Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.

Zusammenfassung

Synthetische Gennetzwerke bieten Wissenschaftlern und Ingenieuren eine Plattform, um neuartige Systeme mit Funktionen zu entwerfen und zu bauen, die auf genetischer Ebene kodiert sind. Während das vorherrschende Paradigma für den Einsatz von Gennetzwerken innerhalb eines zellulären Chassis liegt, können synthetische Gennetzwerke auch in zellfreien Umgebungen eingesetzt werden. Zu den vielversprechenden Anwendungen zellfreier Gennetzwerke gehören Biosensoren, da diese Geräte gegen biotische (Ebola-, Zika- und SARS-CoV-2-Viren) und abiotische (Schwermetalle, Sulfide, Pestizide und andere organische Verunreinigungen) Ziele nachgewiesen wurden. Zellfreie Systeme werden in der Regel in flüssiger Form in einem Reaktionsgefäß eingesetzt. Die Möglichkeit, solche Reaktionen in eine physikalische Matrix einzubetten, kann jedoch ihre breitere Anwendung in einer breiteren Palette von Umgebungen erleichtern. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Einbettung von Reaktionen der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) in eine Vielzahl von Hydrogelmatrices entwickelt. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Hydrogelen, die für diese Arbeit förderlich sind, ist die hohe Wasserrekonstitutionskapazität von Hydrogelmaterialien. Darüber hinaus besitzen Hydrogele physikalische und chemische Eigenschaften, die funktionell vorteilhaft sind. Hydrogele können für die Lagerung gefriergetrocknet und für die spätere Verwendung rehydriert werden. Es werden zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle für den Einschluss und die Analyse von CFPS-Reaktionen in Hydrogelen vorgestellt. Zunächst kann ein CFPS-System durch Rehydrierung mit einem Zelllysat in ein Hydrogel eingebaut werden. Das System innerhalb des Hydrogels kann dann für eine vollständige Proteinexpression durch das Hydrogel induziert oder konstitutiv exprimiert werden. Zweitens kann Zelllysat am Punkt der Polymerisation in ein Hydrogel eingebracht werden, und das gesamte System kann gefriergetrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt mit einer wässrigen Lösung rehydriert werden, die den Induktor für das in dem Hydrogel kodierte Expressionssystem enthält. Diese Methoden haben das Potenzial, zellfreie Gennetzwerke zu ermöglichen, die Hydrogelmaterialien sensorische Fähigkeiten verleihen, mit dem Potenzial, über das Labor hinaus eingesetzt zu werden.

Einleitung

Die synthetische Biologie integriert verschiedene Ingenieurdisziplinen, um biologisch basierte Teile, Geräte und Systeme zu entwerfen und zu konstruieren, die Funktionen ausführen können, die in der Natur nicht vorkommen. Die meisten Ansätze der synthetischen Biologie sind immer noch an lebende Zellen gebunden. Im Gegensatz dazu ermöglichen zellfreie Systeme der synthetischen Biologie ein noch nie dagewesenes Maß an Kontrolle und Freiheit beim Design, was eine erhöhte Flexibilität und eine verkürzte Zeit für die Entwicklung biologischer Systeme ermöglicht und gleichzeitig viele der Einschränkungen herkömmlicher zellbasierter Genexpressionsmetho....

Protokoll

1. Zelllysatpuffer und Medienvorbereitung

1. Herstellung von 2x YT+P Agar und Medium
   1. Bereiten Sie 2x YT+P-Agar vor, indem Sie 16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22mL/L 1 M KH₂PO₄ und 15 g/L Agar abmessen. Für die 2x YT+P Brühe die vorherige Zusammensetzung befolgen, aber den Agar weglassen.
   2. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren der 2x YT+P.
2. Vorbereitung des S30A-Puffers
   1. Bereiten Sie den S30A-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat, 12,195 g/L K-Glutamat und 25 ml/L 2 M Tris vor, eingestellt auf pH 7,7 mit Essigsäure.

Diskussion

Im Folgenden werden zwei Protokolle für den Einbau von CFPS-Reaktionen auf Basis von E. coli-Zelllysaten in Agarose-Hydrogele beschrieben . Diese Methoden ermöglichen eine gleichzeitige Genexpression im gesamten Material. Das Protokoll kann für andere CFPS-Systeme angepasst werden und wurde zusätzlich zu den hier beschriebenen im Labor hergestellten Zelllysaten erfolgreich mit kommerziell erhältlichen CFPS-Kits durchgeführt. Wichtig ist, dass das Protokoll die Genexpression in Abwesenheit einer externen fl.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657