير معقمة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

2. تضمين البارافين لنماذج الغشاء المخاطي المعوي المعاد بناؤها

ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء بأكمله تحت غطاء دخان كيميائي. يجب الالتزام الصارم بكل خطوة وتخصيص الوقت المعني. لهذا السبب ، من المهم إعداد جميع الكواشف في وقت مبكر.

  1. اضبط آلة البارافين على 58 درجة مئوية بحيث تكون جاهزة للاستخدام.
  2. انقل إدخالات الغشاء لتنظيف الآبار باستخدام كماشة في لوحة معقمة من 24 بئرا.
  3. أضف 500 ميكرولتر من الفورمالين المخزن بنسبة 37٪ في PBS فوق المرشح و 1 مل تحت الفلتر. أغلق الغطاء واتركه تحت غطاء الدخان الكيميائي لمدة 2 ساعة في RT.
    ملاحظة: كبديل ، يمكن استخدام الفورمالين المخزن بنسبة 4٪ في RT لمدة 1 ساعة.
  4. قم بإزالة الفورمالين وإضافة محلول HBSS أعلى وأسفل الفلتر. ثم قم بإزالة HBSS.
  5. افصل الصفيحة المخصوصة عن إدخال الغشاء.
    ملاحظة: عادة ما تنفصل خلايا الغشاء المخاطي المعوي بسهولة شديدة عن إدخال الغشاء لأنها غير متصلة بالأخير. بالإضافة إلى ذلك ، تظل مقصورتا العينة (القمية والقاعدية) متصلة ، مع الاحتفاظ بهيكل 3D. إذا لم يتم فصلها بسهولة لسبب ما ، فسيكون من المهم استخدام شفرة مشرط معقمة يمكن التخلص منها لإزالة الغشاء المخاطي المعوي من إدخال الغشاء. يمكن قطع إدخال الغشاء ، وبالتالي فصله عن البلاستيك. احرص على عدم لمس العينة بالمشرط. الدافع وراء إزالة إدراج الغشاء من الخلايا المدمجة في الكولاجين هو أن هذا المرشح قد ينفصل في مراحل التثبيت اللاحقة أو تضمين البارافين ، مما يجعل المقارنات بين نماذج الغشاء المخاطي في الأمعاء غير متناسبة. علاوة على ذلك ، فإن إدخالات الغشاء داخل القسم المدمج لها تناسق مختلف يمكن أن يتداخل مع التقسيم.
  6. ضع الكئوس الزجاجية سعة 100 مل تحت غطاء الدخان الكيميائي ، كل منها مكتوب بشكل صحيح ليشمل نظاما نموذجيا واحدا للغشاء المخاطي المعوي أعيد بناؤه قيد الفحص. أضف 25 مل من 35٪ ETOH إلى كل دورق ثم أضف الغشاء المخاطي المعوي المعاد بناؤه. احتضان لمدة 10 دقائق.
  7. استبدل الإيثانول بنسبة 35٪ ب 25 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق.
  8. استبدل الإيثانول بنسبة 50٪ ب 25 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق.
  9. استبدل الإيثانول بنسبة 70٪ ب 25 مل من الإيثانول بنسبة 80٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق.
  10. استبدل الإيثانول بنسبة 80٪ ب 25 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق.
  11. استبدل 95٪ إيثانول ب 25 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق.
  12. استبدل الإيثانول بنسبة 100٪ بتغيير 25 مل آخر من الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق.
  13. ضع كئوس زجاجية سعة 100 مل تحت غطاء الدخان ، كل منها مكتوب بشكل صحيح ليشمل نموذجا واحدا قيد الفحص. أضف 50 مل من الزيلين أو عامل مسح نسيجي لمدة 10-20 دقيقة.
    ملاحظة: يوصى باستخدام Histo-Clear (عامل المقاصة النسيجية) لأن العامل يعزز وضوح وحيوية البقع الحمضية. يمكن أن يختلف وقت التطهير من عينة الغشاء المخاطي المعوي المعاد بناؤها إلى أخرى ويجب التحقق من الشفافية في المظهر كل 2-3 دقائق.
  14. بمجرد أن تصبح العينات شفافة ، ضعها في حامل كاسيت الأنسجة المعدنية الذي يتم غمره بعد ذلك في البارافين السائل داخل الجهاز المسخن لمدة 45 دقيقة.
  15. قم بتغيير البارافين واترك العينات داخل الجهاز المسخن لمدة 45 دقيقة أخرى.
  16. قم بإزالة حامل علبة المناديل الورقية وضعه على الثلج ليبرد. عندما تنفصل كتل العينة المبردة عن الحامل المعدني ، يمكن تبريدها بشكل أكبر في درجة حرارة الغرفة.
  17. تخزين الكتل في RT.
    ملاحظة: إذا كان الهدف هو تحضير الأقسام على الفور ، فيمكن وضع الكتل عند 4 درجات مئوية بحيث يتم تبريدها جيدا عند استخدامها.
  18. قطع أقسام 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
  19. ضع المقاطع المقطوعة على شرائح وجففها في فرن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  20. الشرائح جاهزة للاستخدام. قم بتخزينها في RT حتى إجراء تلطيخ الأنسجة H& E أو تلطيخ التفاعل النسيجي الكيميائي المناعي (نوع المستضد والجسم المضاد).
    1. بالنسبة للتلطيخ المناعي الكيميائي النسيجي ، حدد الأجسام المضادة ذات الأهمية (إما لدراسة بروتينات TJ مثل occludin أو لتنشيط الخلايا الوحيدة والهجرة والتمايز) واكتشاف التعبير (عن طريق التلطيخ) باستخدام مجموعات تجارية.
    2. وبالمثل ، قم بقياس المخاط باستخدام مجموعة تلطيخ Alcian Blue و Acid Schiff الدورية (PAS).
    3. حدد كمية بروتينات TJ الملطخة ذات الأهمية ، مثل الإطباق ، عن طريق حساب النسبة المئوية للبكسلات الموجبة على الصور المجهرية المأخوذة من المجهر.
    4. تحليل صور الخلايا باستخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال ، برنامج ImageJ2 [Wayne Rasband، الإصدار 2.9.0/1.53t]).
      1. لإجراء تحليل وحدات البكسل ، قم بمعالجة الصور الرقمية إلى 300 بكسل / بوصة وقم بتحويلها إلى 8 بت. بعد ذلك ، قم بمعالجة الصور الثنائية بواسطة المكون الإضافي Color Deconvolution لتحليل تلطيخ البروتين محل الاهتمام ، في هذه الحالة ، التلوين الأحمر الدائم للإطباق.
      2. احفظ الصورة المحددة كمشاجرة وأخضعها لإجراء "تنظيف" لإزالة القطع الأثرية باستخدام محرر رسومات (على سبيل المثال ، Adobe PhotoshopCC [الإصدار 20.0.4]).
      3. بعد ذلك ، قم بقياس جميع مجالات الاهتمام باستخدام تطبيق تحليل جسيمات ImageJ2 ، وقم بالإبلاغ عن البيانات كعدد وحدات البكسل.
        ملاحظة: يجب إجراء كل تجربة في ثلاث نسخ مع تحليل ثلاثة حقول نسخ داخلية لكل نسخة متماثلة. لقياس المخاط ، يمكن تطبيق نفس مبدأ قياس وحدات البكسل على الصور الملتقطة للموسين المحايد الملون باللون الأرجواني والمخاط الحمضي المصبوغ باللون الأزرق الفاتح ، على التوالي.

النتائج

الجانب الأول المهم هو تحديد مدى قبول الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D للأغراض التجريبية. يتم تنفيذ ذلك مع البقع الأكثر استخداما على نطاق واسع في مختبرات الأنسجة وعلم الأنسجة ، وهي الهيماتوكسيلين (بقع المواد النووية اللون الأزرق الأرجواني الغامق) ويوزين (بقع المواد السيتوبلازمية متفاوتة ظ...

Discussion

يجمع نظام نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي المعاد بناؤه المعروض هنا (الشكل 6) بين التعقيد الفسيولوجي (ثقافات خلايا ثلاثية الأبعاد أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تحتوي على طبقة أحادية Caco-2 مع دعم الصفيحة المخصوصة الغنية ب ECM التي تحتوي على الخلايا الليفية والوحيدات) مع ا...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

شكرا لمؤسسة أمبرتو فيرونيسي على الزمالة التي تدعم عمل الباحث.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcian Blue/PAS kitScyTek Laboratories, Inc.APS-1, APS-2kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solutionThermo Fisher15250061cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cellsATCCATCC HTB-37cell line
Citro-Histo-Clear Limonene basedHistoline laboratoriesR0050CITROreagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GIBCO11965092cell colture reagent
Embedding CenterHistoline laboratoriesTEC2900instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCOA5256701cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)GIBCO12350039cell colture reagent
Human Midkine ELISA kitCohesion BiosciencesCEK1270kit ELISA
Inverted microscopeEclipse Ts2, NikonMFA34100microscope
L929 mouse fibroblastsATCCATCC ®-CCL1cell line
LC3-IINovus BiologicalsNB910-40752SuperNovusPackantibody
L-GlutamineGIBCOA2916801cell colture reagent
OccludinNovus BiologicalsNBP1-87402antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °CHistoline laboratoriesR0040 PLUSinstrument for paraffin embedding
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070063cell colture reagent
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070063cell colture reagent
rat tail collagen type IGIBCOA1048301cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)GIBCO21870076cell colture reagent
Sodium pyruvateGIBCO11360070cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell CounterThermo FisherTF-CACC2FLcell counting instrument
TranswellCostar Corning3413plastic for cell colture
TrypsinGIBCO15090046cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell lineATCCATCC CRL-1593.2cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain KitScyTek Laboratories, Inc.AMH080kit for immunohistochemical staining

References

  1. Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
  3. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
  4. Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
  5. Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
  6. Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
  7. Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
  8. Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
  11. Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , (2023).
  12. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
  13. Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
  14. Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
  15. Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
  16. Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
  17. Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
  18. Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
  19. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 199 Caco 2 U937 L929 H E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved