Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Özet

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Özet

İnflamatuar bağırsak hastalıklarının patofizyolojisini incelemek, potansiyel olarak yararlı maddelerin farmakolojik taraması ve potansiyel olarak zararlı gıda bileşenleri üzerinde toksisite çalışmaları yapmak için in vivo ve in vitro bağırsak modellerinin kullanımında bir artış olmuştur. Konuyla ilgili olarak, hayvan modellerinin yerini almak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik mevcut bir talep vardır. Burada, hücre hatlarını kullanan temel, "sağlıklı doku" üç boyutlu (3D) bağırsak eşdeğeri modeli için bir protokol, hem deneysel basitlik (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem) hem de fizyolojik karmaşıklık (U937 monositleri ve L929 fibroblastlarının destekleyici bir bağışıklık bileşenine sahip Caco-2 enterositleri) sağlamanın ikili yararı ile sunulmaktadır. Protokol ayrıca, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi de içerir, böylece tek bir deneyden birden fazla görsel parametreyi analiz etme avantajı sağlar. Hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmış kesitler, Caco-2 kolumnar hücrelerinin kontrol tedavilerinde sıkı ve düzenli bir tek tabaka oluşturduğunu gösteren deneysel bir sistem olarak modelin etkinliğini doğrulamak için kullanılmıştır. Glüteni pro-inflamatuar bir gıda bileşeni olarak kullanarak, bölümlerden analiz edilen parametreler arasında azaltılmış tek tabaka kalınlığının yanı sıra altta yatan matristen (H & E) bozulma ve ayrılma, oklüdin boyamadan (istatistiksel olarak ölçülebilir) gösterildiği gibi sıkı bağlantı protein ekspresyonunun azalması ve farklılaşma 14 (CD14) boyama kümesinden ve CD11b ile ilişkili makrofajlara farklılaşmadan kanıtlandığı gibi göç eden U937 hücrelerinin bağışıklık aktivasyonu. Bağırsak iltihabını simüle etmek için lipopolisakkarit kullanılarak gösterildiği gibi, ölçülebilen ek parametreler, fiksasyondan önce ortamdan ekstrakte edilebilen artmış mukus boyaması ve sitokin ekspresyonudur (midkin gibi). Temel üç boyutlu (3D) bağırsak mukoza modeli ve sabit kesitler, birden fazla görsel ölçülebilir parametreyi analiz etme imkanı ile inflamatuar durum ve bariyer bütünlüğü çalışmaları için önerilebilir.

Giriş

Farklı tipte epitel hücreleri içeren tek hücre kalınlığında bir iç astar olan bağırsak epitel bariyeri, vücudun dış ve iç ortamı arasındaki ilk fiziksel savunma bariyerini veya arayüzünü oluşturur ^1,2. Kolumnar tip enterositler, epitel hücrelerinin en bol bulunan tipini oluşturur. Bunlar, bariyer sıkılaştırmada önemli bir rol oynayan sıkı bağlantılar (TJ'ler) dahil olmak üzere çeşitli bariyer bileşenleri arasındaki etkileşimler yoluyla epitelyal bariyer bütünlüğünün korunmasından sorumludur ^1,3. TJ yapısı, komşu hücreleri sıkıca birbirine bağlayan fermuar benzeri bir yapı oluşturan oklüdinler, kladinler ve eklemsel adezyon molekülleri (JAM'ler) dahil olmak üzere transmembran proteinlerle işbirliği yapan zonula okludens (ZO) ve singulin gibi hücre içi plak proteinlerinden oluşur ^3,4. Transmembran proteinler, küçük bileşiklerin pasif paraselüler difüzyonunu düzenler ve toksik büyük molekülleri dışlar.

Potansiyel olarak toksik gıda bileşikleri ve gıda kontaminantları, epitel geçirgenliğini bozan, bağışıklık hücrelerini aktive eden ve kronik bağırsak dokusu iltihabına neden olan inflamatuar sitokin üretimini uyarır ^5,6,7. Buna karşılık, çeşitli antioksidan ve antienflamatuar fitokimyasalların, inflamatuar sitokin ekspresyonunu azalttığı ve TJ protein ekspresyonunun ve montajının^restorasyonu yoluyla bağırsak TJ bariyer bütünlüğünü arttırdığı bildirilmiştir ^4,6,8. Bu nedenle, hem yararlı hem de zararlı bileşikler tarafından epitelyal bariyer bütünlüğünün düzenlenmesi, farmasötik tarama ve toksisite çalışmaları için bağırsak bariyerini taklit etmeyi amaçlayan hem in vivo hem de in vitro modellerin kullanımında bir artış görmüştür. Bu, deneysel modellerde simüle edilebilen bağırsak bağırsak hastalıkları (IBD), nekrotizan enterokolit ve kanserin patofizyolojisini anlamaya yönelik artan ilgi göz önüne alındığında özellikle önemlidir ^8,9,10.

Hayvan testlerinde "3R" hedefine ulaşmak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik bir talep olmuştur. Bunlar, hayvanların kullanımına alternatif alternatifler, kullanılan hayvan sayısının azaltılması ve sıkıntıyı hafifleten yöntemlerin benimsenmesinde iyileştirmeyi içerir ^11,12,13. Ayrıca, insan ve fare modelleri (kemirgenler en yaygın kullanılan türlerdir) arasındaki altta yatan moleküler, hücresel ve fizyolojik mekanizmalar ayırt edicidir ve fare modellerinin insan tepkilerinde öngörücü olarak etkinliği konusunda tartışmalara yol açar^12,13. İn vitro insan hücre hattı modellerinin sayısız avantajı arasında hedef kısıtlamalı deney, doğrudan gözlem ve sürekli analiz^{yer alır 13}.

İki boyutlu (2D) kültürlerdeki tek hücre tipi tek katmanlar güçlü modeller olarak hizmet etmiştir. Bununla birlikte, bunlar insan dokularının fizyolojik karmaşıklığını tam olarak yeniden üretemez ^8,13,14. Sonuç olarak, yeni nesil risk değerlendirme araç kutuları olarak hem sağlıklı hem de hastalıklı bağırsak dokularının fizyolojik karmaşıklığını özetlemek için sürekli artan iyileştirmelerle 3D kültür sistemleri geliştirilmektedir^13,14. Bu modeller, hem hücre hatlarını hem de organoidleri (hem sağlıklı hem de hastalıklı dokulardan elde edilen) kullanan çeşitli hücre hatları, organoid kültürleri ve mikroakışkan cihazlara (çip üzerinde bağırsak) sahip 3D Transwell iskelelerini içerir8,13,14.

Bu çalışmada sunulan 3 boyutlu "sağlıklı doku" bağırsak eşdeğeri protokolü, fizyolojik karmaşıklık ve deneysel basitlik arasında bir denge kurmaya dayanmaktadır¹³. Model, üç hücre hattından (destekleyici bir bağışıklık bileşeni [U937 monositleri ve L929 fibroblastları] ile enterositler [altın standart kolon adenokarsinomu Caco-2 hattı]) oluşan bir 3D Transwell iskelesini temsil eder, standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir bir sistem oluşturur. Protokol, sabit bağırsak eşdeğerleri kullanılarak epitelyal bariyer bütünlüğünün hafif mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi içerir. Mevcut yaklaşımın avantajı, gömülü dokuların çok sayıda bölümünün tek bir deneyden birden fazla parametre için boyanabilmesidir.

Protokol

1. Temel 3D rekonstrükte edilmiş bağırsak mukoza modelinin hazırlanması

NOT: Tüm prosedür steril bir laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Hücre inkübatörünün kullanımını içeren prosedürdeki tüm adımlar, kültürlerin %5_CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de inkübe edildiğini gösterir (protokolde aksi belirtilmedikçe_).

1. Bağırsak model sisteminde kullanılan hücre hatlarının önceden hazırlanması
   1. L929 fare fibroblast hücrelerini, 2 mM L-glutamin,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 5 mL'sinde 5 x 10⁵ konsantrasyonunda tohumlayın ve bir F25 şişesinde ve bağırsak modellerinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, bir pipet kullanarak ortamı çıkarın. Daha sonra taze ortam (5 mL) ekleyin ve hücreleri 48 saat daha inkübe edin.
      NOT: Hücreler kullanılmadan önce %80 birleşik olmalıdır.
   2. Bir F75 hücre şişesinde 10 mL DMEM ortamında (% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile) Caco-2 hücrelerini (konsantrasyon 2 x 10⁶) tohumlayın ve bağırsak mukoza modelinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi değiştirin ve 48 saat boyunca% 80'lik bir birleşmeye kadar inkübe edin.
      NOT: Hücreler aktif bir proliferatif fazda olmalıdır: ne çok seyrek ne de çok birleşik. % 50-60 izdiham önerilir. Hücreler, modeli yapmadan bir gün önce ekilmemelidir, çünkü bu, hücrelerin çoğalma kapasitesini yavaşlatabilir ve bu da yeniden yapılandırılmış 3D modelde mükemmel bir şekilde kök salmayacaktır.
   3. Model kurulumundan 2 gün önce bir F75 hücre şişesinde süspansiyon halinde (1 x 10⁶ konsantrasyon) 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamına (2 mM L-glutamin,% 1 sodyum piruvat,% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep içeren) süspansiyon (1 x 10 6 konsantrasyonu) içinde büyüyen U937 hücrelerini ekleyin ve 48 saat boyunca bir inkübatöre koyun.
2. Transwell ko-kültür plakası eklerinin hazırlanması
   1. 0,4 μm filtreli kesici uçlar içeren 24 oyuklu bir plaka seçin.
      NOT: 0,4 μm filtre, ilaç taşıma çalışmalarında standart bir seçimdir. 3 μm ve 8 μm filtre boyutları, kollajen gömülü hücrelerin olası kayıplarını önlemek için önerilmez.
   2. Bir pipet kullanarak, Transwell filtrelerini (bundan böyle membran ekleri olarak anılacaktır) filtre ekinin altında ve üstünde 500 μL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nemlendirin.
   3. Çok kuyulu plakayı kapatın ve en az 2 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Membran ekleri HBSS'de 24 saate kadar kalabilir. Bu işlem, modeli oluşturmadan bir gün önce gerçekleştirilebilir. Membran eklerinin tamamen hidratlanması ve filtrenin kurumaması önemlidir, çünkü bu, numunenin düzgün bir şekilde yapışmasını zorlaştırabilir.
   4. Plakaları 2 saat (veya 24 saat) sonra inkübatörden çıkarın. HBSS'yi bir pipet kullanarak membran eklerinin üstünden ve altından dikkatlice aspire edin ve 10 dakika kurumaya bırakın.
3. Temel 3D bağırsak model sisteminin hücresiz kollajen lamina propria'sının hazırlanması (GÜN 1)
   1. DMEM'de aşağıdaki bileşenleri içeren buz üzerinde 50 mL'lik steril bir tüpte hücresiz bir kollajen solüsyonu hazırlayın:% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 200 mM L-glutamin,% 1 sodyum bikarbonat ve 1.35 mg / mL Tip 1 sıçan kuyruğu kollajeni.
      NOT: Tüm bu bileşenler buz üzerinde tutulmalı ve soğutulmuş pipet uçlarıyla DMEM'e eklenmelidir. Tip 1 sıçan kuyruğu kolajeni, artan sıcaklık ve pH ile polimerize olduğu için en son eklenmelidir. Hazırlanan hücresiz kollajen çözeltisinin miktarı, gerekli bağırsak eşdeğerlerinin sayısına bağlı olacaktır.
   2. Seçilen bağırsak eşdeğeri sayısı için her bir plaka ekine (membran filtrenin üstüne) 250 μL çözelti ekleyin ve kapağı çok kuyulu plakanın üzerine yerleştirin. Kollajen çözeltisinin laminer akış başlığı altında oda sıcaklığında (RT) polimerize olmasına izin verin.
      NOT: Daha katı bir faza geçişin yanı sıra, polimerizasyon, rengin sarıdan pembeye değişmesinden de belirgindir. Polimerizasyon genellikle 10-15 dakika içinde tamamlanır.
4. Fibroblast (L929) ve monosit (U937) hücrelerinin hazırlanması, hücre sayımı ve model sisteme eklenmesi (1. GÜN)
   1. L929 hücre kültürünü (adım 1.1.1) inkübatörden çıkarın. Bir vakum pompası kullanarak, ortamı aspire edin, 5 mL steril fosfat tampon salin (PBS; Ca ve Mg olmadan) ile değiştirin ve hücreleri durulayın.
   2. PBS'yi bir vakum pompası kullanarak aspire edin. 2 mL önceden hazırlanmış bir tripsin-EDTA çözeltisi (PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin ve 3-5 dakika boyunca bir inkübatöre koyun.
   3. Hücrelerin yapışma yüzeyinden ayrılıp ayrılmadığını belirlemek için ters çevrilmiş bir mikroskop (örneğin, bir Eclipse Ts2, Nikon) kullanın. Bu meydana gelirse, tripsin reaksiyonunu bloke etmek ve hücreleri durulamak için hemen 2 mL DMEM (% 10 FBS içerir) ekleyin.
   4. Hücre çözeltisini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 645 x g'da santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak süpernatanı aspire edin.
      NOT: Peletin bozulmamasına özen gösterilmelidir. DMEM'in etkisi L929 ve U937 hücreleri üzerinde test edildi ve büyüme üzerinde olumsuz etkileri olduğu gösterilmedi.
   5. Peletlere 1 mL DMEM ekleyin ve hücreleri askıya alın.
      NOT: Hücreler çözelti içinde homojen bir şekilde süspanse edilmelidir.
   6. DMEM'deki hücrelerin 20 μL'sini çıkarın ve 20 μL Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Karışımın 20 μL'sini çıkarın ve bir hücre sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu mikroskobik olarak değerlendirin.
   7. U937 hücre kültürünü (adım 1.1.3) inkübatörden çıkarın. Hücre çözeltisini 645 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak, peleti rahatsız etmemek için süpernatanı aspire edin.
   8. Hücreleri 1 mL RPM'de askıya alın. L929 hücrelerinde olduğu gibi, hücrelerin çözelti içinde homojen bir şekilde süspanse edildiğinden emin olun.
   9. Benzer şekilde, adım 1.4.6'da bildirildiği gibi hücre yoğunluğunu belirleyin.
   10. Adım 1.3.1'de açıklandığı gibi bir kolajen çözeltisi hazırlayın.
       NOT: Yapılacak çözelti miktarı, her bir kesici uç (veya model) için 450 μL dikkate alınmalıdır.
   11. Oluşturulacak her bağırsak eşdeğer modeli için 50 μL'lik bir hacimde sırasıyla 50.000 L929 hücresi ve 15.000 U937 hücresi içerecek şekilde bir DMEM çözeltisi hazırlayın.
       NOT: Hücre sayısı kritik bir faktördür. Her iki hücre tipinin de çok fazla olması, yeterince organize edilemeyen hücrelerle aşırı dolu bir lamina propria ile sonuçlanacaktır. Düşük sayıda fibroblast (kollajen üreten) daha az kompakt bir lamina propria ile sonuçlanırken, çok az monosit uyaranlara karşı bağışıklık tepkisini engelleyecektir. Her 50 μL'lik alikot içinde doğru hücre sayısının bulunması koşuluyla - her 24 kuyucuklu plakada bulunan 12 filtre eki için toplam 600 μL'lik bir hacim hazırlanabilir.
   12. Hücreleri içeren her 50 μL'lik alikotu adım 1.4.10'da 450 μL kollajen çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın.
   13. Her model için önceden kaplanmış hücresiz kollajen lamina propria'yı 500 μL kollajen içeren hücre çözeltisi ile kaplayın.
       NOT: Hacimleri her bir eke hızlı bir şekilde eklemek önemlidir ve bu nedenle, yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası modellerinin sayısını bir seferde 12 veya daha az ile sınırlamanız önerilir.
   14. Plakayı kapatın ve çözeltinin sertleşmesini sağlamak için 2 saat boyunca bir inkübatöre koyun.
5. Hazırlanması, hücre sayımı ve epitelyal Caco-2 hücrelerinin bağırsak modeline eklenmesi (GÜN 1)
   1. Caco-2 hücre kültürünü (adım 1.1.2) inkübatörden çıkarın. Ön durulama için 10 mL PBS kullanarak adım 1.4.1'deki prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra 5 mL önceden hazırlanmış bir tripsin-EDTA çözeltisi (Ca ve Mg içermeyen PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin ve 5-8 dakika boyunca bir inkübatöre koyun.
   2. Hücre sayma odasını kullanarak hücreleri saymak için 1.4.3 adımlarını (ancak tripsin reaksiyonunu bloke etmek için 5 mL DMEM kullanarak) 1.4.6'ya kadar tekrarlayın.
   3. 50 μL'de 150.000 Caco-2 hücresi içeren bir DMEM çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Kullanılan hücre sayısı kritik bir noktadır. 150.000 hücreyi aşmak, kompakt bir düzensiz epitel tabakasına neden olabilirken, çok az (100.000'den az) ile hücreler büyümek için mücadele eder ve süreksiz bir bağırsak epitel tabakası oluşturan bazal zarı yeterince örtmez. Hücrelerin etkili bir şekilde askıya alındığından emin olun. Homojen dağılımı sağlamak için 200 μL'lik bir pipetin ucu kullanılabilir. Herhangi bir zamanda 12 modelin yapılabileceği göz önüne alındığında, 600 μL'lik bir hücre çözeltisi hazırlanabilir.
   4. Adım 1.4.14'te gereken 2 saatten sonra, her bir bazal membranın ortasına DMEM'de süspanse edilmiş 50 μL Caco-2 hücresi ekleyin. Çok kuyulu plakanın kapağını kapatın.
   5. Steril laminer akış başlığının altında 10 dakika inkübe edin. Ardından 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.
   6. %10 FBS ve %1 Pen/Strep içeren bir DMEM solüsyonu hazırlayın.
      NOT: Model başına 1 mL hacim kullanmak için yeterli bir çözelti hazırlayın.
   7. Yeniden yapılandırılmış modelin üzerine 500 μL ortam ve filtrenin altına 500 μL ekleyin.
      NOT: Hücrelerin ayrılmasını veya gerilmesini önlemek için ortamı filtrenin üzerine eklerken dikkatli olunmalıdır.
   8. Çok kuyulu plaka sistemini kapatın ve inkübatöre yerleştirin.
6. Model hazırlama/oluşturma ve kullanımı (2. GÜN - 6. GÜN)
   1. 2. GÜN: Çözeltiyi bir pipet kullanarak hem yeniden yapılandırılmış modelin üstünden hem de filtrenin altından dikkatlice çıkarın. Filtrenin üstünde ve altında sırasıyla taze 500 μL taze DMEM (%10 FBS ve %1 Pen/Strep) ile değiştirin.
   2. 3. GÜN: Adım 1.6.1'de yukarıdaki gibi tekrarlayın.
   3. 4. GÜN: Adım 1.6.1'de yukarıdaki gibi tekrarlayın.
      NOT: Bu bağırsak modeli statik bir hücresel modeldir; Bu nedenle, moleküllerin salınmasını ve hücrelerin büyümesini ve uyarılmasını desteklemek için, ortamın her gün değiştirilmesi çok önemlidir.
   4. 5. GÜN: Bu noktada, model tamamen oluşturulur/geliştirilir. Daha ileri çalışmalar için bu modelleri kullanın.
      NOT: Modeli kullanmak için en uygun zaman 5 gündür. Hücreler bir inkübatörde daha uzun süre tutulabilse de, ne kadar çok zaman geçerse, epitel hücrelerinin kontrolsüz bir şekilde büyüme olasılığı o kadar artar ve bu da kullanımı zor, düzensiz ve kompakt bir tabaka ile sonuçlanır.
   5. 5 günde, modelleri toksik (glüten veya lipopolisakkarit [LPS]) veya ilgilenilen faydalı bileşenlerle (polifenoller) inkübe edin. Bunları, DMEM ortamında asılı duran yeniden yapılandırılmış modelin üst kısmına ekleyin.
      NOT: İlgilenilen her bir bileşenin uygun konsantrasyonu hesaplanmalı ve bir DMEM ortamında askıya alınmalıdır. Deneysel modellerle karşılaştırmak için sadece DMEM ortamı içeren işlenmemiş kontroller ayarlanmalıdır.
   6. Kontrol ve deneysel modelleri bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.
   7. 6. GÜN: Filtrenin üstündeki ve altındaki ortamı bir pipetle çıkarın.
      NOT: Ortam, inflamatuar sitokinlerin salınımını ölçmek için müteakip enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tipi testler için saklanabilir. Bu amaçla, ortam steril şişelere eklenmeli ve daha fazla analiz için -20 ° C'de saklanmalıdır.

2. Yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası modellerinin parafin gömülmesi

NOT: Tüm prosedür kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir. Her adıma ve ilgili zaman tahsisine kesinlikle uyulmalıdır. Bu nedenle, tüm reaktiflerin önceden hazırlanması önemlidir.

1. Parafin makinesini kullanıma hazır hale getirmek için 58 °C'ye ayarlayın.
2. Membran eklerini steril 24 oyuklu bir plakada pense kullanarak kuyucukları temizlemek için aktarın.
3. Filtrenin üzerine PBS'ye 500 μL %37 tamponlu formalin ve filtrenin altına 1 mL ekleyin. Kapağı kapatın ve RT'de 2 saat kimyasal çeker ocak altında bırakın.
   NOT: Alternatif olarak, RT'de 1 saat boyunca% 4 tamponlu formalin kullanılabilir.
4. Formalini çıkarın ve filtrenin hem üstüne hem de altına HBSS solüsyonu ekleyin. Ardından HBSS'yi çıkarın.
5. Lamina propria'yı membran ekinden ayırın.
   NOT: Bağırsak mukozasının hücreleri, ikincisine bağlı olmadıkları için genellikle zar ekinden çok kolay ayrılır. Ek olarak, iki numune bölmesi (apikal ve bazal) 3D yapıyı koruyarak bağlı kalır. Herhangi bir nedenle kolayca ayrılmazlarsa, bağırsak mukozasını zar ekinden çıkarmak için steril tek kullanımlık bir neşter bıçağı kullanmak önemli olacaktır. Membran eki kesilebilir, böylece plastikten ayrılabilir. Numuneye asla neşterle dokunmamaya dikkat edin. Membran ekinin kollajen gömülü hücrelerden çıkarılmasının nedeni, bu filtrenin sonraki fiksasyon veya parafin gömme aşamalarında ayrılabilmesi ve bağırsak mukoza modelleri arasındaki karşılaştırmaları orantısız hale getirebilmesidir. Ayrıca, gömülü bölüm içindeki membran ekleri, kesit almaya müdahale edebilecek farklı bir kıvama sahiptir.
6. 100 mL'lik beherleri, her biri incelenmekte olan yeniden yapılandırılmış bir bağırsak mukozası model sistemini içerecek şekilde doğru şekilde etiketlenmiş kimyasal çeker ocakların altına yerleştirin. Her behere 25 mL% 35 ETOH ekleyin ve ardından yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozasını ekleyin. 10 dakika inkübe edin.
7. %35 etanolü 25 mL %50 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
8. %50 etanolü 25 mL %70 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
9. %70 etanolü 25 mL %80 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
10. %80 etanolü 25 mL %95 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
11. %95 etanolü 25 mL %100 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
12. %100 etanolü 25 mL'lik başka bir %100 etanol değişimiyle değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.
13. Çeker ocakların altına, her biri incelenmekte olan bir modeli içerecek şekilde doğru şekilde etiketlenmiş 100 mL'lik beherler yerleştirin. 10-20 dakika boyunca 50 mL ksilen veya histolojik bir temizleme maddesi ekleyin.
    NOT: Ajan asidofilik lekelerin berraklığını ve canlılığını arttırdığı için Histo-Clear (histolojik temizleme ajanı) önerilir. Temizleme süresi, yeniden yapılandırılmış bir bağırsak mukozası örneğinden diğerine değişebilir ve her 2-3 dakikada bir görünümde şeffaflık açısından kontrol edilmelidir.
14. Numuneler şeffaf olur olmaz, bunları metal bir doku kaset tutucusuna yerleştirin ve daha sonra ısıtılmış makinenin içinde 45 dakika boyunca sıvı parafine daldırın.
15. Parafini değiştirin ve numuneleri ısıtılmış makinenin içinde 45 dakika daha bırakın.
16. Kağıt mendil kaset tutucusunu çıkarın ve soğuması için buzun üzerine koyun. Soğutulmuş numune blokları metal tutucudan ayrıldığında, bunlar oda sıcaklığında daha fazla soğutulabilir.
17. Blokları RT'de saklayın.
    NOT: Amaç bölümleri hemen hazırlamaksa, bloklar 4 ° C'ye yerleştirilebilir, böylece kullanıldıklarında iyi soğutulurlar.
18. Bir mikrotom kullanarak 4 μm'lik kesitler kesin.
19. Kesilen bölümleri slaytlara yerleştirin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de bir fırında kurutun.
20. Slaytlar kullanıma hazırdır. H & E histolojik boyama veya immün-histokimyasal reaksiyon boyama (antijen-antikor tipi) gerçekleştirene kadar bunları RT'de saklayın.
    1. İmmün-histokimyasal boyama için, ilgilenilen antikorları seçin (oklüdin gibi TJ proteinlerinin incelenmesi veya monosit aktivasyonu, göçü ve farklılaşması için) ve ticari kitleri kullanarak ekspresyonu (boyama yoluyla) tespit edin.
    2. Benzer şekilde, Alcian mavisi ve periyodik asit-Schiff (PAS) boyama kitini kullanarak mukusu ölçün.
    3. Mikroskoptan alınan mikrograflardaki pozitif piksellerin yüzdesini hesaplayarak okkludin gibi ilgilenilen boyanmış TJ proteinlerini ölçün.
    4. Görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ2 yazılımı [Wayne Rasband, sürüm 2.9.0/1.53t]) kullanarak hücrelerin resimlerini analiz edin.
       1. Piksellerin analizini gerçekleştirmek için dijital görüntüleri 300 piksel/inç olarak işleyin ve 8 bite dönüştürün. Ardından, ilgilenilen proteinin boyanmasını, bu durumda oklüdinin kalıcı kırmızı boyamasını analiz etmek için ikili görüntüleri Color Deconvolution eklentisi ile işleyin.
       2. Seçilen resmi tiff olarak kaydedin ve bir grafik düzenleyiciyle (örneğin, Adobe PhotoshopCC [sürüm 20.0.4]) yapaylıkları ortadan kaldırmak için bir "temizleme" prosedürüne tabi tutun.
       3. Daha sonra, ImageJ2'nin Parçacığını Analiz Et uygulaması ile tüm ilgi alanlarını ölçün ve verileri piksel sayısı olarak raporlayın.
          NOT: Her deneme, her çoğaltma için analiz edilen üç dahili çoğaltma alanıyla üç kopya halinde gerçekleştirilmelidir. Mukusun miktarını belirlemek için, pikselleri ölçmenin aynı prensibi, sırasıyla mor-macenta lekeli nötr müsinler ve parlak mavi lekeli asidik mukusun alınan görüntülerine uygulanabilir.

Sonuçlar

İlk önemli husus, temel 3D bağırsak eşdeğer mukozasının deneysel amaçlar için kabul edilebilirliğini belirlemektir. Bu, histoloji ve histopatoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan boya olan hematoksilen (nükleer materyali koyu mavi-mor renkte boyar) ve eozin (sitoplazmik materyali pembenin değişen tonlarında boyar) ile gerçekleştirilir. H&E boyaması ilk olarak, deneysel tedavilerle aynı koşullar ve zaman dilimi altında kültürlenen, işlenmemiş bir kontrol üzerinde gerçekleştirilir. H?...

Tartışmalar

Burada sunulan temel yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası model sistemi (Şekil 6), fizyolojik karmaşıklığı (fibroblastlar ve monositler içeren ECM açısından zengin lamina propria desteğine sahip bir Caco-2 tek tabakası içeren fizyolojik olarak daha ilgili 3D hücre kültürleri) deneysel basitlikle (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem üretmek için ticari insan hücre hatlarını kullanarak) ^{birleştirir13}. Bu nedenle,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue/PAS kit	ScyTek Laboratories, Inc.	APS-1, APS-2	kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solution	Thermo Fisher	15250061	cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells	ATCC	ATCC HTB-37	cell line
Citro-Histo-Clear Limonene based	Histoline laboratories	R0050CITRO	reagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GIBCO	11965092	cell colture reagent
Embedding Center	Histoline laboratories	TEC2900	instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO	A5256701	cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	12350039	cell colture reagent
Human Midkine ELISA kit	Cohesion Biosciences	CEK1270	kit ELISA
Inverted microscope	Eclipse Ts2, Nikon	MFA34100	microscope
L929 mouse fibroblasts	ATCC	ATCC ®-CCL1	cell line
LC3-II	Novus Biologicals	NB910-40752SuperNovusPack	antibody
L-Glutamine	GIBCO	A2916801	cell colture reagent
Occludin	Novus Biologicals	NBP1-87402	antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C	Histoline laboratories	R0040 PLUS	instrument for paraffin embedding
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070063	cell colture reagent
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070063	cell colture reagent
rat tail collagen type I	GIBCO	A1048301	cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)	GIBCO	21870076	cell colture reagent
Sodium pyruvate	GIBCO	11360070	cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher	TF-CACC2FL	cell counting instrument
Transwell	Costar Corning	3413	plastic for cell colture
Trypsin	GIBCO	15090046	cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line	ATCC	ATCC CRL-1593.2	cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit	ScyTek Laboratories, Inc.	AMH080	kit for immunohistochemical staining