نظام نموذج الأمعاء الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) مع مكون مناعي

Summary

هنا نصف بناء نظام نموذج خط الخلايا المعوية الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) وبروتوكول تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي لمكافئات الأمعاء الثابتة. يسمح تلطيخ البروتينات المختارة بتحليل معلمات بصرية متعددة من تجربة واحدة للاستخدام المحتمل في دراسات فحص الأدوية قبل السريرية.

Abstract

كانت هناك زيادة في استخدام النماذج المعوية في الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المعوية الالتهابية ، للفحص الدوائي للمواد المفيدة المحتملة ، ولدراسات السمية على المكونات الغذائية التي يحتمل أن تكون ضارة. ومما له صلة بالموضوع أن هناك طلبا حاليا على تطوير نماذج في المختبر تعتمد على الخلايا لتحل محل النماذج الحيوانية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لنموذج مكافئ معوي ثلاثي الأبعاد (3D) أساسي "الأنسجة السليمة" باستخدام خطوط الخلايا مع فائدة مزدوجة تتمثل في توفير كل من البساطة التجريبية (نظام موحد وقابل للتكرار بسهولة) والتعقيد الفسيولوجي (الخلايا المعوية Caco-2 مع مكون مناعي داعم من الخلايا الوحيدة U937 والخلايا الليفية L929). يتضمن البروتوكول أيضا تضمين البارافين للتقييم المجهري الضوئي للمكافئات المعوية الثابتة ، وبالتالي توفير ميزة تحليل المعلمات البصرية المتعددة من تجربة واحدة. يتم استخدام مقاطع ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) تظهر الخلايا العمودية Caco-2 التي تشكل طبقة أحادية ضيقة ومنتظمة في معالجات التحكم للتحقق من فعالية النموذج كنظام تجريبي. باستخدام الغلوتين كمكون غذائي مؤيد للالتهابات ، تشمل المعلمات التي تم تحليلها من الأقسام انخفاض سمك الطبقة الأحادية ، بالإضافة إلى الاضطراب والانفصال عن المصفوفة الأساسية (H&E) ، وانخفاض تعبير بروتين الوصلة الضيقة كما هو موضح من تلطيخ الأوكلودين (قابل للقياس الكمي إحصائيا) ، والتنشيط المناعي لخلايا U937 المهاجرة كما يتضح من مجموعة التمايز 14 (CD14) والتمايز المرتبط ب CD11b إلى البلاعم. كما هو موضح باستخدام عديد السكاريد الدهني لمحاكاة التهاب الأمعاء ، فإن المعلمات الإضافية التي يمكن قياسها هي زيادة تلطيخ المخاط وتعبير السيتوكين (مثل midkine) الذي يمكن استخلاصه من الوسط قبل التثبيت. يمكن التوصية بنموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي ثلاثي الأبعاد (3D) والأقسام الثابتة لدراسات الحالة الالتهابية وسلامة الحاجز مع إمكانية تحليل معلمات بصرية متعددة قابلة للقياس الكمي.

Introduction

يشكل الحاجز الظهاري المعوي ، وهو بطانة داخلية بسمك خلية واحدة تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية ، أول حاجز دفاعي مادي أو واجهة بين الخارج والوسط الداخلي للجسم ^1,2. تشكل الخلايا المعوية من النوع العمودي النوع الأكثر وفرة من الخلايا الظهارية. هذه هي المسؤولة عن الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري من خلال التفاعلات بين العديد من مكونات الحاجز ، بما في ذلك التقاطعات الضيقة (TJs) ، وتلعب دورا مهما في تشديد الحاجز ^1,3. يتكون هيكل TJ من بروتينات البلاك داخل الخلايا ، مثل انسداد المنطقة (ZO) والسينغولين ، بالتعاون مع البروتينات عبر الغشاء ، بما في ذلك الإ....

Protocol

1. إعداد نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D المعاد بناؤه

ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء بأكمله في غطاء تدفق رقائقي معقم. تشير جميع الخطوات في الإجراء الذي يتضمن استخدام حاضنة الخلايا إلى أن الثقافات يتم تحضينها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO₂ (ما لم ينص على خلاف ذلك في البروتوكول_).

1. التحضير المسبق لخطوط الخلايا المستخدمة في نظام نموذج الأمعاء
   1. خلايا الخلايا الليفية للفأر L929 بتركيز 5 × 10⁵ في 5 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 2 mM L-glutamine ، 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (Pen-Strep) في قارورة F25 واستزراعه في حاضنة قبل 4 أيام من ب....

النتائج

الجانب الأول المهم هو تحديد مدى قبول الغشاء المخاطي المعوي الأساسي 3D للأغراض التجريبية. يتم تنفيذ ذلك مع البقع الأكثر استخداما على نطاق واسع في مختبرات الأنسجة وعلم الأنسجة ، وهي الهيماتوكسيلين (بقع المواد النووية اللون الأزرق الأرجواني الغامق) ويوزين (بقع المواد السيتوبلازمية متفاوتة ظ.......

Discussion

يجمع نظام نموذج الغشاء المخاطي المعوي الأساسي المعاد بناؤه المعروض هنا (الشكل 6) بين التعقيد الفسيولوجي (ثقافات خلايا ثلاثية الأبعاد أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تحتوي على طبقة أحادية Caco-2 مع دعم الصفيحة المخصوصة الغنية ب ECM التي تحتوي على الخلايا الليفية والوحيدات) مع ا.......