JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

Abstract

חלה עלייה בשימוש במודלים של מעיים in vivo ו - in vitro לחקר הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים דלקתיות, לסינון פרמקולוגי של חומרים שעשויים להיות מועילים, ולמחקרי רעילות על רכיבי מזון שעלולים להיות מזיקים. רלוונטיות, קיים כיום ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה שיחליפו מודלים של בעלי חיים. כאן, פרוטוקול למודל תלת-ממדי תלת-ממדי (3D) תלת-ממדי בסיסי של "רקמה בריאה" באמצעות קווי תאים מוצג עם היתרון הכפול של מתן פשטות ניסיונית (מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות) ומורכבות פיזיולוגית (אנטרוציט Caco-2 עם מרכיב חיסוני תומך של מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929). הפרוטוקול כולל גם הטבעה של פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות, ובכך מספק את היתרון של ניתוח פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד. חלקים מוכתמים של Hematoxylin ו-eosin (H&E) המראים את תאי העמוד Caco-2 היוצרים שכבה חד-שכבתית הדוקה וסדירה בטיפולי בקרה משמשים לאימות יעילות המודל כמערכת ניסויית. שימוש בגלוטן כמרכיב מזון פרו-דלקתי, פרמטרים שנותחו מקטעים כוללים ירידה בעובי החד-שכבתי, כמו גם הפרעה וניתוק מהמטריצה הבסיסית (H&E), ירידה בביטוי חלבון בצומת הדוק כפי שמוצג מצביעת אוקלודין (ניתן לכימות סטטיסטי), והפעלת מערכת החיסון של תאי U937 נודדים כפי שניתן לראות מצביעת צביעת צביעת התמיינות 14 (CD14) והתמיינות הקשורה ל- CD11b למקרופאגים. כפי שניתן לראות על ידי שימוש בליפופוליסכריד כדי לדמות דלקת מעיים, פרמטרים נוספים שניתן למדוד הם צביעת ריר מוגברת וביטוי ציטוקינים (כגון מידקין) שניתן להפיק מהמדיום לפני הקיבוע. ניתן להמליץ על מודל תלת מימדי (3D) בסיסי של רירית המעי ומקטעים קבועים למחקרי סטטוס דלקתי ותקינות מחסום עם אפשרות לנתח פרמטרים חזותיים מרובים הניתנים לכימות חזותי.

Introduction

מחסום האפיתל של המעי, רירית פנימית בעובי תא אחד המכילה סוגים שונים של תאי אפיתל, מהווה את מחסום ההגנה הפיזי הראשון או ממשק בין הסביבה החיצונית והפנימית של הגוף 1,2. אנטרוציטים מסוג עמודה מהווים את הסוג הנפוץ ביותר של תאי אפיתל. אלה אחראים לשמירה על שלמות מחסום האפיתל באמצעות אינטראקציות בין מספר רכיבי מחסום, כולל צמתים הדוקים (TJs), הממלאים תפקיד משמעותי בהידוק מחסום 1,3. מבנה TJ מורכב מחלבוני פלאק תוך-תאיים, כגון zonula occludens (ZO) ו-cingulin, המשתפים פעולה עם חלבונים טרנסממברנליים, כולל אוקלודינים, קלאודינים ומולקולות היצמדות צמתיות (JAMs) היוצרות מבנה דמוי רוכסן המקשר בחוזקה בין התאים השכנים 3,4. החלבונים הטרנסממברנליים מווסתים את הדיפוזיה הפארא-תאית הפסיבית של תרכובות קטנות ואינם כוללים מולקולות גדולות רעילות.

תרכובות מזון רעילות פוטנציאליות ומזהמי מזון מעוררים ייצור ציטוקינים דלקתיים המשבשים את חדירות האפיתל, מפעילים את תאי החיסון וגורמים לדלקת כרונית ברקמת המעי 5,6,7. לעומת זאת, פיטוכימיקלים נוגדי חמצון ואנטי דלקתיים שונים דווחו כמפחיתים את ביטוי הציטוקינים הדלקתיים ומשפרים את שלמות מחסום TJ במעי באמצעות שיקום ביטוי והרכבה של חלבון TJ 4,6,8. לפיכך, הרגולציה של שלמות מחסום האפיתל על ידי תרכובות מועילות ומזיקות כאחד ראתה עלייה בשימוש הן במודלים in vivo והן במודלים במבחנה שמטרתם לחקות את מחסום המעי לבדיקות סקר תרופתיות ומחקרי רעילות. זה רלוונטי במיוחד לאור העניין הגובר בהבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים (IBD), אנטרוקוליטיס נמקית וסרטן, שניתן לדמות במודלים ניסיוניים 8,9,10.

יש ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה על מנת להשיג את המטרה של "3Rs" בניסויים בבעלי חיים. אלה כוללים חלופות חלופיות לשימוש בבעלי חיים, צמצום מספר בעלי החיים בשימוש, ועידון באימוץ שיטות להקלת מצוקה 11,12,13. יתר על כן, המנגנונים המולקולריים, התאיים והפיזיולוגיים הבסיסיים בין מודלים אנושיים ומורין (מכרסמים הם המין הנפוץ ביותר) הם ייחודיים, מה שמוביל למחלוקת לגבי יעילותם של המודלים המורין כמנבאים בתגובות אנושיות12,13. יתרונות רבים של מודלים של קו תאים אנושי במבחנה כוללים ניסויים מוגבלי מטרה, תצפית ישירה וניתוח רציף13.

חד-שכבות מסוג תא בודד בתרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימשו כמודלים רבי עוצמה. עם זאת, אלה אינם יכולים לשחזר במדויק את המורכבות הפיזיולוגית של רקמות אנושיות 8,13,14. כתוצאה מכך, מערכות תרבית תלת-ממדיות מפותחות עם שיפורים הולכים וגדלים כדי לשחזר את המורכבות הפיזיולוגית של רקמות מעיים בריאות וחולות כאחד כארגזי כלים להערכת סיכונים של הדור הבא13,14. מודלים אלה כוללים פיגומים תלת-ממדיים של Transwell עם קווי תאים מגוונים, תרביות אורגנואידים והתקנים מיקרופלואידים (מעי-על-שבב) המשתמשים הן בקווי תאים והן באורגנואידים (שמקורם הן ברקמות בריאות והן ברקמות חולות)8,13,14.

פרוטוקול המקבילה התלת-ממדי של "רקמה בריאה" במעי שהוצג במחקר הנוכחי התבסס על מציאת איזון בין מורכבות פיזיולוגית לבין פשטות ניסויית13. המודל מייצג פיגום טרנסוול תלת-ממדי, המורכב משלושה קווי תאים (אנטרוציטים [קו אדנוקרצינומה Caco-2 של המעי הגס הסטנדרטי בזהב] עם מרכיב חיסוני תומך [מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929]), המהווים מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות הישימה לסינון ראשוני של מולקולות תזונתיות בעלות עניין על שלמות מחסום האפיתל של המעי ותגובה חיסונית. הפרוטוקול כולל הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של שלמות מחסום האפיתל באמצעות מקבילות מעי קבועות. היתרון של הגישה הנוכחית הוא שניתן לגרום לחלקים רבים של הרקמות המשובצות להכתים עבור פרמטרים מרובים מניסוי יחיד.

Protocol

1. הכנת מודל רירית המעי המשוחזר התלת-ממדי הבסיסי

הערה: ההליך כולו חייב להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית. כל השלבים בהליך השימוש באינקובטור התא מסמנים כי תרביות מודגרות ב -37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה 5% CO2 (אלא אם צוין אחרת בפרוטוקול).

  1. הכנה מוקדמת של קווי התאים המשמשים במערכת מודל המעי
    1. זרע L929 תאי פיברובלסט עכבר בריכוז של 5 x 105 ב 5 מ"ל של מדיום עיט שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 2 mM L-גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי (FBS), ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep) בבקבוק F25 ותרבית אותו באינקובטור 4 ימים לפני בניית דגמי המעי. לאחר 48 שעות, להסיר את המדיום באמצעות פיפטה. לאחר מכן מוסיפים מדיום טרי (5 מ"ל), ודגרים על התאים עוד יותר במשך 48 שעות.
      הערה: התאים חייבים להיות 80% נפוחים לפני השימוש.
    2. זרע תאי Caco-2 (ריכוז של 2 x 106) ב 10 מ"ל של מדיום DMEM (עם 10% FBS ו 1% Pen-Strep) בבקבוק תא F75 ותרבית אותו באינקובטור 4 ימים לפני בניית מודל רירית המעי. לאחר 48 שעות, שנה את התווך כמתואר בשלב 1.1.1 והמשך לדגור במשך 48 שעות למפגש של 80%.
      הערה: התאים חייבים להיות בשלב התרבות פעיל: לא דליל מדי ולא זורם מדי. מומלץ מפגש של 50-60%. אסור לזרוע את התאים יום לפני יצירת המודל, כי זה יכול להאט את יכולת ההתרבות של התאים, מה שלא ישתרש באופן מושלם במודל התלת-ממדי המשוחזר.
    3. הוסף תאי U937 הגדלים בתרחיף (ריכוז של 1 x 106) ל -10 מ"ל של מדיום Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (המכיל 2 mM L-גלוטמין, 1% נתרן פירובט, 10% FBS ו- 1% Pen-Strep) בבקבוק תא F75 יומיים לפני הגדרת הדגם, ומניחים באינקובטור למשך 48 שעות.
  2. הכנת תוספות צלחת התרבית המשותפת של Transwell
    1. בחר צלחת 24 באר המכילה תוספות עם מסננים 0.4 מיקרומטר.
      הערה: מסנן 0.4 מיקרומטר הוא בחירה סטנדרטית במחקרי הובלת תרופות. גודלי המסננים של 3 מיקרומטר ו-8 מיקרומטר אינם מומלצים כדי למנוע אובדן אפשרי של התאים המשובצים בקולגן.
    2. באמצעות פיפטה, לחות את מסנני Transwell (המכונים מעתה תוספות ממברנה) עם 500 μL של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) מתחת ומעל תוספת המסנן.
    3. סגור את צלחת רב באר ומניחים אותו באינקובטור במשך מינימום של 2 שעות.
      הערה: תוספות הממברנה יכולות להישאר ב-HBSS למשך עד 24 שעות. פעולה זו יכולה להתבצע יום לפני בניית המודל. חשוב שתוספות הממברנה יהיו לחות לחלוטין ושהמסנן לא יתייבש, מכיוון שזה עלול להקשות על הדגימה להיצמד כראוי.
    4. הסר את הצלחות מן האינקובטור לאחר 2 שעות (או 24 שעות). בזהירות לשאוף את HBSS מעל ומתחת תוספות הממברנה באמצעות פיפטה ולהשאיר אותו להתייבש במשך 10 דקות.
  3. הכנת קולגן למינה פרופריה ללא תאים של מערכת מודל המעי התלת-ממדית הבסיסית (יום 1)
    1. הכינו תמיסת קולגן ללא תאים בצינור סטרילי של 50 מ"ל על קרח המכיל את הרכיבים הבאים ב-DMEM: 10% סרום בקר עוברי (FBS), 200 מילימטר L-גלוטמין, 1% סודיום ביקרבונט וקולגן זנב חולדה מסוג 1.35 מ"ג/מ"ל מסוג 1.
      הערה: יש לשמור את כל הרכיבים הללו על קרח ולהוסיף אותם ל-DMEM עם קצות פיפטה מקוררים. יש להוסיף את קולגן זנב החולדה מסוג 1 אחרון מכיוון שהוא מתפלמר עם עליית הטמפרטורה וה- pH. כמות תמיסת הקולגן נטולת התאים המוכנה תלויה במספר המקבילות הנדרשות במעי.
    2. הוסף 250 μL של התמיסה לכל תוספת צלחת (מעל מסנן הממברנה) עבור מספר מקבילות המעי שנבחרו והנח את המכסה מעל הצלחת מרובת הבארות. אפשרו לתמיסת הקולגן להתפלמר בטמפרטורת החדר (RT) מתחת למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.
      הערה: מלבד המעבר לשלב מוצק יותר, פילמור ניכר גם בשינוי צבע מצהוב לוורוד. פילמור מסתיים בדרך כלל תוך 10-15 דקות.
  4. הכנה, ספירת תאים והוספה של תאי פיברובלסט (L929) ומונוציטים (U937) למערכת המודל (יום 1)
    1. הסר את תרבית התאים L929 (שלב 1.1.1) מהאינקובטור. באמצעות משאבת ואקום, שאפו את המדיום, החליפו אותו במי מלח סטריליים של חיץ פוספט סטרילי (PBS; ללא Ca ו-Mg), ושטפו את התאים.
    2. שאפו את PBS באמצעות משאבת ואקום. מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA מוכנה מראש (0.05% טריפסין ו-0.02% EDTA ב-PBS) ומניחים באינקובטור למשך 3-5 דקות.
    3. השתמש במיקרוסקופ הפוך (לדוגמה, Eclipse Ts2, Nikon) כדי לקבוע אם התאים מתנתקים משטח ההדבקה. אם זה קורה, מיד להוסיף 2 מ"ל של DMEM (המכיל 10% FBS) כדי לחסום את תגובת טריפסין ולשטוף את התאים.
    4. העבר את תמיסת התא לצינור סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות 645 x גרם למשך 5 דקות. באמצעות משאבת ואקום, שאפו את הסופרנטנט.
      הערה: יש להקפיד לא להפריע לכדור. ההשפעה של DMEM נבדקה על תאי L929 ו-U937 ולא הוכחה כבעלת השפעות שליליות על הצמיחה.
    5. הוסף 1 מ"ל DMEM לגלולה והשהה את התאים.
      הערה: התאים חייבים להיות מוחיים הומוגנית בתמיסה.
    6. הסר 20 μL של התאים ב- DMEM והוסף 20 μL של תמיסה כחולה טריפאן. הסר 20 μL מהתערובת והערך את צפיפות התאים באופן מיקרוסקופי באמצעות תא ספירת תאים.
    7. הסר את תרבית התאים U937 (שלב 1.1.3) מהאינקובטור. צנטריפוגה את תמיסת התא ב 645 x גרם במשך 5 דקות. באמצעות משאבת ואקום, שאפו את הסופרנאטנט להימנע מהפרעה לכדורית.
    8. להשעות את התאים ב 1 מ"ל של RPMI. בדומה לתאי L929, יש לוודא שהתאים מרחפים בצורה הומוגנית בתמיסה.
    9. באופן דומה, קבע את צפיפות התאים כפי שדווחה בשלב 1.4.6.
    10. הכינו תמיסת קולגן כמתואר בשלב 1.3.1.
      הערה: כמות התמיסה שיש לייצר חייבת לקחת בחשבון 450 μL עבור כל תוספת (או דגם).
    11. הכינו תמיסה של DMEM שתכיל ספירה של 50,000 תאי L929 ו-15,000 תאי U937, בהתאמה, בנפח של 50 μL עבור כל מודל שווה ערך למעי שייבנה.
      הערה: מספר התאים הוא גורם קריטי. יותר מדי משני סוגי התאים יגרמו ללמינה פרופריה מלאה יתר על המידה בתאים שלא יהיו מאורגנים כראוי. מספר נחות של פיברובלסטים (המייצרים קולגן) יגרום ללמינה פרופריה פחות קומפקטית, בעוד שמעט מדי מונוציטים יעכבו את התגובה החיסונית לגירויים. בתנאי הספירה הנכונה של תאים קיים בתוך כל 50 μL aliquot - נפח כולל של 600 μL יכול להיות מוכן עבור 12 תוספות מסנן נוכח בכל 24 צלחת היטב.
    12. הוסף כל 50 μL aliquot המכיל את התאים ל 450 μL של תמיסת קולגן בשלב 1.4.10. מערבבים היטב.
    13. שכבו את הקולגן למינה פרופריה ללא תאים המצופה מראש ב-500 μL של תמיסת התאים המכילה קולגן עבור כל דגם.
      הערה: חשוב להוסיף במהירות את הנפחים לכל תוספת, ולכן מומלץ להגביל את מספר דגמי רירית המעי המשוחזרים ל-12 או פחות בכל פעם.
    14. סוגרים את הצלחת ומניחים אותה באינקובטור למשך שעתיים כדי לאפשר לתמיסה להתמקם.
  5. הכנה, ספירת תאים והוספת תאי Caco-2 אפיתל למודל המעי (יום 1)
    1. הסר את תרבית התאים Caco-2 (שלב 1.1.2) מהאינקובטור. חזור על ההליכים משלב 1.4.1 באמצעות 10 מ"ל PBS לשטיפה ראשונית. לאחר מכן הוסף 5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA מוכנה מראש (0.05% טריפסין ו- 0.02% EDTA ב- PBS ללא Ca ו- Mg) ומניחים באינקובטור למשך 5-8 דקות.
    2. חזור על שלבים 1.4.3 (אך באמצעות 5 מ"ל DMEM כדי לחסום את תגובת הטריפסין) עד 1.4.6 כדי לספור את התאים באמצעות תא ספירת התאים.
    3. הכינו תמיסה של DMEM שתכיל ספירה של 150,000 תאי Caco-2 ב-50 μL.
      הערה: מספר התאים שנעשה בהם שימוש הוא נקודה קריטית. יותר מ-150,000 תאים עלול לגרום לשכבת אפיתל קומפקטית ולא מאורגנת, בעוד שעם מעט מדי (פחות מ-100,000), התאים מתקשים לגדול ואינם מכסים כראוי את קרום המרתף ויוצרים שכבת אפיתל מעיים לא רציפה. ודא שהתאים מושעים ביעילות. ניתן להשתמש בקצה פיפטה של 200 μL כדי להבטיח התפלגות הומוגנית. בהתחשב בכך שניתן לבנות 12 דגמים בכל זמן נתון, ניתן להכין תמיסה של 600 μL תאים.
    4. לאחר שעתיים הנדרשות בשלב 1.4.14, הוסף 50 μL של תאי Caco-2 המרחפים ב- DMEM לאמצע כל קרום מרתף. סגור את המכסה של צלחת רב באר.
    5. יש לדגור מתחת למכסה המנוע הסטרילי של הזרימה הלמינרית למשך 10 דקות. לאחר מכן להעביר את האינקובטור במשך 30 דקות.
    6. הכינו תמיסת DMEM המכילה 10% FBS ו-1% Pen/Strep.
      הערה: הכן פתרון מספיק לשימוש באמצעי אחסון של 1 מ"ל לכל דגם.
    7. הוסף 500 μL של המדיום מעל הדגם המשוחזר ו 500 μL מתחת למסנן.
      הערה: נדרשת זהירות בעת הוספת המדיום מעל המסנן כדי למנוע ניתוק או לחץ על התאים.
    8. סגור את מערכת הצלחת מרובת הקידוחים ומקם אותה באינקובטור.
  6. הכנה/היווצרות המודל והשימוש בו (יום 2 עד יום 6)
    1. יום 2: הסר בזהירות את התמיסה הן מעל הדגם המשוחזר והן מתחת לפילטר באמצעות פיפטה. יש להחליף ב-500 מיקרוליטר טרי של DMEM טרי (10% FBS ו-1% Pen/Strep) מעל ומתחת למסנן, בהתאמה.
    2. יום 3: חזור על הפעולה כאמור לעיל בשלב 1.6.1.
    3. יום 4: חזור על הפעולה כאמור לעיל בשלב 1.6.1.
      הערה: מודל מעיים זה הוא מודל תאי סטטי; לכן, כדי להעדיף את שחרורם של מולקולות ואת הצמיחה והגירוי של תאים, חשוב מאוד כי המדיום משתנה כל יום.
    4. יום 5: בשלב זה, המודל מתגבש/מפותח במלואו. השתמש במודלים אלה למחקרים נוספים.
      הערה: הזמן הטוב ביותר לשימוש בדגם הוא 5 ימים. למרות שניתן לשמור על התאים באינקובטור לפרקי זמן ארוכים יותר, ככל שעובר יותר זמן, כך גדלה ההסתברות שתאי האפיתל יגדלו בצורה לא מבוקרת, וכתוצאה מכך תיווצר שכבה לא מאורגנת וקומפקטית שקשה להשתמש בה.
    5. לאחר 5 ימים, לדגור על המודלים עם רכיבים רעילים (גלוטן או lipopolysaccharide [LPS]) או מועילים (פוליפנולים) של עניין. הוסף אותם לחלק העליון של המודל המשוחזר התלוי בתווך DMEM.
      הערה: יש לחשב ולהשעות את הריכוז המתאים של כל רכיב ריבית במדיום DMEM. יש להגדיר פקדים שאינם מטופלים המכילים מדיום DMEM בלבד לצורך השוואה למודלים הניסיוניים.
    6. לדגור על מודלי הבקרה והניסוי במשך 24 שעות באינקובטור.
    7. יום 6: הסירו את המדיום מעל ומתחת לפילטר בעזרת פיפטה.
      הערה: ניתן לאחסן את המדיום לבדיקות עוקבות מסוג ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) כדי למדוד את שחרורם של ציטוקינים דלקתיים. לשם כך, המדיום יש להוסיף בקבוקונים סטריליים מאוחסן ב -20 ° C לניתוח נוסף.

2. שיבוץ פרפין של דגמי רירית המעי המשוחזרים

הערה: ההליך כולו חייב להתבצע תחת מכסה מנוע של אדים כימיים. יש להקפיד על כל צעד והקצאת זמן בהתאמה. מסיבה זו, חשוב להכין את כל הריאגנטים מראש.

  1. הגדר את מכונת הפרפין ל 58 ° C כך שהיא מוכנה לשימוש.
  2. מעבירים את תוספות הממברנה לבארות נקיות באמצעות צבת בצלחת סטרילית בת 24 בארות.
  3. הוסף 500 μL של 37% פורמלין חוצץ PBS מעל המסנן ו 1 מ"ל מתחת למסנן. סגור את המכסה והשאר אותו מתחת למכסה האדים הכימיים למשך שעתיים ב- RT.
    הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בפורמלין חוצץ 4% ב- RT למשך שעה אחת.
  4. הסר את הפורמלין והוסף תמיסת HBSS מעל ומתחת לפילטר. לאחר מכן הסר את HBSS.
  5. נתקו את הלמינה פרופריה מהחדרת הממברנה.
    הערה: תאי רירית המעי בדרך כלל מתנתקים בקלות רבה מהחדרת הממברנה מכיוון שהם אינם מחוברים לאחרון. בנוסף, שני תאי הדגימה (אפי ובזאלי) נשארים מחוברים, תוך שמירה על המבנה התלת-ממדי. אם, מסיבה כלשהי, הם אינם מנותקים בקלות, יהיה חשוב להשתמש בלהב אזמל חד פעמי סטרילי כדי להסיר את רירית המעי מן הממברנה להחדיר. ניתן לחתוך את הממברנה ובכך לנתק אותה מהפלסטיק. היזהר לא לגעת בדגימה עם אזמל. המניע להסרת החדרת הממברנה מהתאים המשובצים בקולגן הוא שמסנן זה עלול להתנתק בשלבי הקיבוע או הטמעת הפרפין הבאים, מה שהופך את ההשוואות בין מודלים של רירית המעי לבלתי פרופורציונליות. יתר על כן, תוספות הממברנה בתוך החלק המוטבע יש עקביות שונה אשר יכול להפריע חתך.
  6. הניחו את הכוסות בנפח 100 מ"ל מתחת למכסה המנוע של האדים הכימיים, כאשר כל אחת מהן מסומנת כראוי כדי לכלול מערכת מודל אחת משוחזרת של רירית המעי הנחקרת. הוסף 25 מ"ל של 35% ETOH לכל ולאחר מכן הוסף את רירית המעי המשוחזרת. דוגרים במשך 10 דקות.
  7. החליפו את האתנול 35% ב-25 מ"ל אתנול 50% ודגרו במשך 10 דקות.
  8. החליפו את האתנול 50% ב-25 מ"ל של 70% אתנול ודגרו במשך 10 דקות.
  9. החליפו את האתנול 70% ב-25 מ"ל של 80% אתנול ודגרו במשך 10 דקות.
  10. החליפו את האתנול 80% ב-25 מ"ל של 95% אתנול ודגרו במשך 10 דקות.
  11. החליפו את האתנול 95% ב-25 מ"ל של 100% אתנול ודגרו במשך 10 דקות.
  12. החליפו את האתנול 100% בשינוי נוסף של 25 מ"ל של 100% אתנול ודגרו במשך 10 דקות.
  13. הניחו כוסות בנפח 100 מ"ל מתחת למכסה המנוע, כל אחת מהן מסומנת כראוי כדי לכלול דגם אחד בבדיקה. מוסיפים 50 מ"ל קסילן או חומר ניקוי היסטולוגי למשך 10-20 דקות.
    הערה: היסטו-קליר (חומר ניקוי היסטולוגי) מומלץ מכיוון שהסוכן משפר את הבהירות והחיוניות של כתמים אצידופיליים. זמן הניקוי יכול להשתנות מדגימת רירית מעי משוחזרת אחת לאחרת ויש לבדוק שקיפות במראה כל 2-3 דקות.
  14. ברגע שהדגימות שקופות, הניחו אותן במחזיק קלטות רקמת מתכת אשר לאחר מכן טבול בפרפין נוזלי בתוך המכונה המחוממת למשך 45 דקות.
  15. החליפו את הפרפין והשאירו את הדגימות בתוך המכונה המחוממת למשך 45 דקות נוספות.
  16. מוציאים את מחזיק קלטות הטישו ומניחים על קרח להתקרר. כאשר גושי הדגימה המקוררים מתנתקים ממחזיק המתכת, ניתן לקרר אותם עוד יותר בטמפרטורת החדר.
  17. אחסן את הבלוקים ב- RT.
    הערה: אם המטרה היא להכין חלקים באופן מיידי, אז בלוקים ניתן להציב ב 4 ° C, כך שהם מקוררים היטב בעת שימוש.
  18. חותכים 4 מקטעים מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
  19. מניחים את החלקים לחתוך על שקופיות ולייבש אותם בתנור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
  20. השקופיות מוכנות לשימוש. אחסנו אותם ב-RT עד לביצוע צביעה היסטולוגית H&E או צביעת תגובה היסטוכימית חיסונית (סוג אנטיגן-נוגדן).
    1. עבור צביעה היסטוכימית חיסונית, בחר את הנוגדנים המעניינים (בין אם לחקר חלבוני TJ כגון occludin או להפעלת מונוציטים, נדידה והתמיינות) וזהה ביטוי (באמצעות צביעה) באמצעות ערכות מסחריות.
    2. באופן דומה, מדדו ליחה באמצעות ערכת הצביעה Alcian blue and periodic acid-Schiff (PAS).
    3. כמת את חלבוני TJ המוכתמים המעניינים, כגון אוקלודין, על ידי חישוב אחוז הפיקסלים החיוביים במיקרוגרפים שנלקחו מהמיקרוסקופ.
    4. נתח תמונות של התאים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות (לדוגמה, תוכנת ImageJ2 [Wayne Rasband, version 2.9.0/1.53t]).
      1. כדי לבצע את ניתוח הפיקסלים, עבד את התמונות הדיגיטליות ל- 300 פיקסלים לאינץ 'והמיר אותן ל- 8 סיביות. לאחר מכן, עבד את התמונות הבינאריות על ידי תוסף Color Deconvolution כדי לנתח את הצביעה של החלבון המעניין, במקרה זה, הצביעה האדומה הקבועה של occludin.
      2. שמור את התמונה שנבחרה כ-tiff והכפיף אותה להליך "ניקוי" כדי לחסל חפצים באמצעות עורך גרפי (לדוגמה, Adobe PhotoshopCC [גרסה 20.0.4]).
      3. לאחר מכן, מדוד את כל תחומי העניין באמצעות היישום Analyze Particle of ImageJ2, ודווח על הנתונים כמספר הפיקסלים.
        הערה: כל ניסוי צריך להתבצע במשולש עם שלושה שדות שכפול פנימיים מנותחים עבור כל שכפול. לצורך כימות הריר, ניתן להחיל את אותו עיקרון של מדידת הפיקסלים על התמונות שצולמו של מוצינים ניטרליים מוכתמים בסגול-מגנטה וריר חומצי מוכתם בכחול בהיר, בהתאמה.

תוצאות

ההיבט החשוב הראשון הוא לקבוע את הקבילות של רירית המעי הבסיסית 3D שווה ערך למטרות ניסיוני. זה מבוצע עם הכתם הנפוץ ביותר במעבדות היסטולוגיה והיסטופתולוגיה, כלומר hematoxylin (כתמים חומר גרעיני צבע כחול סגול עמוק) ו eosin (כתמים חומר ציטופלזמי גוונים משתנים של ורוד). צביעת H&E מבוצעת תחילה בביקורת לא מט?...

Discussion

מערכת המודל הבסיסית המשוחזרת של רירית המעי המוצגת כאן (איור 6) משלבת מורכבות פיזיולוגית (תרביות תאים תלת-ממדיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית המכילות שכבה חד-שכבתית Caco-2 עם תמיכה עשירה ב-ECM lamina propria המכילה פיברובלסטים ומונוציטים) עם פשטות ניסיונית (שימוש בקווי תאים אנושי?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

תודה לקרן אומברטו ורונסי על מלגה התומכת בעבודת חוקר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcian Blue/PAS kitScyTek Laboratories, Inc.APS-1, APS-2kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solutionThermo Fisher15250061cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cellsATCCATCC HTB-37cell line
Citro-Histo-Clear Limonene basedHistoline laboratoriesR0050CITROreagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GIBCO11965092cell colture reagent
Embedding CenterHistoline laboratoriesTEC2900instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCOA5256701cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)GIBCO12350039cell colture reagent
Human Midkine ELISA kitCohesion BiosciencesCEK1270kit ELISA
Inverted microscopeEclipse Ts2, NikonMFA34100microscope
L929 mouse fibroblastsATCCATCC ®-CCL1cell line
LC3-IINovus BiologicalsNB910-40752SuperNovusPackantibody
L-GlutamineGIBCOA2916801cell colture reagent
OccludinNovus BiologicalsNBP1-87402antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °CHistoline laboratoriesR0040 PLUSinstrument for paraffin embedding
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070063cell colture reagent
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070063cell colture reagent
rat tail collagen type IGIBCOA1048301cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)GIBCO21870076cell colture reagent
Sodium pyruvateGIBCO11360070cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell CounterThermo FisherTF-CACC2FLcell counting instrument
TranswellCostar Corning3413plastic for cell colture
TrypsinGIBCO15090046cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell lineATCCATCC CRL-1593.2cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain KitScyTek Laboratories, Inc.AMH080kit for immunohistochemical staining

References

  1. Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
  3. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
  4. Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
  5. Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
  6. Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
  7. Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
  8. Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
  11. Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , (2023).
  12. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
  13. Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
  14. Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
  15. Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
  16. Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
  17. Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
  18. Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
  19. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE199In VivoIn VitroCaco 2U937L929H E

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved