מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

Summary

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

Abstract

חלה עלייה בשימוש במודלים של מעיים in vivo ו - in vitro לחקר הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים דלקתיות, לסינון פרמקולוגי של חומרים שעשויים להיות מועילים, ולמחקרי רעילות על רכיבי מזון שעלולים להיות מזיקים. רלוונטיות, קיים כיום ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה שיחליפו מודלים של בעלי חיים. כאן, פרוטוקול למודל תלת-ממדי תלת-ממדי (3D) תלת-ממדי בסיסי של "רקמה בריאה" באמצעות קווי תאים מוצג עם היתרון הכפול של מתן פשטות ניסיונית (מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות) ומורכבות פיזיולוגית (אנטרוציט Caco-2 עם מרכיב חיסוני תומך של מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929). הפרוטוקול כולל גם הטבעה של פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות, ובכך מספק את היתרון של ניתוח פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד. חלקים מוכתמים של Hematoxylin ו-eosin (H&E) המראים את תאי העמוד Caco-2 היוצרים שכבה חד-שכבתית הדוקה וסדירה בטיפולי בקרה משמשים לאימות יעילות המודל כמערכת ניסויית. שימוש בגלוטן כמרכיב מזון פרו-דלקתי, פרמטרים שנותחו מקטעים כוללים ירידה בעובי החד-שכבתי, כמו גם הפרעה וניתוק מהמטריצה הבסיסית (H&E), ירידה בביטוי חלבון בצומת הדוק כפי שמוצג מצביעת אוקלודין (ניתן לכימות סטטיסטי), והפעלת מערכת החיסון של תאי U937 נודדים כפי שניתן לראות מצביעת צביעת צביעת התמיינות 14 (CD14) והתמיינות הקשורה ל- CD11b למקרופאגים. כפי שניתן לראות על ידי שימוש בליפופוליסכריד כדי לדמות דלקת מעיים, פרמטרים נוספים שניתן למדוד הם צביעת ריר מוגברת וביטוי ציטוקינים (כגון מידקין) שניתן להפיק מהמדיום לפני הקיבוע. ניתן להמליץ על מודל תלת מימדי (3D) בסיסי של רירית המעי ומקטעים קבועים למחקרי סטטוס דלקתי ותקינות מחסום עם אפשרות לנתח פרמטרים חזותיים מרובים הניתנים לכימות חזותי.

Introduction

מחסום האפיתל של המעי, רירית פנימית בעובי תא אחד המכילה סוגים שונים של תאי אפיתל, מהווה את מחסום ההגנה הפיזי הראשון או ממשק בין הסביבה החיצונית והפנימית של הגוף ^1,2. אנטרוציטים מסוג עמודה מהווים את הסוג הנפוץ ביותר של תאי אפיתל. אלה אחראים לשמירה על שלמות מחסום האפיתל באמצעות אינטראקציות בין מספר רכיבי מחסום, כולל צמתים הדוקים (TJs), הממלאים תפקיד משמעותי בהידוק מחסום ^1,3. מבנה TJ מורכב מחלבוני פלאק תוך-תאיים, כגון zonula occludens (ZO) ו-cingulin, המשתפים פעולה עם חלבונים טרנסממברנליים, כולל אוקלודינים, קלאודינים ומולקולות היצמדות צמתיות (JAMs) היוצרות....

Protocol

1. הכנת מודל רירית המעי המשוחזר התלת-ממדי הבסיסי

הערה: ההליך כולו חייב להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית. כל השלבים בהליך השימוש באינקובטור התא מסמנים כי תרביות מודגרות ב -37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂ (אלא אם צוין אחרת בפרוטוקול)_.

1. הכנה מוקדמת של קווי התאים המשמשים במערכת מודל המעי
   1. זרע L929 תאי פיברובלסט עכבר בריכוז של 5 x 10⁵ ב 5 מ"ל של מדיום עיט שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 2 mM L-גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי (FBS), ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep) בבקבוק F25 ותרבית אותו באינקובטור 4 ימים לפני בניית דגמי המעי. לאחר 48 שעות, להסיר את המדיום באמצעות פיפטה. לאחר מכן ....

תוצאות

ההיבט החשוב הראשון הוא לקבוע את הקבילות של רירית המעי הבסיסית 3D שווה ערך למטרות ניסיוני. זה מבוצע עם הכתם הנפוץ ביותר במעבדות היסטולוגיה והיסטופתולוגיה, כלומר hematoxylin (כתמים חומר גרעיני צבע כחול סגול עמוק) ו eosin (כתמים חומר ציטופלזמי גוונים משתנים של ורוד). צביעת H&E מבוצעת תחילה בביקורת לא מט?.......

Discussion

מערכת המודל הבסיסית המשוחזרת של רירית המעי המוצגת כאן (איור 6) משלבת מורכבות פיזיולוגית (תרביות תאים תלת-ממדיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית המכילות שכבה חד-שכבתית Caco-2 עם תמיכה עשירה ב-ECM lamina propria המכילה פיברובלסטים ומונוציטים) עם פשטות ניסיונית (שימוש בקווי תאים אנושי?.......