يعد الحفاظ على سلامة جينوم البويضة أمرا ضروريا لضمان الإخلاص الجيني في الجنين الناتج. هنا ، نقدم بروتوكولا دقيقا للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا الجرثومية الأنثوية للثدييات.
البويضات هي من بين أكبر الخلايا وأكثرها عمرا في جسم الأنثى. تتشكل في المبيضين أثناء التطور الجنيني وتظل محتجزة في الطور التمهيدي للانقسام الميوزي الأول. قد تستمر الحالة الهادئة لسنوات حتى تتلقى البويضات حافزا للنمو والحصول على الكفاءة لاستئناف الانقسام الميوزي. هذه الحالة المطولة من الاعتقال تجعلهم عرضة للغاية لتراكم الإهانات الضارة بالحمض النووي ، والتي تؤثر على السلامة الوراثية للأمشاج الأنثوية ، وبالتالي على السلامة الوراثية للجنين المستقبلي.
وبالتالي ، فإن تطوير طريقة دقيقة للكشف عن تلف الحمض النووي ، وهو الخطوة الأولى لإنشاء آليات استجابة لتلف الحمض النووي ، له أهمية حيوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا شائعا لاختبار وجود وتطور تلف الحمض النووي في البويضات الموقوفة بالطور خلال فترة 20 ساعة. على وجه التحديد ، نقوم بتشريح مبيض الفئران ، واسترداد مجمعات البويضات الركامية (COCs) ، وإزالة الخلايا الركامية من موانع الحمل الفموية ، وزراعة البويضات في وسط Μ2 الذي يحتوي على 3-isobutyl-1-methylxanthine للحفاظ على حالة الاعتقال. بعد ذلك ، يتم التعامل مع البويضات بعقار مضاد للأورام سام للخلايا ، إيتوبوسيد ، لتوليد فواصل مزدوجة الخيوط (DSBs).
باستخدام التألق المناعي والمجهر متحد البؤر ، نقوم باكتشاف وتحديد مستويات البروتين الأساسي γH2AX ، وهو الشكل المفسفر للهيستون H2AX. يصبح H2AX مفسفرا في مواقع DSBs بعد تلف الحمض النووي. يمكن أن يؤدي عدم القدرة على استعادة سلامة الحمض النووي بعد تلف الحمض النووي في البويضات إلى العقم والعيوب الخلقية وزيادة معدلات الإجهاض التلقائي. لذلك ، فإن فهم آليات الاستجابة لتلف الحمض النووي ، وفي الوقت نفسه ، إنشاء طريقة سليمة لدراسة هذه الآليات أمر ضروري لأبحاث البيولوجيا الإنجابية.
تبدأ عملية الانقسام الاختزالي في الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات في المبايض قبل الولادة. يتم إنشاء العدد الإجمالي للبويضات في المبيضين في المقام الأول أثناء التطور الجنيني. تدخل البويضات الانقسام الميوزي وتظل محتجزة في الطور التمهيديالأول 1. بعد بداية البلوغ وإنتاج وعمل الغدد الصماء للهرمون المنبه للجريب (FSH) والهرمون اللوتيني (LH) ، قد تستأنف البويضات وتكمل الانقسامالاختزالي 2. في البشر ، يمكن أن يستمر توقف الطور لمدة تصل إلى 50 عاما3. الانقسامات الخلوية بعد الدخول في الانقسام الميوزي الأول غير متماثلة ، مما يؤدي إلى إنتاج جسم قطبي صغير وخلية بويضية تحتفظ بحجمها. وبالتالي ، يتم تخزين معظم مكونات السيتوبلازم في البويضة أثناء التطور الجنينيالمبكر 4. بعد ذلك ، تدخل البويضات الانقسام الاختزالي الثاني ، دون إعادة تشكيل نواتها أو تكثيف كروموسوماتها ، وتظل محتجزة في الطور الثاني حتى الإخصاب5.
الخاصية الفريدة التي تميز البويضات عن الخلايا الجسدية هي حالة الاعتقال في الطور التمهيدي الأول ، عندما تمتلك البويضة نواة سليمة (توقف الحويصلة الجرثومية [GV]) ، يشار إليها باسم المرحلة6 من GV. بناء على تنظيم الكروماتين ، يتم تصنيف البويضات في مرحلة GV إلى فئتين: النواة غير المحاطة (NSN) والنواة المحاطة (SN) 7,8. في البويضات في مرحلة NSN GV ، ينتشر الكروماتين في جميع أنحاء المنطقة النووية بأكملها ، ويكون النسخ نشطا ، بينما في بويضات SN ، يشكل الكروماتين حلقة مضغوطة تحيط بالنواة ، ويكون النسخ صامتا9. كلا النوعين من البويضات في مرحلة GV تظهر الكفاءة الاختزالي. يدخلون الانقسام الاختزالي بنفس المعدل ، لكن بويضات NSN تقدم قدرة تنموية منخفضة ولا يمكن أن تتطور إلى ما بعد مرحلة الجنينالمكونة من خليتين 10.
تزيد الحالة المطولة للتوقف عن المرحلة الأولى من حدوث تراكم تلف الحمض النووي11. ومن ثم، فإن آليات استجابة تلف الحمض النووي (DNA) في البويضات ضرورية للسماح بإنتاج الجاميتات ذات السلامة الوراثية، ولضمان احتواء الجنين الناتج على محتوى كروموسومي فسيولوجي.
أحد الجوانب المركزية لاستجابة تلف الحمض النووي هو إصلاح الحمض النووي. تشمل المسارات الرئيسية لإصلاح DSB في الخلايا حقيقية النواة الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، وإعادة التركيب المتماثل (HR) ، والبديل NHEJ12،13،14،15. NHEJ هي آلية أسرع ولكنها أكثر عرضة للخطأ ، بينما تتطلب الموارد البشرية مزيدا من الوقت لإكمالها ولكنها تتمتع بدقةعالية 16.
لا توجد معرفة كافية حول الآليات التي تستخدمها البويضات لإصلاح تلف الحمض النووي. أظهرت الدراسات أن تلف الحمض النووي الناجم عن بويضات الثدييات كاملة النمو باستخدام عوامل سامة للجينات ، مثل إيتوبوسيد أو دوكسوروبيسين أو الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع المؤين ، لا يؤثر على توقيت ومعدلات الخروج من الطور الأول17. يمكن أن تخضع البويضات لانهيار GV (GVBD) حتى في وجود مستويات مرتفعة من الضرر. يمكن تحديد هذا الضرر من خلال مراقبة γH2AX. هذا الشكل المفسفر من H2AX (γΗ2ΑΧ) هو علامة DSB ، والتي تقع في موقع الفواصل وتعمل كسقالة للمساعدة في إصلاح العوامل والبروتينات لتتراكم في النهايات المكسورة18.
يرجع عدم توقف دورة الخلية بعد تلف الحمض النووي إلى عدم كفاية نقطة فحص تلف الحمض النووي التي تسمح للبويضات ذات الحمض النووي غير المصلح بالعودة إلى الانقسام الاختزالي. بعد مستويات عالية من تلف الحمض النووي ، يمكن لنقطة التفتيش الحفاظ على توقف الطور من خلال تنشيط مسار يعتمد على ATM / Chk1. ترجع استجابة نقاط التفتيش المحدودة ل DSBs إلى التنشيط المحدود لأجهزة الصراف الآلي17,19. في المرحلة M من الانقسام الاختزالي الأول ، أظهرت الأبحاث أن تلف الحمض النووي قد ينشط نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC) التي يسببها الانقسام الاختزالي I ، مما يمنع تنشيط مركب / سيكلوزوم تعزيز الطور E3 ubiquitin ligase (APC / C) ، وبالتالي ، خروج المرحلة M. علاوة على ذلك ، فإن استئصال بروتينات SAC يتغلب على حالة توقف المرحلة M ، مما يؤكد أهمية SAC في إنشاء الانقسام الاختزالي I chekpoint20.
كما تظهر الأبحاث السابقة بوضوح ، لا يمكن ل DSBs إحداث نقطة تفتيش قوية في بويضات الفئران. إذا ترك هذا الضرر دون إصلاح ، فقد يؤدي إلى أجنة تحمل تشوهات كروموسومية. لذلك ، من المهم دراسة استجابة تلف الحمض النووي في مراحل مختلفة من تكوين الأمشاج الأنثوية لفهم المسارات الفريدة التي تستخدمها البويضات للتعامل مع الإهانات الجينية المحتملة بشكل أفضل.
تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل السلطات المحلية (منطقة يوانينا ، اليونان) وأجريت وفقا لتوجيهات مجلس المجتمعات الأوروبية 2010/63 / EU. أجريت تجارب فيما يتعلق بمبادئ 3Rs. تم الاحتفاظ بجميع الفئران CD-1 المستخدمة في التجارب في مرفق بيت الحيوان بجامعة يوانينا ، اليونان ، في غرفة ذات درجة حرارة مضبوطة (22 درجة مئوية) ورطوبة (60٪) وتم تغذيتها حسب الحاجة. بيت الحيوان لديه ترخيص لتشغيل منشأة للتربية (EL33-BIObr01) ، والتوريد (EL33-BIOsup01) ، والتجارب (EL33BIO-exp01).
1. إعداد الكواشف
2. جمع البويضات GV من تشريح المبايض وتحريض DSBs
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأدوات والحلول معقمة. تتم معالجة البويضات باستخدام ماصة الفم تحت مجهر ستيريو (انظر جدول المواد) ، ويتم تغطية جميع القطرات بالزيت المعدني (انظر جدول المواد والشكل 1E).
الشكل 1: عملية عزل البويضات. أ: إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالمبيض وبقايا أجزاء قناة فالوب من المبيضين في وسط M2 باستخدام IBMX. الصورة التي تم الحصول عليها من خلال عدسات المجهر ستيريو. شريط المقياس = 1 مم. (B) المبايض المعزولة في وسط M2 مع IBMX. الصورة التي تم الحصول عليها من خلال عدسات المجهر ستيريو. شريط المقياس = 1 مم. (ج) ثقب ميكانيكي للمبيض باستخدام إبرة 27 جم في وسط M2 مع IBMX. الصورة التي تم الحصول عليها من خلال عدسات المجهر ستيريو. شريط المقياس = 1 مم. (D) موانع الحمل الفموية المنبعثة من المبايض بعد الانثقاب في وسط M2 مع IBMX. الصورة التي تم الحصول عليها من خلال عدسات المجهر ستيريو. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) جمع البويضات باستخدام ماصة الفم. (F) البويضات المجردة ، بعد إزالة الخلايا الركامية المحيطة ، في وسط M2 مع IBMX. الصورة التي تم الحصول عليها من خلال عدسات المجهر ستيريو. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. تثبيت البويضة والتألق المناعي
ملاحظة: يتم التعامل مع البويضات باستخدام ماصة الفم تحت مجهر ستيريو ، وجميع القطرات مغطاة بالزيت المعدني.
4. المجهر متحد البؤر
ملاحظة: يجب إجراء الفحص المجهري متحد البؤر على الفور لتجنب انخفاض شدة التألق بعد وضع البويضات في أطباق ذات قاع زجاجي. مطلوب الوصول إلى مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد) مع مرحلة آلية.
الشكل 2: الفحص المجهري متحد البؤر. أ: البويضات الثابتة بعد إجراء بروتوكول التألق المناعي وتلطيخ الحمض النووي (DNA)، وهي في قطرات منفصلة من محلول الغسيل، ومغطاة بالزيت المعدني، وموضوعة في طبق ذي قاع زجاجي، ومعدة للتصوير المجهري متحد البؤر. تحتوي كل قطرة على فئة تجريبية مختلفة. الصورة التي تم الحصول عليها من خلال عدسات المجهر ستيريو. شريط المقياس = 1 مم / 100 ميكرومتر للجزء الكبير. (ب) صفيحة زجاجية القاع موضوعة على مرحلة المجهر متحد البؤر. ج: صورة برايتفيلد للبويضات التي تم الحصول عليها من خلال الفحص المجهري متحد البؤر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (د) نظام الفحص المجهري متحد البؤر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. تحليل التصوير
باستخدام الإجراء الموضح هنا ، تم تشريح مبيض الفئران ، وإزالة الدهون ، وتم جمع بويضات مرحلة GV كاملة النمو. بعد ذلك ، تمت إزالة الخلايا الركامية عن طريق السحب المتكرر باستخدام ماصة ضيقة ووضعت في قطرات جديدة من وسط M2-IBMX ومغطاة بالزيت المعدني على كتلة ساخنة (37 درجة مئوية) (الشكل 1A-F). تم تحضير ثلاثة تركيزات مختلفة من الإيتوبوسيد (5 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، و 50 ميكروغرام / مل) باستخدام تركيز إيتوبوسيد مخزون قدره 20 ملغم / مل. تم وضع البويضات في مرحلة GV في ثلاثة تركيزات إيتوبوسيد متميزة لمدة 1 ساعة في قطرات مغطاة بالزيت المعدني ومحمية من الضوء عند 37 درجة مئوية. ثم تم اتباع بروتوكول التألق المناعي ، كما هو موضح في قسم البروتوكول بالتفصيل ، وتم وضع البويضات في أطباق ذات قاع زجاجي وتمت ملاحظتها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 2).
في البويضات في مرحلة SN GV ، مباشرة بعد تلف الحمض النووي ، زاد وجود γH2AX في جميع تركيزات الإيتوبوسيد (5 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، و 50 ميكروغرام / مل) ، وتم توزيع γH2AX في جميع أنحاء منطقة الحمض النووي بأكملها (الشكل 3). تم إجراء القياس الكمي والتقدير DSB من خلال مراقبة شدة مضان γH2AX في مواقع الحمض النووي. تكثف مضان γH2AX بشكل متناسب مع زيادة تركيزات الإيتوبوسيد. علاوة على ذلك ، بعد توقف الطور المطول (20 ساعة بعد علاج إيتوبوسيد) ، أظهرت البويضات في مرحلة GV القدرة على تقليل عدد بؤر γH2AX وشدتها ، مما يعني وجود عمليات إصلاح نشطة في البويضات الموقوفة في مرحلة GV (الشكل 3E).
على عكس بويضات SN ، حيث تم توزيع مضان γH2AX من خلال الحمض النووي ، في بويضات NSN ، تم عرض γH2AX في بؤر مباشرة بعد العلاج بالإيتوبوسيد عند 20 ميكروغرام / مل. قمنا بتقدير عدد البؤر التي تزامنت مع منطقة الحمض النووي ، وحسبنا مضان كل بؤرة ، وقدمنا متوسط مضان جميع البويضات. أظهر كل من التألق وعدد البؤر اختلافات ذات دلالة إحصائية بين فئتي البويضات (الشكل 4).
يوفر الفحص المجهري متحد البؤر معلومات عن عدد وشدة البؤر في مداخن Z المختلفة ، مما يساعد على تحديد وجود تلف الحمض النووي وديناميكيات الإصلاح في نقاط زمنية مميزة. يوفر مسح Galvano مسحا ضوئيا دقيقا بخلفية منخفضة وتحليلا أفضل لصور المسح الضوئي.
الشكل 3: اختزال γH2AX في البويضات في مرحلة SN GV المعالجة بثلاثة تركيزات مختلفة من الإيتوبوسيد بعد توقف GV المطول. (أ) مضان γH2AX في البويضات في مرحلة SN GV 0 ساعة بعد العلاج بالإيتوبوسيد. يزداد γH2AX مباشرة بعد التعرض في جميع تركيزات الإيتوبوسيد ، وتعتمد الزيادة على التركيز (أخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) الرسم البياني لمضان γH2AX في بويضات مرحلة SN GV 0 ساعة بعد العلاج بتركيزات إيتوبوسيد مميزة. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، (ns = غير معنوي ، ** p < 0.005 ، **** p < 0.0001 ، ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Tukey المتعددة). (C) مضان γH2AX في بويضات مرحلة SN GV بعد 20 ساعة من العلاج بالإيتوبوسيد. γH2AX يقلل 20 ساعة بعد التعرض في جميع تركيزات إيتوبوسيد (الأخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (د) الرسم البياني لفلورة γH2AX في بويضات المرحلة SN GV بعد 20 ساعة من العلاج بتركيزات إيتوبوسيد متميزة. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، (ns = غير معنوي ، * p < 0.05 ، ** p < 0.005 ، *** p < 0.0005 ، **** p < 0.0001 ، ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Tukey المتعددة). (ه) الرسم البياني الشريطي لتقليل مضان γH2AX في الخلايا البيضية في مرحلة SN GV بعد توقف الطور الأولي في البويضات المعالجة بالإيتوبوسيد. يشير الرقم الموجود أعلى كل عمود إلى النسبة المئوية للانخفاض في مضان γH2AX. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فسفرة Η2ΑΧ في البويضات في مرحلة NSN GV بعد العلاج بالإيتوبوسيد عند 20 ميكروغرام / مل. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر لبويضة واحدة من مرحلة NSN GV (أخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) صور تمثيلية متحدة البؤر لخلية بويضية NSN GV في المرحلة المعالجة بالإيتوبوسيد (أخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). تم تثبيت البويضات 0 ساعة بعد علاج إيتوبوسيد. الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ج) مضان γΗ2ΑΧ الطبيعي في البويضات في مرحلة NSN GV بعد معالجة إيتوبوسيد 20 ميكروغرام / مل. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، مأخوذة من تجربتين مستقلتين (**** p < 0.0001 ، اختبار t غير المزاوج غير المصاحب ، اختبار Mann-Whitney U). (د) عدد بؤر γΗ2ΑΧ في البويضات في مرحلة NSN GV بعد معالجة إيتوبوسيد 20 ميكروغرام / مل. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، مأخوذة من تجربتين مستقلتين (**** p < 0.0001 ، اختبار t غير المزاوج غير المصاحب ، اختبار Mann-Whitney U). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، اكتشفنا DSBs في بويضات الثدييات. تسمح هذه الطريقة باكتشاف ودراسة عملية إصلاح الحمض النووي في البويضات. يمكن أيضا استخدام نفس البروتوكول لتحليل البروتينات الأخرى التي تشارك في العمليات الفسيولوجية في بويضات الثدييات. من المهم دراسة كيفية استجابة البويضات لتلف الحمض النووي المحتمل من أجل فهم سبب ضعف الخصوبة لدى الإناث لدى البشر بشكل أفضل.
يمكن أن تكون دراسة استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات صعبة بسبب حساسية البويضات. تتطلب معالجة البويضات درجات حرارة محددة وتركيزات CO 2 و O2. في الوقت نفسه ، يجب حماية البويضات من الضوء. يجب أن تتم المناولة الكاملة باستخدام ماصات زجاجية غير ضيقة ، لأن هذا قد يكون ضارا للبويضات ، ولكن أيضا ليس بعرض كبير ، لأن هذا قد يتسبب في تخفيف الوسط ، وبالتالي يؤثر سلبا على إجراء التثبيت. في كل خطوة من خطوات التثبيت ، يتم استخدام عدة قطرات من المخازن المؤقتة لتقليل تأثير التخفيف. طريقة بديلة لمراقبة DSBs هي مقايسة المذنب24. على الرغم من أن هذه التقنية أكثر حساسية ، إلا أنها أكثر تعقيدا. في الوقت نفسه ، باستخدام مقايسة المذنب ، لا يمكن اكتشاف منطقة الحمض النووي الدقيقة التي يحدث فيها الضرر ، وفي الخلايا ذات جزيئات الحمض النووي الريبي الوفيرة ، مثل البويضات في مرحلة GV25 ، يمكن زيادة الخلفية ، مما يؤدي إلى إشارة تلف الحمض النووي الخاطئة26.
باستخدام بروتوكول التألق المناعي الموصوف هنا ، يمكننا اكتشاف DSBs بدقة وتقدير تقدم الإصلاح في البويضات في مرحلة GV ، كما يتضح من انخفاض مضان γH2AX بمرور الوقت. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو أن بعض الأجسام المضادة قد تقدم توزيعا غير محدد في جميع أنحاء البويضة ، مما يؤدي إلى صور ذات إضاءة خلفية عالية. يتم استخدام المخزن المؤقت PFA-Tx-100 بدلا من PFA المتسلسل و Tx-100 ، حيث لاحظنا أنه يحسن عملية التثبيت من خلال السماح باكتشاف خلفية أقل ومضان غير محدد. القيد الثاني لاستخدام γH2AX للكشف عن DSB هو أنه لا يمكن تقدير الضرر بعد GVBD بسبب الفسفرة التلقائية ل γH2AX في الانقسام الاختزالي23.
في بروتوكول التألق المناعي هذا ، تظل البويضات في مخزن مؤقت سائل ولا يمكن تخزينها داخل الشرائح. هذه الحقيقة تجعل من الصعب الحفاظ على الخلايا الثابتة لعدة أيام بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي. من أجل الحصول على صور عالية الجودة وعدم فقدان الإشارة ، يفضل إجراء التصوير في غضون ساعات قليلة بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن مسح النوى من خلال المحور Z يمكن أن يجعل الإشارة أضعف بسبب التعرض المفرط. لهذا السبب ، يفضل خفض طاقة الليزر وزيادة سرعة المسح.
أخيرا ، هناك قيد آخر لبروتوكول التألق المناعي وهو أنه يمكن استخدامه فقط للخلايا الثابتة / غير الحية. لذلك ، يمكننا فقط تقدير وجود وغياب العوامل في نقاط زمنية محددة دون معرفة ما إذا كانت هناك أي تقلبات في تركيزها أو تغيرات في سلوكها بمرور الوقت. يمكن التغلب على هذه المشكلة باستخدام تصوير الخلايا الحية والعلامات الفلورية.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
نعترف بدعم هذا العمل من مشروع "إنشاء بنى تحتية" لبناء القدرات "في البحوث الطبية الحيوية (BIOMED-20)" (MIS 5047236) ، والذي يتم تنفيذه في إطار عمل "تعزيز البنية التحتية للبحث والابتكار" ، بتمويل من البرنامج التشغيلي "القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار" (NSRF 2014-2020) ، وبتمويل مشترك من اليونان والاتحاد الأوروبي (الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
NaN3 | Honeywell | 13412H | |
NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved