JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولين لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع دون الحاجة إلى مرحلة سائلة خارجية.

Abstract

توفر شبكات الجينات الاصطناعية منصة للعلماء والمهندسين لتصميم وبناء أنظمة جديدة ذات وظائف مشفرة على المستوى الجيني. في حين أن النموذج السائد لنشر شبكات الجينات هو داخل الهيكل الخلوي ، يمكن أيضا نشر شبكات الجينات الاصطناعية في بيئات خالية من الخلايا. تشمل التطبيقات الواعدة لشبكات الجينات الخالية من الخلايا أجهزة الاستشعار الحيوية ، حيث تم إثبات هذه الأجهزة ضد الأهداف الحيوية (فيروسات الإيبولا وزيكا و SARS-CoV-2) واللاأحيائية (المعادن الثقيلة والكبريتيدات والمبيدات الحشرية والملوثات العضوية الأخرى). عادة ما يتم نشر الأنظمة الخالية من الخلايا في شكل سائل داخل وعاء التفاعل. ومع ذلك ، فإن القدرة على تضمين مثل هذه التفاعلات في مصفوفة مادية قد تسهل تطبيقها على نطاق أوسع في مجموعة أوسع من البيئات. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير طرق لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في مجموعة متنوعة من مصفوفات الهيدروجيل. واحدة من الخصائص الرئيسية للهلاميات المائية التي تفضي إلى هذا العمل هي قدرة إعادة تكوين المياه العالية لمواد الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك الهلاميات المائية خصائص فيزيائية وكيميائية مفيدة وظيفيا. يمكن تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد للتخزين وإعادة ترطيبها لاستخدامها لاحقا. يتم تقديم بروتوكولين خطوة بخطوة لإدراج وفحص تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية. أولا ، يمكن دمج نظام CFPS في هيدروجيل عن طريق الإماهة باستخدام محلول الخلية. يمكن بعد ذلك تحفيز النظام داخل الهيدروجيل أو التعبير عنه بشكل أساسي للتعبير الكامل عن البروتين من خلال الهيدروجيل. ثانيا ، يمكن إدخال محللة الخلية إلى هيدروجيل عند نقطة البلمرة ، ويمكن تجفيف النظام بأكمله بالتجميد وإعادة ترطيبه في وقت لاحق باستخدام محلول مائي يحتوي على محفز لنظام التعبير المشفر داخل الهيدروجيل. هذه الطرق لديها القدرة على السماح بشبكات الجينات الخالية من الخلايا التي تمنح القدرات الحسية لمواد الهيدروجيل ، مع إمكانية نشرها خارج المختبر.

Introduction

تدمج البيولوجيا التركيبية تخصصات هندسية متنوعة لتصميم وهندسة الأجزاء والأجهزة والأنظمة القائمة على أساس بيولوجي والتي يمكنها أداء وظائف غير موجودة في الطبيعة. لا تزال معظم مناهج البيولوجيا التركيبية مرتبطة بالخلايا الحية. على النقيض من ذلك ، تسهل أنظمة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مستويات غير مسبوقة من التحكم والحرية في التصميم ، مما يتيح زيادة المرونة وتقصير الوقت لهندسة الأنظمة البيولوجية مع القضاء على العديد من قيود طرق التعبير الجيني التقليدية القائمة على الخلايا1،2،3. يتم استخدام CFPS في عدد متزايد من التطبيقات عبر العديد من التخصصات ، بما في ذلك بناء الخلايا الاصطناعية ، والنماذج الأولية للدوائر الجينية ، وتطوير أجهزة الاستشعار الحيوية ، وإنتاج المستقلبات4،5،6. كان CFPS مفيدا أيضا بشكل خاص لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي لا يمكن التعبير عنها بسهولة في الخلايا الحية ، مثل البروتينات المعرضة للتجميع والبروتينات عبر الغشاء والبروتينات السامة6،7،8.

عادة ما يتم تنفيذ CFPS في التفاعلات السائلة. ومع ذلك ، قد يحد هذا من نشرها في بعض الحالات ، حيث يجب احتواء أي جهاز خال من الخلايا السائلة داخل وعاء تفاعل. كان الأساس المنطقي لتطوير الأساليب المعروضة هنا هو توفير بروتوكولات قوية لدمج أجهزة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية ، ليس كمنصة لإنتاج البروتين في حد ذاتها ، ولكن بدلا من ذلك ، للسماح باستخدام الهلاميات المائية كهيكل مادي لنشر الأجهزة الخالية من الخلايا خارج المختبر. استخدام الهلاميات المائية كهيكل CFPS له العديد من المزايا. الهلاميات المائية هي مواد بوليمرية ، على الرغم من ارتفاع نسبة الماء (التي تزيد أحيانا عن 98٪) ، إلا أنها تمتلك خصائص صلبة9،10،11. لها استخدامات كمعاجين ومواد تشحيم ومواد لاصقة وهي موجودة في منتجات متنوعة مثل العدسات اللاصقة وضمادات الجروح والأشرطة اللاصقة البحرية ومحسنات التربة وحفاضات الأطفال9،11،12،13،14. الهلاميات المائية هي أيضا قيد التحقيق النشط كمركبات توصيل المخدرات9،15،16،17. قد تكون الهلاميات المائية أيضا متوافقة حيويا وقابلة للتحلل البيولوجي وتمتلك بعض استجابات المحفزات الخاصة بها9،18،19،20. لذلك ، فإن الهدف هنا هو خلق تآزر بين الوظائف المشتقة من البيولوجيا الجزيئية وعلوم المواد. تحقيقا لهذه الغاية ، بذلت جهود لدمج البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مع مجموعة من المواد ، بما في ذلك الكولاجين ، اللابونيت ، بولي أكريلاميد ، الفيبرين ، ببتيد PEG ، والأغاروز 11،21،22 ، وكذلك لتغطية أسطح الزجاج والورق والقماش11،23،24 مع أجهزة CFPS. توضح البروتوكولات المعروضة هنا طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع (أي >1 مم) ، باستخدام الأغاروز كمادة نموذجية. تم اختيار الأغاروز بسبب قدرته العالية على امتصاص الماء ، وخصائص التبلور الذاتي الخاضعة للرقابة ، والخصائص الميكانيكية القابلة للضبط11،24،25،26. يدعم Agarose أيضا CFPS الوظيفي ، وهو أرخص من العديد من بدائل الهيدروجيل الأخرى ، وهو قابل للتحلل البيولوجي ، مما يجعله خيارا جذابا كنظام نموذجي تجريبي. ومع ذلك ، فقد تم إثبات هذه الطرق سابقا على أنها مناسبة لتضمين CFPS في مجموعة من الهلاميات المائيةالبديلة 11. بالنظر إلى المجموعة الواسعة من تطبيقات الهلاميات المائية ووظائف CFPS ، يمكن أن توفر الطرق الموضحة هنا أساسا يمكن للباحثين من خلاله تطوير مواد هيدروجيل محسنة بيولوجيا تناسب غاياتهم الخاصة.

في الدراسات السابقة ، تم استخدام أنظمة microgel ذات نطاق حجم من 1 ميكرومتر إلى 400 ميكرومتر لأداء CFPS في الهلاميات المائية المغمورة في مخزن التفاعل23،27،28،29،30،31. غير أن اشتراط غمر الهلاميات المائية داخل مخازن تفاعل CFPS يحد من فرص نشرها كمواد في حد ذاتها. تسمح البروتوكولات المقدمة هنا بحدوث تفاعلات CFPS داخل الهلاميات المائية دون الحاجة إلى غمر المواد الهلامية في مخازن التفاعل. ثانيا ، يسمح استخدام المواد الهلامية الكبيرة (بين 2 مم و 10 مم في الحجم) بدراسة التفاعل الفيزيائي بين الهلاميات المائية والتعبير الجيني الخالي من الخلايا. على سبيل المثال ، باستخدام هذه التقنية ، من الممكن دراسة كيفية تأثير مصفوفة الهيدروجيل على تفاعلات CFPS11 وكيف يمكن أن تؤثر تفاعلات CFPS على مصفوفة الهيدروجيل31. تسمح الأحجام الأكبر من الهلاميات المائية أيضا بتطوير مواد جديدة قابلة للبرمجة الحيوية32. أخيرا ، من خلال تضمين تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية ، هناك أيضا انخفاض محتمل في متطلبات أوعية التفاعل البلاستيكية. لنشر أجهزة الاستشعار الخالية من الخلايا ، فإن هذا له مزايا واضحة على الأجهزة التي تعتمد على الأدوات البلاستيكية. مجتمعة ، يوفر تضمين تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية العديد من المزايا لنشر الأجهزة الخالية من الخلايا خارج المختبر.

الهدف العام من الطرق المعروضة هنا هو السماح بتشغيل تفاعلات CFPS داخل مصفوفات الهيدروجيل. تم عرض طريقتين مختلفتين لتضمين تفاعلات إنتاج البروتين الخالية من الخلايا في مواد هيدروجيل واسعة النطاق (الشكل 1). في الطريقة أ ، يتم إدخال مكونات CFPS إلى الهلاميات المائية الأغاروز المجففة بالتجميد لتشكيل نظام نشط. في الطريقة ب ، يتم خلط الأغاروز المنصهر مع مكونات تفاعل CFPS لتشكيل نظام هيدروجيل CFPS كامل ، والذي يتم تجفيفه بالتجميد وتخزينه لحين الحاجة. يمكن إعادة إماهة هذه الأنظمة بحجم من الماء أو المخزن المؤقت وتحليلها لبدء التفاعل.

تستخدم هذه الدراسة الأنظمة القائمة على تحلل الخلايا الإشريكية القولونية. هذه بعض أنظمة CFPS التجريبية الأكثر شيوعا ، حيث أن تحضير محلول خلايا الإشريكية القولونية بسيط وغير مكلف ويحقق غلات عالية من البروتين. تستكمل محللة الخلية بالمكونات الجزيئية الكبيرة اللازمة لإجراء النسخ والترجمة ، بما في ذلك الريبوسومات ، والحمض النووي الريبوزي الناقل (tRNAs) ، وتخليق أمينواسيل-الحمض النووي الريبي ، وعوامل البدء والاستطالة والإنهاء. على وجه التحديد ، توضح هذه الورقة إنتاج eGFP و mCherry في الهلاميات المائية للأغاروز باستخدام خلايا الإشريكية القولونية المحللة وتراقب ظهور التألق باستخدام قارئ الألواح والمجهر متحد البؤر. يمكن رؤية النتائج التمثيلية لقارئ لوحة المعايرة الدقيقة في Whitfield et al.31 ، والبيانات الأساسية متاحة للجمهور 33. علاوة على ذلك ، يتم تأكيد التعبير عن البروتينات الفلورية في جميع أنحاء المواد الهلامية باستخدام المجهر متحد البؤر. يسمح البروتوكولان الموضح في هذه الورقة بتجميع وتخزين الأجهزة الجينية القائمة على CFPS في المواد بهدف نهائي يتمثل في خلق بيئة مادية مناسبة لتوزيع دوائر الجينات الخالية من الخلايا بطريقة تدعم النشر الميداني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خلية محللة العازلة وإعداد الوسائط

  1. تحضير 2x YT + P أجار ومتوسطة
    1. تحضير 2x YT + P أجار عن طريق قياس 16 جم / لتر من التربتون ، و 10 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 40 مل / لتر 1 MK 2 HPO 4 ، و 22 مل / لتر 1 M KH2PO4 ، و 15 جم / لتر أجار. بالنسبة لمرق 2x YT + P ، اتبع التركيبة السابقة ولكن احذف الآجار.
    2. تعقيم عن طريق تعقيم 2x YT + P.
  2. إعداد المخزن المؤقت S30A
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30A مع 5.88 جم / لتر من الغلوتامات Mg ، و 12.195 جم / L K-glutamate ، و 25 مل / لتر 2 M Tris ، معدلة على الرقم الهيدروجيني 7.7 مع حمض الأسيتيك.
    2. قم بتخزين المخزن المؤقت S30A عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
  3. إعداد المخزن المؤقت S30B
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت S30B مع 5.88 جم / لتر من الغلوتامات Mg ، و 12.195 جم / L K-glutamate ، معدلة على الرقم الهيدروجيني 8.2 مع 2 M Tris.
    2. قم بتخزين المخزن المؤقت S30B عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.

2. تحضير محلول الخلية (بروتوكول 4 أيام)

  1. اليوم 1
    1. صب 2x YT + P في ألواح أجار مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
    2. قم بخط الإشريكية القولونية من -80 درجة مئوية من مخزون الجلسرين ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  2. اليوم 2
    1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من لوحة 2x YT + P في 400 مل من مرق 2x YT + P (مكمل بالأمبيسلين) في قارورة محيرة سعة 1 لتر.
    2. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 220 دورة في الدقيقة.
  3. اليوم 3
    1. قياس وتسجيل OD600 من الثقافات 24 ساعة ؛ النمو كاف عندالتوجيه التنظيمي 600 من 3-4.
      ملاحظة: خذ حصة 1 مل من المزرعة البكتيرية ، وقم بإجراء تخفيف تسلسلي باستخدام مرق متوسط (2x YT + P) قبل قياس OD600 نانومتر. السماح لتأثير التخفيف عند حساب OD600.
    2. انقل المستنبتة بالتساوي بين زجاجات الطرد المركزي المبردة مسبقا سعة 500 مل.
    3. جهاز طرد مركزي عند 4500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية.
    4. أثناء الطرد المركزي ، أكمل إعداد المخزن المؤقت S30A بإضافة 2 مل / لتر من 1 M DTT إلى المخزن المؤقت S30A المعد مسبقا ، والخلط ، والحفاظ على المخزن المؤقت على الجليد.
    5. أعد تعليق كريات الخلية في 200 مل من المخزن المؤقت S30A.
    6. دوامة الزجاجات بقوة حتى تذوب الحبيبات بالكامل تماما ، مع الحفاظ على الخلايا على الجليد قدر الإمكان.
    7. جهاز طرد مركزي عند 4500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية.
    8. كرر الخطوات من 2-3-5 إلى 2-3-7 (ضمنا).
    9. أضف 40 مل من المخزن المؤقت S30A إلى كل زجاجة طرد مركزي ، وأعد تعليق الكريات ، وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 50 مل التي تم وزنها مسبقا.
    10. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وقم بإزالة المادة الطافية المتبقية بواسطة ماصة ، مع الاحتفاظ بها على الجليد قدر الإمكان.
    11. أعد وزن أنابيب الطرد المركزي ، وسجل الكتلة الجديدة ، واحسب كتلة الكريات.
    12. تجميد الكريات في النيتروجين السائل, وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. اليوم 4
    1. ذوبان الكريات على الجليد.
    2. لكل 1 غرام من الحبيبات ، أضف ما يلي: 1.2 مل من المخزن المؤقت S30A (تمت إضافة DTT قبل الاستخدام) ، و 275 ميكرولتر من مثبطات الأنزيم البروتيني (مخزون 8 مللي مول) ، و 25 ميكرولتر من الليزوزيم (مخزون 10 مجم / مل).
    3. دوامة بقوة حتى تذوب الكريات تماما مع عدم وجود كتل متبقية ، مع الاحتفاظ بها على الجليد قدر الإمكان.
    4. في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل ، صوتنة تعليق الخلية عند 120 واط ، 20 كيلو هرتز ، سعة 30٪ ، ونبضات تشغيل / إيقاف 20 ثانية / 40 ثانية لمدة 5 دقائق من صوتنة.
    5. أجهزة طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية لتكسير حطام الخلية.
    6. نقل الطافي إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 50 مل.
    7. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 80 دقيقة.
    8. قم بإعداد مواد غسيل الكلى عن طريق إضافة 1 مل / لتر من 1 M DTT إلى المخزن المؤقت S30B. امزج وأضف 900 مل إلى دورق معقم سعة 1 لتر. أضف محرك مغناطيسي ، واحتفظ به عند 4 درجات مئوية.
    9. بعد تفاعل الجريان السطحي ، انقل مستخلص الخلية من الخطوة 2.4.7 إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل ، وأجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    10. قم بدمج المادة الطافية الخالية من الحبيبات على الجليد في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    11. تحديد الحجم الكلي لمستخلص الخلايا المنتجة ، وترطيب العدد اللازم من أشرطة غسيل الكلى 10K MWCO عن طريق غمرها في S30B لمدة 2 دقيقة.
    12. قم بتحميل الكاسيت عبر حقنة تحتوي على ما يصل إلى 3 مل من المستخلص. قم بغسيل ما يصل إلى ثلاث أشرطة لكل دورق سعة 1 لتر مع التحريك عند 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات.
    13. بعد اكتمال غسيل الكلى ، الذي يوضح المستخلص ، انقل المستخلص إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 2 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    14. دمج المستخلص الموضح في أنبوب طرد مركزي جديد على الجليد ، ودوامة لفترة وجيزة للخلط.
    15. تحديد تركيز البروتين من استخراج باستخدام مقياس الفلور.
    16. خفف المستخلص إلى تركيز 44.5 ملغم/مل باستخدام ddH2O المبرد مسبقا.
    17. القسمة إلى 200 ميكرولتر من القسامة، وتجميدها في النيتروجين السائل، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

3. تحضير الهلاميات المائية المجففة بالتجميد (الطريقة أ)

  1. قم بوزن 0.75 جم من الأغاروز ، وأضف ddH2O إلى حجم 100 مل ، وقم بالميكروويف في رشقات نارية لمدة 30 ثانية في درجات حرارة عالية لإنشاء مخزون الأغاروز المنصهر.
  2. باستخدام ماصة ، انقل 50 ميكرولتر من الأغاروز المنصهر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، واسمح للهلام بالبلمرة لمدة 20-30 دقيقة (تحدث البلمرة بشكل أسرع إذا تم نقل المواد الهلامية إلى الثلاجة).
  3. قم بتجميد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، التي تحتوي على المواد الهلامية المبلمرة ، في النيتروجين السائل.
  4. قم بإزالة غطاء أنابيب الطرد المركزي ، وقم بتغطية فتحات أنبوب الطرد المركزي بغشاء شمعي ، واخترق الفيلم عدة مرات بإبرة أو طرف ماصة.
  5. نقل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على المواد الهلامية المبلمرة إلى -80 درجة مئوية تخزين لمدة 1-2 ساعة.
  6. استرجع أنابيب الطرد المركزي من التخزين -80 درجة مئوية ، وضعها في مجفف تجميد ، مع التأكد من جفاف الأنابيب تماما.
  7. قم بإشراك مجفف التجميد بالإعدادات التالية: درجة الحرارة: -20 درجة مئوية ، الضغط: 0.1 ملي بار.
  8. اترك الجل ليتجمد حتى يجف طوال الليل.
  9. استرجع المواد الهلامية من مجفف التجميد ، وضعها في تخزين -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
    ملاحظة: يمكن تخزين المواد الهلامية المجففة بالتجميد لمدة تصل إلى 1 سنة.

4. إعداد مخزون حل الطاقة 14x

  1. اجمع جميع مكونات التفاعل (الجدول 1) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل على الجليد لإنتاج محلول طاقة 14x.
  2. قم بقسمة محلول الطاقة 14x في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل ، وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية (يمكن استخدام قسمة أصغر حجما).
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول الطاقة 14x لعدة أشهر عند -80 درجة مئوية إذا تم تجنب التجميد والذوبان المتكرر للأنابيب.

5. إعداد مخزون الأحماض الأمينية 4x

  1. قم بإذابة الجليد ، جميع مكونات الأحماض الأمينية البالغ عددها 20 مكونا لمجموعة عينات الأحماض الأمينية RTS. دوامة الأحماض الأمينية لضمان إذابتها تماما.
  2. في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، امزج جميع الأحماض الأمينية العشرين ، وأضف 12 مل من ddH2O. Vortex المعقم حتى يصبح المحلول واضحا ، مع ضباب طفيف فقط من اللون الأبيض.
  3. قسمة الأحماض الأمينية 4x في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل (500 ميكرولتر من القسامة).
  4. قم بتجميد حصص محلول الأحماض الأمينية 4x في النيتروجين السائل ، وانقل الحصصات إلى تخزين -80 درجة مئوية.

6. معايرة العازلة الخالية من الخلايا

ملاحظة: تمت معايرة المخزن المؤقت CFPS المستخدم في تفاعلات الهيدروجيل للحصول على تركيزات DTT و Mg-glutamate و K-glutamate المثلى وفقا للبروتوكول في Banks et al.34 المعدل من Sun et al.35. تم اختيار تركيبات تفاعل المعايرة باستخدام طريقة تصميم التجارب (DOE) ، مع اختيار سبعة مستويات عوامل ل K-glutamate (200 mM ، 400 mM ، 600 mM ، 1,000 mM ، 1,200 mM ، 1,400 mM) ، Mg-glutamate (0 mM ، 10 mM ، 20 mM ، 30 mM ، 40 mM ، 50 mM ، 60 mM) ، و DTT (0 mM ، 5 ، 10 mM ، 15 mM ، 20 مللي مول ، 25 مللي مول ، 30 مللي مول) الأسهم. تم استخدام JMP Pro 15 لإنشاء تصميم DOE مخصص (الجدول 2) وإجراء التحليل لتحديد تركيزات العوامل المثلى.

  1. استرجع المستخلص الخالي من الخلايا من التخزين -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الجليد.
  2. قم بإذابة 4x من الأحماض الأمينية ، ومحلول الطاقة 14x ، و 40٪ PEG-8000 ، والحمض النووي البلازميد ، و 3 M K-glutamate ، و 100 mM Mg-glutamate ، و 100 mM DTT على الجليد.
  3. قم بإنشاء مزيج رئيسي للمعايرة من خلال الجمع بين 12.5 ميكرولتر من الأحماض الأمينية 4x ، و 3.57 ميكرولتر من محلول الطاقة 14x ، و 2.5 ميكرولتر من 40٪ PEG-8000 ، و 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ، و 10 ميكرولتر من المستخلص الخالي من الخلايا (44.5 مجم / مل) ، وتكوين ما يصل إلى 35 ميكرولتر لكل تفاعل مع ddH2O.
  4. قم بتوزيع 35 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في آبار لوحة معايرة دقيقة سوداء ذات 384 بئرا.
  5. باتباع تصميم DOE ، أضف الحجم المناسب من Mg-glutamate و K-glutamate و DTT إلى كل تفاعل ، جنبا إلى جنب مع ddH2O لجعل كل تفاعل يصل إلى 50 ميكرولتر.
  6. انقل لوحة المعايرة الدقيقة إلى قارئ لوحة للكشف عن التألق وتحليله باستخدام إعدادات قارئ اللوحة الموضحة (ل mCherry): الإثارة: 587 نانومتر ، الانبعاث: 610 نانومتر ، عرض النطاق الموجي: 12 نانومتر ، البصريات: أعلى ، درجة الحرارة: 37 درجة مئوية ، مع جمع قراءات مضان كل 5 دقائق لمدة 4 ساعات من إجمالي وقت القراءة. احتضان لوحات مع الاهتزاز على إعداد نابض في 60 دورة في الدقيقة.
  7. تحميل النتائج في تصميم JMP DOE ، وإنشاء ملف تعريف تنبؤ لتحديد مستويات التركيز المثلى ل K-glutamate و Mg-glutamate و DTT بناء على متغيرات الاستجابة المرغوبة ؛ في هذه الحالة ، كان الحد الأقصى للتألق ومعدل التفاعل متغيرات الاستجابة.
  8. الجمع بين الكواشف كما هو موضح في الجدول 3 لإنشاء المخزن المؤقت 2X CFPS
  9. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية

7. CFPS في الهلاميات المائية المجففة بالتجميد المعاد ترطيبها (الطريقة أ)

ملاحظة: تم إنشاء البلازميدات المستخدمة في تفاعلات CFPS باستخدام مكونات من مجموعة أدوات EcoFlex المعيارية للإشريكية القولونية36 وتم وصفها في Whitfield et al.11 كان mCherry و eGFP تحت سيطرة المروج JM23100 التأسيسي. هذه المكونات متوفرة من Addgene.

  1. استرجع المستخلص الخالي من الخلايا من التخزين -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج لمدة 20 دقيقة تقريبا.
  2. جمع 2x CFPS العازلة والحمض النووي البلازميد ، وذوبان الجليد.
  3. اجمع الهلاميات المائية المجففة بالتجميد ، واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة عن طريق ترك المواد الهلامية تقف على المقعد.
  4. نقل المواد الهلامية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل ، وتقليم المواد الهلامية بمشرط إذا لزم الأمر لجعلها مناسبة في الآبار.
  5. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، اجمع بين 10 ميكرولتر من المستخلص الخالي من الخلايا مع 25 ميكرولتر من 2x CFPS buffer و 4 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ؛ تكوين حجم إجمالي يصل إلى 50 ميكرولتر مع ddH2O لإنشاء حل CFPS.
  6. ماصة محلول CFPS على الهلاميات المائية المجففة بالتجميد.
  7. اترك المواد الهلامية تنقع في نظام CFPS لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. انقل المواد الهلامية إلى صفيحة عيار ميكرو سوداء ذات 384 بئرا باستخدام ملعقة.
  9. انقل لوحة المعايرة الدقيقة إلى قارئ لوحة للكشف عن التألق وتحليله باستخدام إعدادات قارئ اللوحة الموضحة في الخطوة 6.6. النتائج التمثيلية متوفرة في الدراسات السابقة31,33.

8. تخليق البروتين الخالي من الخلايا في الهلاميات المائية القابلة للنشر (الطريقة ب)

  1. استرجع المستخلص الخالي من الخلايا من التخزين -80 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج لمدة 20 دقيقة تقريبا.
  2. جمع الحمض النووي البلازميد ، وذوبان الجليد.
  3. في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل على الجليد ، ادمج 10 ميكرولتر من المستخلص الخالي من الخلايا مع 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد و 25 ميكرولتر من 2x CFPS buffer ، مما يجعل الحجم الإجمالي 37.5 ميكرولتر.
  4. قم بقياس 3 جم من الأغاروز ، وأضفه إلى 100 مل من المخزن المؤقت ddH2O لإنشاء 3٪ أغاروز.
  5. الميكروويف 3 ٪ agarose في رشقات نارية 30 ثانية في قوة عالية.
  6. ماصة 12.5 ميكرولتر من الأغاروز المنصهر في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل تحتوي على مزيج CFPS إلى حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر.
  7. اترك الأغاروز المنصهر يبرد ، ولكن لا يتبلمر ، تاركا الأغاروز في كتلة حرارية مضبوطة على 50 درجة مئوية.
  8. الجمع بين الأغاروز المنصهر مع محلول CFPS ؛ امزج عن طريق السحب والتحريك مع الطرف ، وتأكد من التحرك بسرعة لتجنب بلمرة الجل قبل خلط محلول CFPS.
  9. اترك المواد الهلامية لتبرد في درجة حرارة الغرفة وتبلمر لمدة 2 دقيقة تقريبا.
  10. نقل الأغاروز المبلمر إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل مع ملعقة ، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  11. ضع الهلاميات المائية المجمدة في تخزين -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  12. استعادة المواد الهلامية من التخزين ؛ قم بإزالة أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، وقم بتغطية الأنابيب بغشاء شمعي ، واخترق الفيلم للسماح بتجفيف الرطوبة.
  13. قم بإشراك مجفف التجميد بالإعدادات التالية: درجة الحرارة: -20 درجة مئوية ، الضغط: 0.1 ملي بار ، تجفيف بالتجميد لمدة 18 ساعة (طوال الليل).
  14. قم بتخزين أجهزة CFPS المجففة بالتجميد في تخزين -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  15. يمكن إعادة ترطيب أجهزة CFPS المجففة بالتجميد ، بحجم رطب تقريبي يبلغ 50 ميكرولتر ، باستخدام 50 ميكرولتر من ddH2O بدون سائل زائد. تستغرق عملية الإماهة حوالي 30 دقيقة.
  16. انقل المواد الهلامية إلى صفيحة عيار ميكرو سوداء ذات 384 بئرا باستخدام ملعقة.
  17. انقل لوحة المعايرة الدقيقة إلى قارئ لوحة للكشف عن التألق وتحليله باستخدام إعدادات قارئ اللوحة الموضحة في الخطوة 6.6. النتائج التمثيلية متاحة في المنشورات السابقة31,33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يفصل هذا البروتوكول طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات الهيدروجيل ، مع الشكل 1 يقدم نظرة عامة تخطيطية على النهجين. كلتا الطريقتين قابلة للتجفيف بالتجميد والتخزين طويل الأجل. الطريقة أ هي المنهجية الأكثر استخداما لسببين. أولا ، لقد ثبت أنها الطريقة الأكثر قابلية للتطبيق ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

فيما يلي بروتوكولان لدمج تفاعلات CFPS القائمة على تحلل خلايا الإشريكية القولونية في الهلاميات المائية للأغاروز. تسمح هذه الطرق بالتعبير الجيني المتزامن في جميع أنحاء المادة. يمكن تكييف البروتوكول مع أنظمة CFPS الأخرى وقد تم إجراؤه بنجاح باستخدام مجموعات CFPS المتاحة تجاريا بالإضافة إلى ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

اي.

Acknowledgements

يقر المؤلفون تقديرا كبيرا بدعم جوائز مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية BB / V017551 / 1 (S.K. ، T.P.H.) و BB / W01095X / 1 (A.L. ، T.P.H.) ، ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية - جائزة مختبرات علوم وتكنولوجيا الدفاع EP / N026683 / 1 (C.J.W. ، A.M.B. ، T.P.H.). البيانات التي تدعم هذا المنشور متاحة علنا على: 10.25405/data.ncl.22232452. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص المشاع الإبداعي (CC BY) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف ناشئة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853(2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248(2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958(2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702(2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580(2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429(2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261(2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188(2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357(2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050(2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64(2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407(2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105(2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785(2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150(2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165(2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163(2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196 CFPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved