طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولين لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع دون الحاجة إلى مرحلة سائلة خارجية.

Abstract

توفر شبكات الجينات الاصطناعية منصة للعلماء والمهندسين لتصميم وبناء أنظمة جديدة ذات وظائف مشفرة على المستوى الجيني. في حين أن النموذج السائد لنشر شبكات الجينات هو داخل الهيكل الخلوي ، يمكن أيضا نشر شبكات الجينات الاصطناعية في بيئات خالية من الخلايا. تشمل التطبيقات الواعدة لشبكات الجينات الخالية من الخلايا أجهزة الاستشعار الحيوية ، حيث تم إثبات هذه الأجهزة ضد الأهداف الحيوية (فيروسات الإيبولا وزيكا و SARS-CoV-2) واللاأحيائية (المعادن الثقيلة والكبريتيدات والمبيدات الحشرية والملوثات العضوية الأخرى). عادة ما يتم نشر الأنظمة الخالية من الخلايا في شكل سائل داخل وعاء التفاعل. ومع ذلك ، فإن القدرة على تضمين مثل هذه التفاعلات في مصفوفة مادية قد تسهل تطبيقها على نطاق أوسع في مجموعة أوسع من البيئات. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير طرق لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في مجموعة متنوعة من مصفوفات الهيدروجيل. واحدة من الخصائص الرئيسية للهلاميات المائية التي تفضي إلى هذا العمل هي قدرة إعادة تكوين المياه العالية لمواد الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك الهلاميات المائية خصائص فيزيائية وكيميائية مفيدة وظيفيا. يمكن تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد للتخزين وإعادة ترطيبها لاستخدامها لاحقا. يتم تقديم بروتوكولين خطوة بخطوة لإدراج وفحص تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية. أولا ، يمكن دمج نظام CFPS في هيدروجيل عن طريق الإماهة باستخدام محلول الخلية. يمكن بعد ذلك تحفيز النظام داخل الهيدروجيل أو التعبير عنه بشكل أساسي للتعبير الكامل عن البروتين من خلال الهيدروجيل. ثانيا ، يمكن إدخال محللة الخلية إلى هيدروجيل عند نقطة البلمرة ، ويمكن تجفيف النظام بأكمله بالتجميد وإعادة ترطيبه في وقت لاحق باستخدام محلول مائي يحتوي على محفز لنظام التعبير المشفر داخل الهيدروجيل. هذه الطرق لديها القدرة على السماح بشبكات الجينات الخالية من الخلايا التي تمنح القدرات الحسية لمواد الهيدروجيل ، مع إمكانية نشرها خارج المختبر.

Introduction

تدمج البيولوجيا التركيبية تخصصات هندسية متنوعة لتصميم وهندسة الأجزاء والأجهزة والأنظمة القائمة على أساس بيولوجي والتي يمكنها أداء وظائف غير موجودة في الطبيعة. لا تزال معظم مناهج البيولوجيا التركيبية مرتبطة بالخلايا الحية. على النقيض من ذلك ، تسهل أنظمة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مستويات غير مسبوقة من التحكم والحرية في التصميم ، مما يتيح زيادة المرونة وتقصير الوقت لهندسة الأنظمة البيولوجية مع القضاء على العديد من قيود طرق التعبير الجيني التقليدية القائمة على الخلايا^1،2،3. يتم استخدام CFPS في عدد متزايد من التطبيقات عبر العديد من التخصصات ، بما في ذلك بناء الخلايا ....

Protocol

1. خلية محللة العازلة وإعداد الوسائط

1. تحضير 2x YT + P أجار ومتوسطة
   1. تحضير 2x YT + P أجار عن طريق قياس 16 جم / لتر من التربتون ، و 10 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 40 مل / لتر 1 MK 2 HPO 4 ، و 22 مل / لتر 1 M KH₂PO₄ ، و 15 جم / لتر أجار. بالنسبة لمرق 2x YT + P ، اتبع التركيبة السابقة ولكن احذف الآجار.
   2. تعقيم عن طريق تعقيم 2x YT + P.
2. إعداد المخزن المؤقت S30A
   1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30A مع 5.88 جم / لتر من الغلوتامات Mg ، و 12.195 جم / L K-glutamate ، و 25 مل / لتر 2 M Tris ، معدلة على الرقم الهيدروجيني 7.7 مع حمض الأسيتيك.....

النتائج

يفصل هذا البروتوكول طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات الهيدروجيل ، مع الشكل 1 يقدم نظرة عامة تخطيطية على النهجين. كلتا الطريقتين قابلة للتجفيف بالتجميد والتخزين طويل الأجل. الطريقة أ هي المنهجية الأكثر استخداما لسببين. أولا ، لقد ثبت أنها الطريقة الأكثر قابلية للتطبيق .......

Discussion

فيما يلي بروتوكولان لدمج تفاعلات CFPS القائمة على تحلل خلايا الإشريكية القولونية في الهلاميات المائية للأغاروز. تسمح هذه الطرق بالتعبير الجيني المتزامن في جميع أنحاء المادة. يمكن تكييف البروتوكول مع أنظمة CFPS الأخرى وقد تم إجراؤه بنجاح باستخدام مجموعات CFPS المتاحة تجاريا بالإضافة إلى ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657