Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

Resumen

Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.

Resumen

Las redes de genes sintéticos proporcionan una plataforma para que los científicos e ingenieros diseñen y construyan sistemas novedosos con funcionalidad codificada a nivel genético. Si bien el paradigma dominante para el despliegue de redes de genes se encuentra dentro de un chasis celular, las redes de genes sintéticos también pueden desplegarse en entornos libres de células. Entre las aplicaciones prometedoras de las redes de genes libres de células se encuentran los biosensores, ya que se ha demostrado que estos dispositivos se encuentran contra objetivos bióticos (virus del Ébola, Zika y SARS-CoV-2) y abióticos (metales pesados, sulfuros, pesticidas y otros contaminantes orgánicos). Los sistemas libres de células generalmente se implementan en forma líquida dentro de un recipiente de reacción. Sin embargo, ser capaz de incrustar tales reacciones en una matriz física puede facilitar su aplicación más amplia en un conjunto más amplio de entornos. Con este fin, se han desarrollado métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en una variedad de matrices de hidrogel. Una de las propiedades clave de los hidrogeles que conducen a este trabajo es la alta capacidad de reconstitución en agua de los materiales de hidrogel. Además, los hidrogeles poseen características físicas y químicas que son funcionalmente beneficiosas. Los hidrogeles se pueden liofilizar para su almacenamiento y rehidratarse para su uso posterior. Se presentan dos protocolos paso a paso para la inclusión y el ensayo de reacciones de CFPS en hidrogeles. En primer lugar, se puede incorporar un sistema CFPS a un hidrogel mediante rehidratación con un lisado celular. El sistema dentro del hidrogel puede ser inducido o expresado constitutivamente para una expresión completa de proteínas a través del hidrogel. En segundo lugar, el lisado celular se puede introducir en un hidrogel en el punto de polimerización, y todo el sistema se puede liofilizar y rehidratar en un punto posterior con una solución acuosa que contiene el inductor del sistema de expresión codificado dentro del hidrogel. Estos métodos tienen el potencial de permitir redes de genes libres de células que confieren capacidades sensoriales a los materiales de hidrogel, con el potencial de ser desplegados más allá del laboratorio.

Introducción

La biología sintética integra diversas disciplinas de ingeniería para diseñar y diseñar piezas, dispositivos y sistemas de base biológica que puedan realizar funciones que no se encuentran en la naturaleza. La mayoría de los enfoques de biología sintética todavía están ligados a células vivas. Por el contrario, los sistemas de biología sintética libres de células facilitan niveles sin precedentes de control y libertad en el diseño, lo que permite una mayor flexibilidad y un tiempo más corto para la ingeniería de sistemas biológicos, al tiempo que elimina muchas de las limitaciones de los métodos tradicionales de expresión génica basados en célu....

Protocolo

1. Tampón de lisado celular y preparación de medios

1. Preparación de 2x agar YT+P y medio
   1. Prepare 2 agar YT+P midiendo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1M KH₂PO₄ y 15 g/L de agar. Para el caldo 2x YT+P, siga la composición anterior pero omita el agar.
   2. Esterilice esterilizando en autoclave el 2x YT+P.
2. Preparación del tampón S30A
   1. Preparar el tampón S30A con 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato y 25 mL/L de 2 M de Tris, ajustado a pH 7,7 con ácido acético.
   2. Guarde el t....

Discusión

A continuación se describen dos protocolos para la incorporación de reacciones de CFPS basadas en lisado de células de E. coli en hidrogeles de agarosa. Estos métodos permiten la expresión génica simultánea en todo el material. El protocolo se puede adaptar a otros sistemas de CFPS y se ha llevado a cabo con éxito con kits de CFPS disponibles en el mercado, además de los lisados celulares preparados en laboratorio que se detallan aquí. Es importante destacar que el protocolo permite la expresión géni.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657