Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri

Özet

Burada, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını harici bir sıvı faza ihtiyaç duymadan makro ölçekli hidrojel matrislerine gömmek için iki protokol sunuyoruz.

Özet

Sentetik gen ağları, bilim insanlarının ve mühendislerin genetik düzeyde kodlanmış işlevselliğe sahip yeni sistemler tasarlamaları ve inşa etmeleri için bir platform sağlar. Gen ağlarının konuşlandırılması için baskın paradigma hücresel bir şasi içinde olsa da, sentetik gen ağları hücresiz ortamlarda da konuşlandırılabilir. Hücresiz gen ağlarının umut verici uygulamaları arasında biyosensörler bulunur, çünkü bu cihazlar biyotik (Ebola, Zika ve SARS-CoV-2 virüsleri) ve abiyotik (ağır metaller, sülfürler, böcek ilaçları ve diğer organik kirleticiler) hedeflere karşı gösterilmiştir. Hücresiz sistemler tipik olarak bir reaksiyon kabı içinde sıvı halde konuşlandırılır. Bununla birlikte, bu tür reaksiyonları fiziksel bir matrise gömmek, daha geniş bir ortam kümesinde daha geniş uygulamalarını kolaylaştırabilir. Bu amaçla, hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını çeşitli hidrojel matrislerine gömmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmaya elverişli hidrojellerin temel özelliklerinden biri, hidrojel malzemelerin yüksek su sulandırma kapasitesidir. Ek olarak, hidrojeller, işlevsel olarak faydalı olan fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. Hidrojeller, depolama için dondurularak kurutulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere yeniden sulandırılabilir. CFPS reaksiyonlarının hidrojellere dahil edilmesi ve tahlili için iki adım adım protokol sunulmaktadır. İlk olarak, bir CFPS sistemi, bir hücre lizatı ile rehidrasyon yoluyla bir hidrojele dahil edilebilir. Hidrojel içindeki sistem daha sonra hidrojel yoluyla tam protein ekspresyonu için yapısal olarak indüklenebilir veya eksprese edilebilir. İkincisi, hücre lizatı, polimerizasyon noktasında bir hidrojele eklenebilir ve tüm sistem, hidrojel içinde kodlanan ekspresyon sistemi için indükleyiciyi içeren sulu bir çözelti ile daha sonraki bir noktada dondurularak kurutulabilir ve yeniden sulandırılabilir. Bu yöntemler, hidrojel malzemelere duyusal yetenekler kazandıran hücresiz gen ağlarına izin verme potansiyeline sahiptir ve laboratuvarın ötesinde konuşlanma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Sentetik biyoloji, doğada bulunmayan işlevleri yerine getirebilen biyolojik tabanlı parçalar, cihazlar ve sistemler tasarlamak ve tasarlamak için çeşitli mühendislik disiplinlerini bütünleştirir. Çoğu sentetik biyoloji yaklaşımı hala canlı hücrelere bağlıdır. Buna karşılık, hücresiz sentetik biyoloji sistemleri, geleneksel hücre tabanlı gen ekspresyon yöntemlerinin^{kısıtlamalarının} çoğunu ortadan kaldırırken, biyolojik sistemlerin mühendisliği için daha fazla esneklik ve kısaltılmış bir süre sağlayarak, tasarımda benzeri görülmemiş düzeyde kontrol ve özgürlüğü kolaylaştırır ^1,2,3.

Protokol

1. Hücre lizat tamponu ve ortam hazırlama

1. 2x YT+P agar ve besiyerinin hazırlanması
   1. 16 g/L tripton, 10 g/L maya özütü, 5 g/L NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH₂PO₄ ve 15 g/L agar ölçerek 2x YT+P agar hazırlayın. 2x YT+P et suyu için önceki bileşimi takip edin ancak agarı atlayın.
   2. 2x YT+P'yi otoklavlayarak sterilize edin.
2. S30A tamponunun hazırlanması
   1. S30A tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat, 12.195 g/L K-glutamat ve 25 mL/L 2 M Tris ile hazırlayın, asetik asit ile pH 7.7'ye ayarlayın.
   2. S30A tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
   ....

Tartışmalar

Burada, E. coli hücresi lizat bazlı CFPS reaksiyonlarının agaroz hidrojellere dahil edilmesi için iki protokol özetlenmiştir. Bu yöntemler, materyal boyunca eşzamanlı gen ekspresyonuna izin verir. Protokol diğer CFPS sistemleri için uyarlanabilir ve burada ayrıntıları verilen laboratuvarda hazırlanmış hücre lizatlarına ek olarak ticari olarak temin edilebilen CFPS kitleri ile başarılı bir şekilde yürütülmüştür. Daha da önemlisi, protokol, harici bir sıvı fazın yokluğunda gen ek.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657