A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

Abstract

רשתות גנים סינתטיות מספקות פלטפורמה למדענים ומהנדסים לתכנן ולבנות מערכות חדשניות עם פונקציונליות המקודדת ברמה גנטית. בעוד הפרדיגמה השלטת לפריסת רשתות גנים היא בתוך שלדה תאית, רשתות גנים סינתטיות עשויות להיות פרוסות גם בסביבות נטולות תאים. יישומים מבטיחים של רשתות גנים נטולות תאים כוללים ביו-חיישנים, שכן התקנים אלה הוכחו נגד מטרות ביוטיות (נגיפי אבולה, זיקה ו-SARS-CoV-2) וא-ביוטיות (מתכות כבדות, סולפידים, חומרי הדברה ומזהמים אורגניים אחרים). מערכות נטולות תאים נפרסות בדרך כלל בצורה נוזלית בתוך כלי תגובה. היכולת להטמיע תגובות כאלה במטריצה פיזיקלית, לעומת זאת, עשויה להקל על היישום הרחב יותר שלהן בקבוצה רחבה יותר של סביבות. לשם כך פותחו שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) במגוון מטריצות הידרוג'ל. אחד המאפיינים העיקריים של הידרוג'לים התורמים לעבודה זו הוא יכולת הבנייה מחדש של מים גבוהים של חומרי הידרוג'ל. בנוסף, הידרוג'לים הם בעלי מאפיינים פיזיקליים וכימיים המועילים מבחינה תפקודית. ניתן לייבש הידרוג'לים בהקפאה לאחסון ולהתייבש מחדש לשימוש מאוחר יותר. מוצגים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב להכללה ובדיקה של תגובות CFPS בהידרוג'לים. ראשית, ניתן לשלב מערכת CFPS בהידרוג'ל באמצעות התייבשות עם ליזט תא. לאחר מכן ניתן להשרות או לבטא את המערכת בתוך ההידרוג'ל באופן קונסטיטוטיבי לביטוי חלבוני מלא באמצעות ההידרוג'ל. שנית, ניתן להחדיר לליזט התא הידרוג'ל בנקודת הפילמור, וניתן לייבש את המערכת כולה בהקפאה ולהתייבש מחדש בנקודה מאוחרת יותר באמצעות תמיסה מימית המכילה את השראת מערכת הביטוי המקודדת בתוך ההידרוג'ל. לשיטות אלה יש פוטנציאל לאפשר רשתות גנים נטולות תאים המקנות יכולות חושיות לחומרי הידרוג'ל, עם פוטנציאל לפריסה מעבר למעבדה.

Introduction

ביולוגיה סינתטית משלבת דיסציפלינות הנדסיות מגוונות כדי לתכנן ולהנדס חלקים, התקנים ומערכות מבוססי ביולוגיה שיכולים לבצע פונקציות שאינן נמצאות בטבע. רוב גישות הביולוגיה הסינתטית עדיין קשורות לתאים חיים. לעומת זאת, מערכות ביולוגיה סינתטית נטולות תאים מאפשרות רמות חסרות תקדים של שליטה וחופש בתכנון, ומאפשרות גמישות מוגברת וקיצור זמן להנדסת מערכות ביולוגיות תוך ביטול רבים מהאילוצים של שיטות מסורתיות לביטוי גנים מבוססי תאים 1,2,3. CFPS נמצא בשימוש במספר גדל והולך של יישומים על פני דיסציפלינות רבות, כולל בניית תאים מלאכותיים, אב טיפוס של מעגלים גנטיים, פיתוח biosensors, וייצור מטבולי....

Protocol

1. חיץ ליזט תאים והכנת מדיה

  1. הכנת אגר YT+P 2x ובינוני
    1. הכינו אגר YT+P 2x על ידי מדידת 16 גרם/ליטר טריפטון, תמצית שמרים 10 גרם/ליטר, 5 גרם/ליטר NaCl, 40 מ"ל/ליטר, 1 M K 2, HPO 4, 22 מ"ל/ליטר, 1 M KH2PO4 ו-15 גרם/ליטר אגר. למרק YT+P 2x, עקבו אחר הרכב הקודם אך השמיטו את האגר.
    2. עיקור על ידי autoclaving 2x YT+P.
  2. הכנת חיץ S30A
    1. הכינו את חיץ S30A עם 5.88 גרם/ליטר מ"ג-גלוטמט, 12.195 גרם/ליטר K-גלוטמט ו-25 מ"ל/ליטר 2 M Tris, מותאם ל-pH 7.7 עם חומצה אצטית.
    2. אחסן את מאגר S30A בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד.
  3. הכנת חיץ S30B
    1. הכינ....

תוצאות

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל, כאשר איור 1 מציג סקירה סכמטית של שתי הגישות. שתי השיטות מקובלות לייבוש בהקפאה ואחסון לטווח ארוך. שיטה א' היא המתודולוגיה הנפוצה ביותר משתי סיבות. ראשית, היא הוכחה כשיטה הישימה ביותר לעבודה עם מגוון חומרי הידרוג'ל.......

Discussion

להלן שני פרוטוקולים לשילוב תגובות CFPS מבוססות תאי E. coli ליזט בהידרוג'לים של אגרוז. שיטות אלו מאפשרות ביטוי גנים בו זמנית בכל החומר. ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות CFPS אחרות והוא נערך בהצלחה עם ערכות CFPS זמינות מסחרית בנוסף לליזטים התאיים שהוכנו במעבדה המפורטים כאן. חשוב לציין כי הפרוטו?.......

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

המחברים מודים מאוד על תמיכתם של פרסי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ו- BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ופרס EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H). נתונים התומכים בפרסום זה זמינים באופן גלוי בכתובת: 10.25405/data.ncl.22232452. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196CFPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved