Fare Oositlerinde DNA Çift Sarmallı Kırılmaların Tespiti

Özet

Oosit genom bütünlüğünün korunması, elde edilen embriyoda genetik sadakati sağlamak için gereklidir. Burada, memeli dişi üreme hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılmaları tespit etmek için doğru bir protokol sunuyoruz.

Özet

Oositler kadın vücudundaki en büyük ve en uzun ömürlü hücreler arasındadır. Embriyonik gelişim sırasında yumurtalıklarda oluşurlar ve mayoz I'in profazında tutuklanırlar. Hareketsiz durum, oositler büyümek için bir uyaran alana ve mayoza devam etme yetkinliğini elde edene kadar yıllarca sürebilir. Bu uzun süreli tutuklama durumu, onları dişi gametlerin genetik bütünlüğünü ve dolayısıyla gelecekteki embriyonun genetik bütünlüğünü etkileyen DNA'ya zarar veren hakaretlerin birikmesine karşı son derece duyarlı hale getirir.

Sonuç olarak, DNA hasar yanıt mekanizmalarının kurulması için ilk adım olan DNA hasarını tespit etmek için doğru bir yöntemin geliştirilmesi hayati önem taşımaktadır. Bu makale, 20 saatlik bir süre boyunca faz tutuklu oositlerde DNA hasarının varlığını ve ilerlemesini test etmek için ortak bir protokolü açıklamaktadır. Spesifik olarak, fare yumurtalıklarını inceliyoruz, kümülüs-oosit komplekslerini (COC'ler) alıyoruz, kümülüs hücrelerini COC'lerden çıkarıyoruz ve tutuklama durumunu korumak için oositleri 3-izobütil-1-metilksantin içeren Μ2 ortamında kültürlüyoruz. Daha sonra, oositler, çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) oluşturmak için sitotoksik, antineoplazmik ilaç, etoposid ile muamele edilir.

İmmünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanarak, histon H2AX'in fosforile formu olan çekirdek protein γH2AX'in seviyelerini tespit ediyor ve ölçüyoruz. H2AX, DNA hasarından sonra DSB'lerin bölgelerinde fosforile olur. Oositlerdeki DNA hasarını takiben DNA bütünlüğünün geri kazanılamaması kısırlığa, doğum kusurlarına ve spontan düşük oranlarının artmasına neden olabilir. Bu nedenle, DNA hasar tepki mekanizmalarının anlaşılması ve aynı zamanda bu mekanizmaları incelemek için sağlam bir yöntemin oluşturulması, üreme biyolojisi araştırmaları için esastır.

Giriş

Memeli dişi üreme hücrelerinde mayoz bölünme süreci, doğumdan önce yumurtalıklarda başlatılır. Toplam oosit sayısı, öncelikle embriyogenez sırasında yumurtalıklarda belirlenir. Oositler mayoz bölünmeye girer ve faz I^1'de tutuklanır. Ergenliğin başlamasından ve folikül uyarıcı hormon (FSH) ve luteinize edici hormonun (LH) üretimi ve endokrin etkisinden sonra, oositler mayoz^bölünmeyi yeniden başlatabilir ve tamamlayabilir 2. İnsanlarda faz tutuklaması 50 yıla kadar sürebilir³. Mayoz I'e girişi takip eden hücre bölünmeleri asimetriktir, bu da küçük bir kutup gövdesi ve boyutunu koruyan bir oosit üretimi ile sonuçlanır. Bu nedenle, çoğu sitoplazmik bileşen, erken embriyogenez sırasında ooplazmada depolanır⁴. Daha sonra, oositler çekirdeklerini yeniden oluşturmadan veya kromozomlarını yoğunlaştırmadan mayoz II'ye girerler ve döllenme^5'e kadar metafaz II'de durmaya devam ederler.

Oositleri somatik hücrelerden ayıran benzersiz bir özellik, oositin GV evre⁶ olarak adlandırılan sağlam bir çekirdeğe (germinal vezikül [GV] tutuklaması) sahip olduğu faz I'deki durma durumudur. Kromatin organizasyonuna dayanarak, GV evresi oositleri iki kategoriye ayrılır: çevrelenmemiş nükleolus (NSN) ve çevrili nükleolus (SN)^7,8. NSN GV evresi oositlerinde, kromatin tüm nükleer bölge boyunca yayılır ve transkripsiyon aktiftir, SN oositlerinde kromatin nükleozu çevreleyen kompakt bir halka oluşturur ve transkripsiyon sessizdir⁹. Her iki GV evresi oosit türü de mayotik yeterlilik gösterir; mayoza aynı oranda girerler, ancak NSN oositleri düşük gelişim kapasitesi sunar ve iki hücreli evre embriyo^10'un ötesine geçemez.

Profaz I tutuklamasının uzamış durumu, DNA hasarı birikimi insidansını arttırır¹¹. Bu nedenle, oositlerdeki DNA hasar yanıt mekanizmaları, genetik bütünlüğe sahip gametlerin üretimine izin vermek ve elde edilen embriyonun fizyolojik bir kromozomal içeriğe sahip olmasını sağlamak için gereklidir.

DNA hasar tepkisinin merkezi bir yönü DNA onarımıdır. Ökaryotik hücrelerde DSB onarımı için ana yollar arasında homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), homolog rekombinasyon (HR) ve alternatif NHEJ^12,13,14,15 bulunur. NHEJ daha hızlı ancak hataya daha açık bir mekanizmadır, İK ise tamamlanması için daha fazla zaman gerektirir ancak yüksek sadakate sahiptir¹⁶.

Oositlerin DNA hasarı onarımı için kullandıkları mekanizmalar hakkında yeterli bilgi yoktur. Çalışmalar, tam büyümüş memeli oositlerinde etoposit, doksorubisin veya UVB veya iyonlaştırıcı radyasyon gibi genotoksik ajanların kullanımıyla indüklenen DNA hasarının, faz I tutuklamasından çıkış zamanlamasını ve oranlarını etkilemediğini göstermiştir¹⁷. Oositler, yüksek hasar seviyelerinin varlığında bile GV yıkımına (GVBD) uğrayabilir. Bu hasar, γH2AX'in gözlemlenmesiyle belirlenebilir. H2AX'in (γΗ2ΑΧ) bu fosforile formu, kırılma bölgesinde bulunan ve kırık uçlarda birikecek faktörlerin ve proteinlerin onarılmasına yardımcı olmak için bir iskele işlevi gören bir DSB belirtecidir¹⁸.

DNA hasarını takiben hücre döngüsü durmasının olmaması, onarılmamış DNA'ya sahip oositlerin mayoz bölünmeye yeniden girmesine izin veren yetersiz DNA hasarı kontrol noktasından kaynaklanmaktadır. Yüksek düzeyde DNA hasarını takiben, bir kontrol noktası, ATM / Chk1'e bağlı bir yolun aktivasyonu yoluyla faz durmasını koruyabilir. DSB'lere sınırlı kontrol noktası yanıtı, ATM^17,19'un sınırlı aktivasyonundan kaynaklanmaktadır. Mayoz I'in M fazında, araştırmalar, DNA hasarının, E3 ubikitin ligaz anafaz teşvik edici kompleks/siklozomun aktivasyonunu önleyen bir iğ montaj kontrol noktasını (SAC) indüklenen mayoz I kontrol noktasını aktive edebileceğini göstermiştir (APC/C) ve dolayısıyla M-fazı çıkışı. Ayrıca, SAC proteinlerinin ablasyonu, M-fazı durması durumunun üstesinden gelir, böylece mayoz I kontrol noktası^20'nin kurulmasında SAC'nin öneminin altını çizer.

Önceki araştırmaların açıkça gösterdiği gibi, DSB'ler fare oositlerinde sağlam bir profaz kontrol noktası oluşturamaz. Bu tür bir hasar onarılmazsa, kromozomal anormallikler taşıyan embriyolara yol açabilir. Bu nedenle, oositlerin potansiyel genetik hakaretlerle başa çıkmak için kullandıkları benzersiz yolları daha iyi anlamak için kadın gametogenezinin farklı aşamalarında DNA hasar tepkisini incelemek önemlidir.

Protokol

Tüm fare deneyleri yerel makamlar (Yanya Bölgesi, Yunanistan) tarafından onaylanmış ve 2010/63/EU sayılı Avrupa Toplulukları Konseyi Direktiflerine uygun olarak yürütülmüştür. Deneyler 3R'nin ilkelerine göre yapılmıştır. Deneyler için kullanılan tüm CD-1 fareleri, Yunanistan'daki Yanya Üniversitesi'nin hayvan barınağı tesisinde, kontrollü sıcaklık (22 °C) ve nem (%60) olan bir odada tutuldu ve ad libitum ile beslendi. Hayvan barınağı, üreme (EL33-BIObr01), tedarik (EL33-BIOsup01) ve deneyler (EL33BIO-exp01) için bir tesis işletme lisansına sahiptir.

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde seyreltin ( Malzeme Tablosuna bakınız) 200 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar. 10 μL alikot ekleyin ve −20 °C'de saklayın. Çözümü 1 ay içinde kullanın.
   NOT: IBMX tozu −20 °C'de tutulur.
2. Tüm immünofloresan tamponları hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
   1. Bir PBS tabletini (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 mL ddH₂Ο içinde seyrelterek steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
   2. 80 mL ddH 2 Ο, 0.59575 g HEPES, 1.81422 g PIPES, 0.38035 g EGTA ve 0.04066 g MgCl₂ekleyerek PHEM tamponu yapın (Malzeme Tablosuna bakın) manyetik bir karıştırıcı ile çalkalarken (Malzeme Tablosuna bakın) ve aynı anda pH 6.9'a ulaşana kadar NaOH ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) (pH / ORP ölçer kullanarak kontrol edin [Malzeme Tablosuna bakın]). Ardından, 100 mL'lik bir son hacme ddH₂Ο ekleyin.
   3. %4 PFA'lık bir son konsantrasyonda ısıtma altında manyetik bir karıştırıcı ile çalkalarken PFA tozunu (Malzeme Tablosuna bakın) PHEM tamponunda seyrelterek paraformaldehit-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) tamponu hazırlayın. Ardından, bir şırınga ve 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak tamponu süzün (Malzeme Tablosuna bakın) ve %0,5 Tx-100 ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Bir deney için yeterli olan yaklaşık 10 mL PFA-Tx-100 (0.4 g PFA, 50 μL Tx-100) hazırlayın. 4 °C'de en fazla 1 hafta saklayınız.
      DİKKAT: PFA'yı kullanmak için eldiven giyin ve cilt ve gözlerle temasından kaçının.
   4. PBS'de sığır serum albümini (nihai konsantrasyon:% 0.5 w / v BSA) ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve mekanik olarak çalkalayın. Mantar ve bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmek için 1:1.000 seyreltmede %10 w/v NaN₃ tamponu (sodyum azid) ekleyin. 10 mL ddH₂O'ya 1 g NaN 3 tozu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek% 10 w / v_{NaN 3} tamponu yapın; NaN₃ tamponunu oda sıcaklığında saklayın.
   5. PBS'ye BSA (son konsantrasyon: %3 w/h) ekleyerek ve mekanik olarak çalkalayarak bloke edici tampon hazırlayın. 1:1.000 seyreltmede %10 NaN₃ tamponu ekleyin.

2. Diseke yumurtalıklardan GV oositlerinin toplanması ve DSB'lerin indüksiyonu

NOT: Tüm aletler ve solüsyonlar steril olmalıdır. Oosit kullanımı, stereo mikroskop altında bir ağız pipeti kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu) ve tüm damlalar mineral yağ ile kaplanır (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1E).

1. Fareleri servikal çıkık ile itlaf etmeden 46-48 saat önce 7 uluslararası birim (IU) hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile farelere intraperitoneal olarak enjekte edin.
   NOT: Kullanılan tüm fareler 8-12 haftalık olmalıdır.
2. M2 kültür ortamını bir şırınga ve 0.2 μm'lik bir filtre ile filtreleyin ve oositleri faz I'de tutmak için 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpte (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 μM'lik bir nihai konsantrasyona IBMX 200 mM ekleyin. Daha sonra, plastik bir doku kültürü kabında M2-IBMX besiyeri damlaları hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve oosit izolasyonundan önce en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de sıcak bir blok üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). M2'yi 4 °C'de saklayın.
3. Fareleri servikal çıkık ile feda edin, yumurtalıkları inceleyin ve M2-IBMX ile 5 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
4. Yumurtalıkları 1.5 mL M2-IBMX içeren plastik bir kapağa aktarın, peri-yumurtalık yağ dokusunu veya fallop tüpü segmentlerini çıkarın ve 27 G'lik bir iğne ile yumurtalıkların mekanik perforasyonu ile COC'leri serbest bırakın (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1A-C).
5. COC'leri M2-IBMX damlaları (her biri yaklaşık 25-30 μL) içeren bir kültür kabına aktarın ve dar delikli bir cam Pasteur pipeti kullanarak tekrarlanan pipetleme yoluyla kümülüs hücrelerini çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1D).
6. SN GV aşamalı oositleri seçin ve bunları ışıktan korunan 37 ° C'de sıcak bir blok üzerinde bir damla (25 μL) M2-IBMX ortamına aktarın (Şekil 1F).
   1. Çekirdeklerin periferik olarak konumlandırıldığı NSN oositlerinin aksine, daha büyük boyutlarına ve merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdeklerine göre SN oositlerini arayın²¹. Her durumda, GV oosit tipi (SN veya NSN) hakkında nihai kararı vermeden önce DNA konfigürasyonunu konfokal mikroskop altında gözlemleyin.
7. Etoposid kullanarak DSB'leri indükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). GV aşamalı oositleri, karanlık koşullarda 37 ° C'de sıcak blok üzerinde 1 saat boyunca genotoksik ajanın damlalarına (her biri 25 μL) yerleştirin.
   NOT: Etoposit, DSB'leri DNA^22'ye tanıtan bir topoizomeraz II inhibitörüdür. Etoposidi oda sıcaklığında 20 mg / mL'lik 10 μL'lik alikotlarda ışıktan koruyun. Test edilen konsantrasyonlar 5 μg/mL, 20 μg/mL ve 50 μg/mL'dir.
8. GV evresi oositlerini uzun süre tutuklu tutmak için, oositleri 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde (Malzeme Tablosuna bakınız) 400 μM IBMX ile desteklenmiş M16 kültür ortamının damlalarına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin. M16'yı 4 °C'de saklayın, ortamı bir şırınga ve 0.2 μm filtre ile filtreleyin ve kullanmadan önce en az 1 saat inkübe edin.

Şekil 1: Oosit izolasyon işlemi . (A) Peri-overian yağ dokusunun ve artık fallop tüpü segmentlerinin M2 besiyerinde yumurtalıklardan IBMX ile çıkarılması. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen fotoğraf. Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) IBMX ile M2 ortamında izole yumurtalıklar. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 1 mm. (C) IBMX ile M2 ortamında 27 G iğne kullanılarak yumurtalıkların mekanik delinmesi. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 1 mm. (D) IBMX ile M2 ortamında perforasyon sonrası yumurtalıklardan salınan COC'ler. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) Ağız pipeti kullanılarak oosit toplama. (F) Çevredeki kümülüs hücrelerinin çıkarılmasından sonra, IBMX ile M2 ortamında denuded oositler. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Oosit fiksasyonu ve immünofloresan

NOT: Oosit kullanımı, stereo mikroskop altında bir ağız pipeti kullanılarak gerçekleştirilir ve tüm damlalar mineral yağ ile kaplanır.

1. Kontrol ve etoposid ile muamele edilmiş GV oositlerini oda sıcaklığında 40 dakika boyunca PFA-Tx-100 tamponlu farklı plastik doku kültürü kaplarına yerleştirin.
2. Oositleri oda sıcaklığında üç farklı damla yıkama tamponunda (her biri 50 μL) yıkayın. Yumurtaları her damlada 5 dakika bekletin.
3. Oositleri, 37 ° C'de sıcak bir blok üzerinde 1 saat boyunca bloke edici tampon damlalarına (her biri 25 μL) yerleştirin.
4. γH2AX'i (tavşan fosfo-Η2ΑΧ) (Ser139) tanıyan birincil antikoru hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) (stok çözelti: 1 mg / mL). Bloke edici tamponda 1:200 seyreltme kullanın ve oositleri gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor damlalarına (her biri 15 μL) yerleştirin.
   NOT: Fosfo-Η2ΑΧ (γH2AX), hem somatik hücrelerde hem de GV oositlerinde DSB'leri tespit etmek için yaygın bir belirteçtir^18,23.
5. Ertesi gün, yumurtaları oda sıcaklığında üç farklı damla yıkama tamponunda (her biri 50 μL) yıkayın. Yumurtaları her damlada 5 dakika bekletin.
6. İkincil antikoru, Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-tavşanını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) (stok çözelti: 2 mg / mL). Bloke edici tamponda 1:200 seyreltme kullanın ve oositleri 37 ° C'de ışıktan korunan sıcak bir blok üzerinde 1 saat boyunca ikincil antikor damlalarına (her biri 15 μL) yerleştirin.
7. Oositleri, yalnızca geçirgen hücrelerde DNA'yı boyayan çok kırmızı bir floresan DNA boyası olan DRAQ7 damlalarına (her biri 25 μL) aktarın (stok çözelti: 0.3 mM; Malzeme Tablosuna bakınız). Karanlık koşullarda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkama tamponunda 1:250 seyreltme kullanın.
8. Oositleri oda sıcaklığında üç farklı damla yıkama tamponunda (her biri 50 μL) yıkayın. Her damlada 5 dakika bekletin ve ardından konfokal mikroskopi için 35 mm'lik cam tabanlı bir Petri kabında (Malzeme Tablosuna bakınız) küçük damlalara (her biri yaklaşık 5 μL) yıkama tamponuna aktarın (Şekil 2A).
   NOT: Hem DNA boyasının hem de ikincil antikorun yıkanması aynı anda gerçekleştirilir.

4. Konfokal mikroskopi

NOT: Oositlerin cam tabanlı tabaklara yerleştirilmesinden sonra floresan yoğunluğundaki azalmayı önlemek için hemen konfokal mikroskopi yapılmalıdır. Motorlu bir aşamaya sahip bir konfokal mikroskoba ( Malzeme Tablosuna bakınız) erişim gereklidir.

1. Mikroskop kurulumu
   1. Konfokal sistemde, lazer denetleyiciyi, lazerleri, mikroskop denetleyiciyi, iletilen ışık için lambaları ve PC'yi açın (Şekil 2B, D).
   2. Konfokal yazılımı açın ve 40x yağ lensini seçin.
   3. Çanağı numune tutucuya yerleştirin ve joystick'i kullanarak sahneyi XY ve Z eksenlerinde hareket ettirerek oositlere odaklanmaya çalışın (Şekil 2C).
2. Oositlerin taranması
   1. Herhangi bir doygunluğu en aza indirmek için lazer gücünü, kazancı ve iğne deliği boyutunu her deney için bağımsız olarak ayarlayın.
   2. Her oosit için, ilgilenilen alanı, özellikle DNA bölgesindeki çekirdeğe ayarlayın. DNA alanının sınırlarını tanımlayın ve z adım boyutunu 3 μm olarak ayarlayın. Ardından, taramayı başlatın.
   3. Seçili klasördeki her hücre için görüntüleri kaydedin.
   4. Tarama tamamlandığında, yazılımdan çıkın, bilgisayarı kapatın ve lazer denetleyicisini, lazerleri, mikroskop denetleyicisini ve iletilen ışık için lambaları kapatın.

Şekil 2: Konfokal mikroskopi. (A) İmmünofloresan protokolü ve DNA boyaması yapıldıktan sonra, ayrı damla yıkama tamponunda, mineral yağ ile kaplanmış, cam tabanlı bir tabağa yerleştirilmiş ve konfokal mikroskopi görüntüleme için hazırlanmış sabit oositler. Her damla farklı bir deney kategorisi içerir. Stereo mikroskop göz mercekleri ile elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = yakınlaştırılmış kısım için 1 mm/100 μm. (B) Konfokal mikroskop tablasına yerleştirilmiş cam tabanlı plaka. (C) Konfokal mikroskopi ile elde edilen oositlerin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D) Konfokal mikroskopi sistemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Görüntüleme analizi

1. Fiji ImageJ-win64'ü tarayıcıya (https://imagej.net/software/fiji/downloads) indirin, açın ve verileri TIFF yığın dosyaları olarak içe aktarın.
   NOT: Her oosit dosyasını ayrı ayrı açın.
2. Resmin üzerine tıklayın | Renk | Tüm kanalları bölmek için Kanalları Böl.
3. LUT'a (Tabloya Bak) tıklayın ve her kanal için tercih edilen renkleri seçin.
4. Resmin üzerine tıklayın | Renk | γΗ2ΑΧ ve DNA kanallarını birleştirmek için Kanalları Birleştir. Brightfield kanalını birleştirmeden bırakın.
5. NSN oositlerinde ve düşük DNA hasarı olan SN oositlerinde, γΗ2ΑΧ DNA bölgesinde odaklar olarak tespit edilir. Bu durumda, " Çok noktalı" veya nokta komutuna tıklayın ve DNA ile çakışan her γΗ2ΑΧ odağını seçin. Tüm yığınlar için bu adımı yineleyin.
6. Yüksek düzeyde DNA hasarı olan SN oositlerinde, γΗ2ΑΧ sinyali tüm DNA bölgesi boyunca dağılır. Bu durumda, üzerine tıklayın Resim | Yığınlar | Z projesini seçin ve Freehand seçimleri komutuyla tüm DNA alanını seçin.
7. γΗ2ΑΧ floresansını ölçmek için Analiz Et | Ölçün ve ölçümleri bir .xlsx dosyasına kopyalayın. Ardından, ortalama floresansı hesaplayın, değerleri normalleştirin ve herhangi bir grafik oluşturmadan önce odak sayısını sayın.
8. Analiz Et'e tıklayın | Ölçeği ayarlamak için Ölçeği Ayarla ve ardından Analiz | Araçlar | Kanallara ölçek çubuğu eklemek için Ölçek çubuğu.

Sonuçlar

Burada gösterilen prosedür kullanılarak, fare yumurtalıkları diseke edildi, yağ çıkarıldı ve tamamen büyümüş GV evresi oositler toplandı. Daha sonra, kümülüs hücreleri dar bir pipet kullanılarak tekrarlayan pipetleme ile çıkarıldı ve taze M2-IBMX besiyeri damlalarına yerleştirildi ve sıcak bir blok (37 °C) üzerinde mineral yağ ile kaplandı (Şekil 1A-F). 20 mg/mL'lik bir stok etoposid konsantrasyonu kullanılarak üç farklı etoposid konsantrasyonu (5 μg/mL, 20 μg/mL ve 50 μg/mL) hazırlandı. GV evresi oositleri, mineral yağ ile kaplanmış ve 37 ° C'de ışıktan korunan damlalar halinde 1 saat boyunca üç farklı etoposid konsantrasyonuna yerleştirildi. Daha sonra protokol bölümünde ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi immünofloresan protokolü izlendi ve oositler cam tabanlı tabaklara yerleştirildi ve konfokal mikroskopi ile gözlendi (Şekil 2).

SN GV evresi oositlerinde, DNA hasarından hemen sonra, γH2AX varlığı tüm etoposid konsantrasyonlarında (5 μg / mL, 20 μg / mL ve 50 μg / mL) arttı ve γH2AX tüm DNA bölgesi boyunca dağıldı (Şekil 3). DSB miktar tayini ve tahmini, DNA bölgelerinde γH2AX floresan yoğunluğu gözlemlenerek gerçekleştirildi. γH2AX floresansı, artan etoposid konsantrasyonları ile orantılı olarak yoğunlaştı. Ayrıca, uzun süreli faz durmasından sonra (etoposid tedavisinden 20 saat sonra), GV evresi oositleri, γH2AX odaklarının sayısını ve yoğunluğunu azaltma kapasitesini gösterdi, bu da GV evresinde tutuklanan oositlerde aktif onarım süreçlerinin varlığını ima etti (Şekil 3E).

γH2AX floresansının DNA yoluyla dağıtıldığı SN oositlerinin aksine, NSN oositlerinde, γH2AX, 20 μg / mL'de etoposid ile tedaviden hemen sonra odaklarda gösterilmiştir. DNA alanıyla çakışan odakların sayısını tahmin ettik, her odağın floresansını hesapladık ve tüm oositlerin ortalama floresansını sunduk. Hem floresan hem de odak sayısı, iki oosit kategorisi arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi (Şekil 4).

Konfokal mikroskopi, farklı Z yığınlarındaki odakların sayısı ve yoğunluğu hakkında bilgi sağlar, böylece farklı zaman noktalarında DNA hasarının varlığını ve onarım dinamiklerini belirlemeye yardımcı olur. Galvano tarama, düşük arka plan ile hassas tarama ve tarama görüntülerinin daha iyi analiz edilmesini sağlar.

Şekil 3: Uzun süreli GV tutuklamasından sonra üç farklı etoposid konsantrasyonu ile tedavi edilen SN GV evresi oositlerinde γH2AX'in azaltılması. (A) etoposid tedavisinden 0 saat sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresansı. γH2AX, tüm etoposid konsantrasyonlarında maruziyetten hemen sonra artar ve artış konsantrasyona bağlıdır (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve parlaklık/kontrast Fiji / ImageJ kullanılarak her kanal için ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Farklı etoposid konsantrasyonları ile tedaviden 0 saat sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresan grafiği. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir), (ns = anlamlı değil, ** p < 0.005, **** p < 0.0001, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA).  (C) etoposid tedavisinden 20 saat sonra SN GV evresi oositlerde γH2AX floresansı. γH2AX, tüm etoposid konsantrasyonlarında maruz kaldıktan 20 saat sonra azalır (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve parlaklık/kontrast Fiji/ImageJ kullanılarak her kanal için ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) Farklı etoposid konsantrasyonları ile tedaviden 20 saat sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresan grafiği. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir), (ns = anlamlı değil, * p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.0005, **** p < 0.0001, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA).  (E) Etoposid ile tedavi edilen oositlerde profaz durmasından sonra SN GV evresi oositlerinde γH2AX floresan azalmasının çubuk grafiği. Her sütunun üzerindeki sayı, γH2AX floresansındaki düşüş yüzdesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: 20 μg/mL'de etoposid ile tedaviden sonra NSN GV evresi oositlerinde Η2ΑΧ'nin fosforilasyonu. (A) Bir kontrol NSN GV aşaması oositinin temsili konfokal görüntüleri (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve parlaklık/kontrast Fiji/ImageJ kullanılarak her kanal için ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Etoposid ile tedavi edilmiş bir NSN GV aşaması oositinin temsili konfokal görüntüleri (yeşil: γΗ2ΑΧ, macenta: DNA). Oositler etoposid tedavisinden 0 saat sonra tespit edildi. Görüntüler Z-yığını projeksiyonlarıdır ve Fiji/ImageJ kullanılarak her kanal için parlaklık/kontrast ayarlanmıştır. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) 20 μg / mL etoposid tedavisinden sonra NSN GV evresi oositlerinde normalleştirilmiş γΗ2ΑΧ floresansı. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta, iki bağımsız deneyden (**** p < 0.0001, eşlenmemiş parametrik olmayan t-testi, Mann-Whitney U-testi) alınan bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir). (D) 20 μg / mL etoposid tedavisinden sonra NSN GV evresi oositlerinde γΗ2ΑΧ odaklarının sayısı. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta, iki bağımsız deneyden (**** p < 0.0001, eşleştirilmemiş parametrik olmayan t-testi, Mann-Whitney U-testi) alınan bir oositi temsil eder (oosit sayısı grafikte gösterilmiştir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, memeli oositlerinde DSB'leri tespit ettik. Bu yöntem, oositlerdeki DNA onarım sürecinin saptanmasına ve incelenmesine izin verir. Aynı protokol, memeli oositlerinde fizyolojik süreçlere katılan diğer proteinleri analiz etmek için de kullanılabilir. İnsanlarda kadın subfertilitesinin nedenini daha iyi anlamak için oositlerin potansiyel DNA hasarına nasıl tepki verdiğini incelemek önemlidir.

Memeli oositlerinde DNA hasar tepkisini incelemek, oositlerin duyarlılığı nedeniyle zor olabilir. Oosit kullanımı, belirli sıcaklıklar ve CO₂ ve O₂ konsantrasyonları gerektirir. Aynı zamanda yumurtalar ışıktan korunmalıdır. Αll kullanımı, oositler için zararlı olabileceğinden, aynı zamanda ortamın seyrelmesine neden olabileceğinden ve dolayısıyla fiksasyon prosedürünü olumsuz etkileyebileceğinden, dar olmayan cam pipetler kullanılarak yapılmalıdır. Fiksasyonun her adımında, seyreltme etkisini en aza indirmek için birkaç damla tampon kullanılır. DSB'leri gözlemlemenin alternatif bir yolu Comet testi^24'tür. Bu teknik daha hassas olmasına rağmen daha karmaşıktır. Aynı zamanda, Comet tahlilini kullanarak, hasarın meydana geldiği DNA bölgesini tam olarak tespit etmek mümkün değildir ve GV evresi oositler²⁵ gibi bol miktarda RNA molekülüne sahip hücrelerde, arka plan arttırılabilir ve bu da yanlış bir DNA hasar sinyaline^{yol açabilir 26}.

Burada açıklanan immünofloresan protokolünü kullanarak, DSB'leri doğru bir şekilde tespit edebilir ve zaman içinde γH2AX floresansındaki azalma ile gösterildiği gibi GV evresi oositlerdeki onarım ilerlemesini tahmin edebiliriz. Bununla birlikte, bu yöntemin bir sınırlaması, bazı antikorların ooplazma boyunca spesifik olmayan dağılım gösterebilmesi ve böylece yüksek arka plan floresansına sahip görüntülere yol açabilmesidir. PFA-Tx-100 tamponu, daha az arka plan ve spesifik olmayan floresan tespitine izin vererek fiksasyon sürecini iyileştirdiğini gözlemlediğimiz için sıralı PFA ve Tx-100 yerine kullanılır. DSB tespiti için γH2AX kullanmanın ikinci bir sınırlaması, mayoz^{bölünme 23'te} γH2AX'in kendiliğinden fosforilasyonu nedeniyle GVBD'den sonra hasarın tahmin edilememesidir.

Bu immünofloresan protokolünde, oositler sıvı bir tamponda kalır ve slaytlar içinde saklanamaz. Bu gerçek, ikincil antikorun eklenmesinden sonra sabit hücrelerin günlerce korunmasını zorlaştırır. Kaliteli görüntüler elde etmek ve sinyal kaybı yaşamamak için sekonder antikor eklendikten sonra birkaç saat içinde görüntülemenin yapılması tercih edilir. Ayrıca, çekirdeklerin Z ekseni boyunca taranmasının, aşırı maruz kalma nedeniyle sinyalin zayıflamasına neden olabileceği de unutulmamalıdır. Bu nedenle, lazer gücünü azaltmak ve tarama hızını artırmak tercih edilir.

Son olarak, immünofloresan protokolünün bir diğer sınırlaması, sadece sabit/cansız hücreler için kullanılabilmesidir. Bu nedenle, konsantrasyonlarında herhangi bir dalgalanma olup olmadığını veya zaman içinde davranışlarında değişiklik olup olmadığını bilmeden, yalnızca belirli zaman noktalarında faktörlerin varlığını ve yokluğunu tahmin edebiliriz. Bu sorun, canlı hücre görüntüleme ve floresan etiketli belirteçler kullanılarak aşılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated	APTACA	1502
10 cc syringes	SoftCare	114.104.21
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab	Biotium	20012
Anti-phospho-H2A.X (Ser139)	Merck Millipore	07-164
ARE Heating Magnetic Stirrer	VELP Scientifica	F20500162
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes	BD Biosciences	352054
BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm	Becton Dickinson	300635
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	10735078001
DMSO Anhydrous	Biotium	90082
DRAQ7 DNA dye	BioStatus	DR71000
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378-25G
EMSURE MgCl2. 6H2O	Merck Millipore	1058330250
Etoposide	CHEMIPHARM	L01CB01
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes	Corning Science	532057
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style	Corning Science	353001
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147-25G
HERACELL 150i CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	50116048
IBMX powder	Sigma-Aldrich	I5879-100MG
Leica M125 Stereo Microscope	Leica Microsystems
M16 Medium	Sigma-Aldrich	M7292
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310
NaN3	Honeywell	13412H
NaOH	Merck Millipore	1064981000
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope	Nikon Corporation
Nikon SMZ800N Stereo Microscope	Nikon Corporation
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm	DURAN WHEATON KIMBLE	357335
pH/ORP meter	Hanna Instruments Ltd	HI2211
Phosphate buffered saline tablets	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851
PMSG Protein Lyophilised	Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology)	GWB-2AE30A (now OPPA01037)
QBD4 Dry block heater	Grant Instruments (Cambridge) Ltd	A25218
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters	GE Healthcare	6780-2502