שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

Summary

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

Abstract

רשתות גנים סינתטיות מספקות פלטפורמה למדענים ומהנדסים לתכנן ולבנות מערכות חדשניות עם פונקציונליות המקודדת ברמה גנטית. בעוד הפרדיגמה השלטת לפריסת רשתות גנים היא בתוך שלדה תאית, רשתות גנים סינתטיות עשויות להיות פרוסות גם בסביבות נטולות תאים. יישומים מבטיחים של רשתות גנים נטולות תאים כוללים ביו-חיישנים, שכן התקנים אלה הוכחו נגד מטרות ביוטיות (נגיפי אבולה, זיקה ו-SARS-CoV-2) וא-ביוטיות (מתכות כבדות, סולפידים, חומרי הדברה ומזהמים אורגניים אחרים). מערכות נטולות תאים נפרסות בדרך כלל בצורה נוזלית בתוך כלי תגובה. היכולת להטמיע תגובות כאלה במטריצה פיזיקלית, לעומת זאת, עשויה להקל על היישום הרחב יותר שלהן בקבוצה רחבה יותר של סביבות. לשם כך פותחו שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) במגוון מטריצות הידרוג'ל. אחד המאפיינים העיקריים של הידרוג'לים התורמים לעבודה זו הוא יכולת הבנייה מחדש של מים גבוהים של חומרי הידרוג'ל. בנוסף, הידרוג'לים הם בעלי מאפיינים פיזיקליים וכימיים המועילים מבחינה תפקודית. ניתן לייבש הידרוג'לים בהקפאה לאחסון ולהתייבש מחדש לשימוש מאוחר יותר. מוצגים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב להכללה ובדיקה של תגובות CFPS בהידרוג'לים. ראשית, ניתן לשלב מערכת CFPS בהידרוג'ל באמצעות התייבשות עם ליזט תא. לאחר מכן ניתן להשרות או לבטא את המערכת בתוך ההידרוג'ל באופן קונסטיטוטיבי לביטוי חלבוני מלא באמצעות ההידרוג'ל. שנית, ניתן להחדיר לליזט התא הידרוג'ל בנקודת הפילמור, וניתן לייבש את המערכת כולה בהקפאה ולהתייבש מחדש בנקודה מאוחרת יותר באמצעות תמיסה מימית המכילה את השראת מערכת הביטוי המקודדת בתוך ההידרוג'ל. לשיטות אלה יש פוטנציאל לאפשר רשתות גנים נטולות תאים המקנות יכולות חושיות לחומרי הידרוג'ל, עם פוטנציאל לפריסה מעבר למעבדה.

Introduction

ביולוגיה סינתטית משלבת דיסציפלינות הנדסיות מגוונות כדי לתכנן ולהנדס חלקים, התקנים ומערכות מבוססי ביולוגיה שיכולים לבצע פונקציות שאינן נמצאות בטבע. רוב גישות הביולוגיה הסינתטית עדיין קשורות לתאים חיים. לעומת זאת, מערכות ביולוגיה סינתטית נטולות תאים מאפשרות רמות חסרות תקדים של שליטה וחופש בתכנון, ומאפשרות גמישות מוגברת וקיצור זמן להנדסת מערכות ביולוגיות תוך ביטול רבים מהאילוצים של שיטות מסורתיות לביטוי גנים מבוססי תאים ^1,2,3. CFPS נמצא בשימוש במספר גדל והולך של יישומים על פני דיסציפלינות רבות, כולל בניית תאים מלאכותיים, אב טיפוס של מעגלים גנטיים, פיתוח biosensors, וייצור מטבולי....

Protocol

1. חיץ ליזט תאים והכנת מדיה

1. הכנת אגר YT+P 2x ובינוני
   1. הכינו אגר YT+P 2x על ידי מדידת 16 גרם/ליטר טריפטון, תמצית שמרים 10 גרם/ליטר, 5 גרם/ליטר NaCl, 40 מ"ל/ליטר, 1 M K 2, HPO 4, 22 מ"ל/ליטר, 1 M KH₂PO₄ ו-15 גרם/ליטר אגר. למרק YT+P 2x, עקבו אחר הרכב הקודם אך השמיטו את האגר.
   2. עיקור על ידי autoclaving 2x YT+P.
2. הכנת חיץ S30A
   1. הכינו את חיץ S30A עם 5.88 גרם/ליטר מ"ג-גלוטמט, 12.195 גרם/ליטר K-גלוטמט ו-25 מ"ל/ליטר 2 M Tris, מותאם ל-pH 7.7 עם חומצה אצטית.
   2. אחסן את מאגר S30A בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד.
3. הכנת חיץ S30B
   1. הכינ....

תוצאות

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל, כאשר איור 1 מציג סקירה סכמטית של שתי הגישות. שתי השיטות מקובלות לייבוש בהקפאה ואחסון לטווח ארוך. שיטה א' היא המתודולוגיה הנפוצה ביותר משתי סיבות. ראשית, היא הוכחה כשיטה הישימה ביותר לעבודה עם מגוון חומרי הידרוג'ל.......

Discussion

להלן שני פרוטוקולים לשילוב תגובות CFPS מבוססות תאי E. coli ליזט בהידרוג'לים של אגרוז. שיטות אלו מאפשרות ביטוי גנים בו זמנית בכל החומר. ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות CFPS אחרות והוא נערך בהצלחה עם ערכות CFPS זמינות מסחרית בנוסף לליזטים התאיים שהוכנו במעבדה המפורטים כאן. חשוב לציין כי הפרוטו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657