在宏观水凝胶中包埋无细胞蛋白质合成反应的方法

摘要

在这里，我们提出了两种方案，用于在宏观尺度的水凝胶基质中嵌入无细胞蛋白质合成反应，而无需外部液相。

摘要

合成基因网络为科学家和工程师提供了一个平台，以设计和构建具有遗传水平编码功能的新系统。虽然部署基因网络的主要范式是在细胞底盘内，但合成基因网络也可以部署在无细胞环境中。无细胞基因网络的有前途的应用包括生物传感器，因为这些设备已被证明可对抗生物（埃博拉、寨卡和SARS-CoV-2病毒）和非生物（重金属、硫化物、杀虫剂和其他有机污染物）靶标。无孔系统通常以液体形式部署在反应容器内。然而，能够将这些反应嵌入物理基质中，可能有助于它们在更广泛的环境中得到更广泛的应用。为此，已经开发了在各种水凝胶基质中嵌入无细胞蛋白质合成（CFPS）反应的方法。有利于这项工作的水凝胶的关键特性之一是水凝胶材料的高水重构能力。此外，水凝胶具有对功能有益的物理和化学特性。水凝胶可以冷冻干燥以备后用，并重新水化以备后用。介绍了两种分步方案，用于在水凝胶中包含和测定CFPS反应。首先，CFPS系统可以通过细胞裂解物的再水化 掺 入水凝胶中。然后可以诱导或表达水凝胶内的系统，以便通过水凝胶完全表达蛋白质。其次，细胞裂解物可以在聚合点引入水凝胶中，整个系统可以在稍后点用含有水凝胶内编码的表达系统诱导剂的水溶液冷冻干燥和再水化。这些方法有可能允许无细胞基因网络，赋予水凝胶材料感官能力，并有可能在实验室之外部署。

引言

合成生物学整合了不同的工程学科，以设计和制造基于生物的部件、设备和系统，这些部件、设备和系统可以执行自然界中没有的功能。大多数合成生物学方法仍然与活细胞结合。相比之下，无细胞合成生物学系统促进了前所未有的控制和设计自由度，提高了工程生物系统的灵活性并缩短了时间，同时消除了传统基于细胞的基因表达方法的许多限制^1,2,3。CFPS正被用于众多学科的越来越多的应用，包括构建人造细胞，原型遗传电路，开发生物传感器和生产代谢物^4,5,6。CFPS对于生产在活细胞中不易表达的重组蛋白也特别有用，例如易聚集蛋白，跨膜蛋白和有毒蛋白^6,7,8。

CFPS通常在液体反应中进行。然而，在某些情况下，这可能会限制它们的部署，因为任何无液体电池装置都必须包含在反应容器中。开发这里介绍的方法的基本原理是为将无细胞合成生物学设备嵌入水凝胶提供强大的方....

研究方案

1. 细胞裂解物缓冲液和培养基制备

1. 制备2x YT+P琼脂和培养基
   1. 通过测量 16 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K 2 HPO 4、22 mL/L 1 M KH₂PO₄ 和 15 g/L 琼脂来制备 2x YT+P 琼脂。对于 2x YT+P 肉汤，遵循之前的成分，但省略琼脂。
   2. 通过高压灭菌 2x YT+P 进行灭菌。
2. S30A缓冲液的制备
   1. 用 5.88 g/L 镁谷氨酸、12.195 g/L 钾谷氨酸和 25 mL/L 2 M Tris 制备 S30A 缓冲液，用乙酸调节至 pH 7.7。
   2. 将S30A缓冲液在4°C下储存长达1周。
3. S30B缓冲液的制备
   1. 用 5.88 g/L 镁谷氨酸和 12.195 g/L K-谷氨酸制备 S30B 缓冲液，用 2 M Tris 调节至 pH 8.2。
   2. 将S30B缓冲液在4°C下储存长达1周。

2.细胞裂解物制备（4天方案）

1. 第一天
   1. 将 2x Y....

讨论

这里概述了将基于 大肠杆菌 细胞裂解物的CFPS反应掺入琼脂糖水凝胶的两种方案。这些方法允许在整个材料中同时表达基因。该方案可适用于其他CFPS系统，除了此处详述的实验室制备的细胞裂解物外，还已成功使用市售的CFPS试剂盒进行。重要的是，该方案允许在没有外部液相的情况下进行基因表达。这意味着该系统是独立的，不需要无细胞反应槽。与以前在水凝胶内发生CFPS反应的方法不?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657