マクロスケールハイドロゲルへの無細胞タンパク質合成反応の埋め込み法

要約

ここでは、外液相を必要とせずに、無細胞タンパク質合成反応をマクロスケールのヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つのプロトコルを紹介します。

要約

合成遺伝子ネットワークは、科学者やエンジニアが遺伝子レベルでエンコードされた機能を備えた新しいシステムを設計および構築するためのプラットフォームを提供します。遺伝子ネットワークの展開のための支配的なパラダイムは細胞シャーシ内にありますが、合成遺伝子ネットワークは無細胞環境でも展開できます。無細胞遺伝子ネットワークの有望な用途には、バイオセンサーが含まれ、これらのデバイスは生物(エボラ、ジカ、およびSARS-CoV-2ウイルス)および非生物的(重金属、硫化物、農薬、およびその他の有機汚染物質)の標的に対して実証されています。無細胞システムは通常、反応容器内に液体の形で展開されます。しかし、このような反応を物理マトリックスに埋め込むことができれば、より広い環境でのより広範な適用が容易になる可能性があります。この目的のために、無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を様々なヒドロゲルマトリックスに組み込む方法が開発されている。この作業に役立つヒドロゲルの重要な特性の1つは、ヒドロゲル材料の高い水再構成能力です。さらに、ヒドロゲルは、機能的に有益な物理的および化学的特性を有する。ヒドロゲルは、貯蔵のために凍結乾燥し、後で使用するために再水和することができる。ヒドロゲルにCFPS反応を含めることとアッセイするための2つの段階的なプロトコルが提示されます。まず、CFPSシステムは、細胞ライセートによる再水和 を介して ヒドロゲルに組み込むことができます。次いで、ヒドロゲル内の系を構成的に誘導または発現させて、ヒドロゲルを介した完全なタンパク質発現を得ることができる。第2に、細胞ライセートを重合時点でヒドロゲルに導入することができ、システム全体を凍結乾燥し、ヒドロゲル内にコードされた発現系の誘導物質を含む水溶液で後で再水和することができる。これらの方法は、ヒドロゲル材料に感覚能力を付与する無細胞遺伝子ネットワークを可能にする可能性があり、実験室を超えて展開する可能性があります。

概要

合成生物学は、多様な工学分野を統合して、自然界には見られない機能を実行できる生物学的ベースの部品、デバイス、およびシステムを設計およびエンジニアリングします。ほとんどの合成生物学のアプローチは、依然として生細胞に結びついています。対照的に、無細胞合成生物学システムは、前例のないレベルの制御と設計の自由度を促進し、従来の細胞ベースの遺伝子発現法の制約の多くを排除しながら、生物学的システムのエンジニアリングの柔軟性を高め、時間を短縮します^1,2,3。CFPSは、人工細胞の構築、遺伝子回路のプロトタイピング、バイオセンサーの開発、代謝物の生成など、多くの分野でますます多くのアプリケーションで使用されています^4,5,6。CFPSは、凝集しやすいタンパク質、膜貫通タンパク質、毒性タンパク質など、生細胞では容易に発現できない組換えタンパク質の産生にも特に有用です^6,7,8。

プロトコル

1. 細胞ライセートバッファーおよび培地調製

1. 2x YT+P寒天培地の調製
   1. 16 g/L トリプトン、10 g/L 酵母エキス、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K 2 HPO 4、22 mL/L 1 M KH₂PO₄、および 15 g/L 寒天を測定して、2x YT+P寒天を調製します。2x YT + Pブロスの場合は、前の組成に従いますが、寒天は省略します。
   2. 2x YT+Pをオートクレーブして滅菌します。
2. S30Aバッファーの準備
   1. 酢酸でpH 7.7に調整した 5.88 g/L Mg-グルタミン酸、12.195 g/L K-グルタミン酸、および 25 mL/L 2 M トリスを含む S30A バッファーを調製します。
   2. S30Aバッファーを4°Cで最大1週間保管します。
3. S30Bバッファーの準備
   1. 5.88 g/L Mg-グルタミン酸および12.195 g/L K-グルタミン酸を含むS30Bバッファーを調製し、pH 8.2 に調整し、2 M トリスで調製します。
   2. S30Bバッファーを4°Cで最大1週間保管します。

ディスカッション

ここでは、 大腸菌 細胞ライセートベースのCFPS反応をアガロースヒドロゲルに組み込むための2つのプロトコルについて概説します。これらの方法は、材料全体で同時に遺伝子発現を可能にします。このプロトコルは、他のCFPSシステムにも適用でき、ここで詳しく説明する実験室で調製された細胞ライセートに加えて、市販のCFPSキットを使用して成功裏に実施されています。重要なこ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657