Procédés d’intégration de réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des hydrogels à l’échelle macroscopique

Résumé

Nous présentons ici deux protocoles permettant d’intégrer des réactions de synthèse de protéines acellulaires dans des matrices d’hydrogel à l’échelle macroscopique sans avoir besoin d’une phase liquide externe.

Résumé

Les réseaux de gènes synthétiques fournissent une plate-forme aux scientifiques et aux ingénieurs pour concevoir et construire de nouveaux systèmes avec des fonctionnalités codées au niveau génétique. Alors que le paradigme dominant pour le déploiement des réseaux de gènes se trouve à l’intérieur d’un châssis cellulaire, les réseaux de gènes synthétiques peuvent également être déployés dans des environnements sans cellules. Les applications prometteuses des réseaux de gènes acellulaires comprennent les biocapteurs, car ces dispositifs ont été démontrés contre des cibles biotiques (virus Ebola, Zika et SRAS-CoV-2) et abiotiques (métaux lourds, sulfures, pesticides et autres contaminants organiques). Les systèmes acellulaires sont généralement déployés sous forme liquide dans une cuve de réaction. Cependant, être capable d’intégrer de telles réactions dans une matrice physique peut faciliter leur application plus large dans un ensemble plus large d’environnements. À cette fin, des méthodes d’intégration des réactions de synthèse de protéines acellulaires (CFPS) dans une variété de matrices d’hydrogel ont été développées. L’une des principales propriétés des hydrogels propices à ce travail est la grande capacité de reconstitution en eau des matériaux hydrogels. De plus, les hydrogels possèdent des caractéristiques physiques et chimiques fonctionnellement bénéfiques. Les hydrogels peuvent être lyophilisés pour le stockage et réhydratés pour une utilisation ultérieure. Deux protocoles étape par étape pour l’inclusion et le dosage des réactions CFPS dans les hydrogels sont présentés. Tout d’abord, un système CFPS peut être incorporé dans un hydrogel par réhydratation avec un lysat cellulaire. Le système à l’intérieur de l’hydrogel peut alors être induit ou exprimé de manière constitutive pour une expression complète de la protéine à travers l’hydrogel. Deuxièmement, le lysat cellulaire peut être introduit dans un hydrogel au point de polymérisation, et l’ensemble du système peut être lyophilisé et réhydraté à un point ultérieur avec une solution aqueuse contenant l’inducteur du système d’expression codé dans l’hydrogel. Ces méthodes ont le potentiel de permettre la création de réseaux de gènes acellulaires qui confèrent des capacités sensorielles aux matériaux hydrogel, avec un potentiel de déploiement au-delà du laboratoire.

Introduction

La biologie synthétique intègre diverses disciplines d’ingénierie pour concevoir et concevoir des pièces, des dispositifs et des systèmes biologiques qui peuvent remplir des fonctions que l’on ne trouve pas dans la nature. La plupart des approches de biologie synthétique sont encore liées aux cellules vivantes. En revanche, les systèmes de biologie synthétique acellulaires offrent des niveaux de contrôle et de liberté de conception sans précédent, ce qui permet une flexibilité accrue et un temps plus court pour l’ingénierie des systèmes biologiques, tout en éliminant de nombreuses contraintes des méthodes traditionnelles d’expression génique ce....

Protocole

1. Tampon de lysat cellulaire et préparation du milieu

1. Préparation de 2x gélose YT+P et médium
   1. Préparez 2 gélose YT+P en mesurant 16 g/L de tryptone, 10 g/L d’extrait de levure, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH₂PO₄ et 15 g/L de gélose. Pour le bouillon 2x YT+P, suivez la composition précédente mais omettez l’agar-agar.
   2. Stériliser à l’autoclavage des 2x YT+P.
2. Préparation du tampon S30A
   1. Préparez le tampon S30A avec 5,88 g/L de Mg-glutamate, 12,195 g/L de K-glutamate et 25 mL/L de 2 M Tris, ajustés à un pH de 7,7 avec de l’acide acétiq....

Discussion

Voici deux protocoles pour l’incorporation de réactions CFPS à base de lysat de cellules d’E. coli dans les hydrogels d’agarose. Ces méthodes permettent l’expression simultanée des gènes dans l’ensemble du matériel. Le protocole peut être adapté à d’autres systèmes CFPS et a été mis en œuvre avec succès avec des kits CFPS disponibles dans le commerce en plus des lysats cellulaires préparés en laboratoire détaillés ici. Il est important de noter que le protocole permet l’expression.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657