الكى المضاعف في نموذج فأر من التهاب الفقار اللاصق

Summary

تصف هذه الورقة بالتفصيل إجراءات العملية والاحتياطات الواجب اتخاذها أثناء الكى في علاج التهاب الفقار اللاصق في فئران التجارب.

Abstract

التهاب الفقار اللاصق (AS) هو شكل من أشكال التهاب المفاصل يزداد سوءا وتعطيلا يؤثر بشكل أساسي على الهيكل العظمي المحوري. هذا المرض يشمل أساسا العمود الفقري والمفصل العجزي الحرقفي. قد يحدث اندماج العمود الفقري والمفصل العجزي الحرقفي في المرحلة المتأخرة من المرض ، مما يؤدي إلى تصلب العمود الفقري وحداب ، وكذلك صعوبة في المشي ، مما يؤثر بشكل خطير على جودة العمل وأنشطة الحياة اليومية ويفرض عبئا ثقيلا على المريض والأسرة والمجتمع. تم إيلاء اهتمام متزايد للعلاج غير الدوائي كعلاج بديل ل AS. الكى هو تقنية علاجية قديمة تستخدم في الطب الصيني التقليدي (TCM). علاج الكى Du ، وهو علاج خارجي فريد ومبتكر تم تطويره على أساس الكى العادي ، له تأثير علاجي واضح على AS. يجمع Du-mokibustion بمهارة بين التقنيات المتوافقة للطب الصيني التقليدي لدمج خطوط الطول ونقاط الوخز والأدوية العشبية الصينية والكي. يصف هذا البحث إجراءات التشغيل والاحتياطات الواجب اتخاذها أثناء الكى المثاني في فئران التجارب بالتفصيل لتوفير أساس تجريبي لدراسة آلية الكى المثاني في علاج AS.

Introduction

التهاب الفقار اللاصق (AS) هو شكل من أشكال التهاب المفاصل يزداد سوءا وتعطيلا يؤثر بشكل أساسي على الهيكل العظمي المحوري. وفقا لأحدث مسح وبائي ، ~ 0.01٪ -1.8٪ من الناس في العالم يعانون من هذه الحالة¹ ، معظمهم من الشباب الذكور (نسبة الذكور إلى الإناث هي ~ 2-3: 1) ². معدل حدوث AS في السكان الصينيين هو 0.2 ٪ -0.4 ٪. هذا المرض يشمل أساسا العمود الفقري والمفصل العجزي الحرقفي. قد يحدث اندماج العمود الفقري والمفصل العجزي الحرقفي في المراحل المتأخرة من المرض ، مما يؤدي إلى تصلب العمود الفقري وحداب ، وكذلك صعوبة في المشي ، مما يؤثر بشكل خطير على جودة العمل وأنشطة الحياة اليومية ويفرض عبئا ثقيلا على المريض والأسرة والمجتمع¹. حاليا ، لا يوجد حل نهائي ل AS ، وتركز العلاجات المقدمة ، الدوائية وغير الدوائية ، في المقام الأول على تخفيف الألم ، وإبطاء تطور المرض ، وتحسين نوعية الحياة. في السنوات الأخيرة ، نظرا لأن خيارات العلاج الدوائي كانت محدودة للغاية³ ، فقد تم إيلاء اهتمام متزايد للعلاج غير الدوائي ، والذي أصبح علاجا بديلا ل AS. في الصين ، غالبا ما يفضل المرضى العلاج الخارجي الذي يتكون من الطب الصيني التقليدي (TCM) ، والذي له آثار جانبية طفيفة وراحة كبيرة أثناء العلاج.

الكى هو تقنية علاجية قديمة تستخدم في الطب الصيني التقليدي. الكى المدو هو تقنية علاج خارجية تتكون من "الكى الطبي بالرغوة" على الجزء الفقري من خط الطول Du. يستخدم بشكل رئيسي في علاج AS وقد أظهر السلامة والفعالية. بالمقارنة مع الكى العادي ، يتميز Du-moxibustion بخصائص منطقة الكى الواسعة ، ومخروط moxa الكبير ، وقوة النيران القوية ، ودرجة الحرارة^{العالية 4}. تشير المراجعة المنهجية والتحليل التلوي إلى أن الكى هو علاج تكميلي فعال ل AS⁵. أكدت دراسة حديثة أن الأعراض السريرية وبعض العوامل الالتهابية لمرضى AS قد تحسنت بسبب الكى⁶. كشفت الدراسات أن الكى Du يمكن أن يزيد من محتوى الدماغ من β-endorphin ويمارس تأثيرا مسكنا مركزيا⁷ ، ويقلل من تنظيم التعبير عن جين HLA-B27 ⁸ ، ويؤخر معدل تكرار AS. كما أن الكى المتساوي له تأثير محسن على تطور AS عن طريق تقليل مؤشر الالتهاب ESR (ESR) ومستويات البروتين التفاعلي C (CRP) ، والببتيد C-terminal من الكولاجين من النوع الأول (CTX-I) ، وبروتين Dickkopf1 (DKK1) ^9,10.

أظهرت دراسة سريرية أخرى أن الكى Du يمكن أن يزيد من ضبط المجموعات الفرعية للخلايا التائية المضطربة ، Ig ، ويكمل C3 لتحقيق التوازن بين آلية المناعة¹¹. من حيث استقلاب العظام ، يمكن أن يمنع الكى صعود الفوسفاتيز القلوي في الدم (ALP) وفوسفور المصل (S-P) ، ويزيد من الكالسيوم في الدم (S-Ca) ، وكثافة المعادن في العظام (BMD) ، وقوة العظام¹². علاوة على ذلك ، يمكن ل Du-mokibustion إصلاح وظيفة العمود الفقري في نقاط متعددة لتخفيف أعراض التعب لدى مرضى AS¹³. كشفت بعض الدراسات التي أجريت على عن الآلية المحتملة للكي في علاج AS. أشارت دراسة إلى أن الكى حسن بشكل كبير الحالة الصحية العامة ، وقلل من مستويات سمك المخلب ، وقلل من مستويات IL-1β و PGE2 و IL-6 و TNF-α في عينات أنسجة الأربطة في العمود الفقري. ربط تحليل المسار الأيضي المستقلبات المحددة بدورة TCA ، وكذلك الدهون والأحماض الأمينية والنباتات المعوية واستقلاب البيورين¹⁴. أظهرت دراسة أخرى أن الكى قمع التعبير عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، IL-1β ، TNF-α ، IL-17 ، و IL-6. خفض مستويات mRNA من RANKL و RANK و ALP و OCN ؛ وتحسين السمات النسيجية المرضية في الفئران^{AS 15}.

في حين أن هذه الدراسات تشير إلى أن الكى قد يكون فعالا في علاج AS، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث لتأكيد هذه النتائج وتحديد بروتوكول العلاج الأمثل للكي في المرضى الذين يعانون من AS. قام فريقنا بإنشاء وتعديل علاج الكى بناء على النظرية الأساسية والتشغيل العملي للكي الصيني التقليدي ، والذي تم تنفيذه وتطبيقه على نطاق واسع في الممارسة السريرية الصينية لأكثر من 35 عاما. على الرغم من وجود عدد قليل من الدراسات عالية الجودة حول علاج AS بواسطة Du-moxibustion ، إلا أن دلالته في علاج AS مدعومة بالأدلة. ومع ذلك ، فإن آلية علاج AS مع Du-mokibustion تستحق مزيدا من الدراسة. تعد الدراسة على طريقة مهمة لاستكشاف آلية الكى في علاج AS. العملية السريرية ل Du-mokibustion ناضجة نسبيا ولكنها نادرا ما تستخدم في دراسة الآلية في التجارب على. تصف هذه الورقة بالتفصيل العملية والاحتياطات الواجب اتخاذها أثناء الكى Du في علاج فئران التجارب AS.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات رعاية التجريبي بجامعة شاندونغ للطب الصيني التقليدي (No. SDUTCM20230831301).

1. إعداد

1. تحديد المجموعات التجريبية وعدد لكل مجموعة مقدما.
2. اختر ذكور الفئران BALb / c ، وقم بإيوائها في درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 ± 1 درجة مئوية ، ورطوبة ثابتة تبلغ 60 ± 5٪ ، وبيئة إضاءة دورة نهارية لمدة 12 ساعة.

2. إنشاء نموذج الماوس AS

ملاحظة: تم تحفيز نموذج AS باستخدام بروتيوغليكان الغضروف (PG) ، وهي طريقة نمذجة كلاسيكية^{16،17،18،19،20،21}. تم تحصين الفئران من سلالة BALB / c بشكل متكرر باستخدام PG للحث على التهاب الأوتار والتهاب الفقار. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بالمواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. استخدم ماصة 200 ميكرولتر لسحب 200 ميكرولتر من PG و CFA (أو IFA) في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. يهتز بلطف لخلط السائل في أنبوب الطرد المركزي.
2. ضع أنبوب الطرد المركزي في مطحنة الأنسجة للتجانس ثم احتضانه على الثلج لمدة 4 دقائق. كرر 5x. اضبط المعلمات التالية في مطحنة الأنسجة: 60 هرتز ، طحن 30 ثانية ، فاصل 10 ثوان لما مجموعه 6 دورات.
3. استخراج 0.2 مل من بروتين PG المستحلب من أنبوب الطرد المركزي مع حقنة 1 مل.
4. الاستيلاء على الماوس وإصلاحه باليد اليسرى. ضع الماوس في وضع ضعيف ، مع إبقاء الرأس أقل من الذيل لمنع تلف أعضاء البطن عند إدخال المحقنة.
5. تعقيم البطن مع مسحات الكحول باستخدام اليد اليمنى.
6. مع وجود المحقنة في اليد اليمنى ، أدخل الإبرة تحت الجلد قليلا إلى يسار أو يمين الخط البطني في النصف السفلي من البطن.
7. ادفع الإبرة 3-5 مم بالتوازي مع خط منتصف البطن ثم ادفع الإبرة إلى تجويف البطن بزاوية 45 درجة على الجلد.
8. اختراق الصفاق ، وسحب سد الإبرة ، وحقن ببطء بروتين PG المستحلب.

3. دو الكى

ملاحظة: قم بإعداد أهم ثلاث مواد خام ل Du-mokibustion مسبقا (الشكل 1).

1. تحضير المخاريط moxa. خذ المخمل في اليد ، مع وجود راحتين تواجهان اتجاهين متعاكسين يمارسان قوة التواء لفرك المخمل في شكل مغزل (الشكل 2)
2. قطع الزنجبيل إلى قطع صغيرة وهرسه في عصارة (الشكل 3). تصفية هريس الزنجبيل من خلال الشاش القطني. افصل عصير الزنجبيل وطين الزنجبيل عن هريس الزنجبيل للتحضير للخطوة التالية.
3. تحضير 10 غرام من طين الزنجبيل و 20 مل من عصير الزنجبيل ووضعها في أكواب ورقية لاستخدامها لاحقا.
4. تزن 0.1 غرام من مسحوق الطب الصيني التقليدي (خليط من مسحوق القرفة ، مسحوق القرنفل ، مسحوق notopterygium ، مسحوق أنثاريدين ، والمسك الاصطناعي)²² وطحنها في الهاون.
5. ضع الفئران في صندوق تحريض التخدير في آلة التخدير الحيواني وقم بتخديرها بمزيج من 2-3٪ إيزوفلوران وأكسجين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة.
6. قم بتقييم عمق التخدير من خلال مراقبة عدم وجود منعكس مفاجئ في البداية والتحقق من مستوى التخدير الجراحي عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس دواسة استجابة لقرصة إصبع القدم اللطيفة.
7. بعد أن يصل الماوس إلى التخدير الجراحي للطائرة ، أخرجه من الصندوق وقم بتثبيته على طاولة العمليات في وضع الانبطاح. قم بمحاذاة فم الفأر وأنفه مع مخرج المخدر.
8. إدارة التخدير عن طريق قناع متصل بجهاز التخدير ، والذي يتم من خلاله توصيل الأيزوفلوران والأكسجين عبر دائرة غير قابلة لإعادة التنفس. حافظ على التخدير واحتفظ بالماوس على وسادة تسخين 37 درجة مئوية أثناء الإجراء التشغيلي بأكمله. ضع مادة التشحيم على العينين لمنع الجفاف.
9. حدد موقع نقاط الوخز وحدد منطقة التحفيز (الشكل 4).
10. حلق الشعر على ظهر الفأر حتى يظهر الجلد بلون اللحم على ظهر الماوس. تأكد من أن عرض إزالة الشعر ~ 1.5 سم والطول من فقرة عنق الرحم السابعة إلى فقرة الذيل (الشكل 5 أ).
11. ضع عصير الزنجبيل المحضر بشاش قطني على المنطقة المحلوقة (الشكل 3).
12. رش مسحوق TCM بالتساوي بفرشاة كتابة على الخط المتوسط للجزء الخلفي من الماوس وقم بتغطيته بورق التوت (الشكل 5B-D).
13. اصنع عمود زنجبيل شبه منحرف بطول 6 سم وعرض 1.5 سم وسمك 3 مم بطين الزنجبيل. ثبت عمود الزنجبيل على ورق التوت (الشكل 5E).
14. اصنع أخدودا فوق خط الوسط لعمود الزنجبيل (الشكل 3) ، وضع مخروط moxa على عمود الزنجبيل.
15. أشعل مخروط moxa ، وضع مخروط moxa جديدا بعد احتراق المخروط السابق. تحقق من صلابة عمود الزنجبيل لمنع حرق الماوس ، وحرق ما مجموعه ثلاثة مخاريط (الشكل 5F).
16. بعد حرق مخاريط moxa ، امسح الزنجبيل ومسحوق TCM ، ونظف الجزء الخلفي من الماوس. توقف عن التخدير في هذه المرحلة.
17. اسمح للفأر باستعادة وعيه في قفص جديد مع وصول غير مقيد إلى الطعام والماء. ضع القفص على وسادة ساخنة للمساعدة في عملية التعافي. راقب حتى يستعيد وعيه الكافي.
18. بمجرد أن يتعافى الماوس تماما ، تأكد من وجود رد الفعل الصحيح قبل إعادته إلى غلافه الطبيعي.
    ملاحظة: أثناء العملية ، من الضروري مراقبة الحالة العقلية للفئران لتجنب ضعف التنفس. منع السمط ، ولكن الحفاظ على الفئران دافئة ، وتجنب كدمات من مخالب والذيل.

4. تقييم مؤشر التهاب المفاصل (الذكاء الاصطناعي)

1. تقييم درجة الذكاء الاصطناعي ثلاث مرات: قبل النمذجة ، وبعد النمذجة ، وبعد العلاج. معايير التقييم هي كما يلي: 0 ، لا احمرار أو تورم. 1 ، احمرار طفيف أو تورم في عدد قليل من أصابع القدم ؛ 2 ، احمرار وتورم في معظم المفاصل أصابع القدم وأصابع القدم. 3 ، احمرار خطير وتورم في القدمين وتحت مفصل الكاحل ؛ و 4 ، احمرار وتورم في القدمين ومفصل الكاحل²³.
2. احسب الدرجات الذكاء الاصطناعي لجميع الكفوف الأربعة ، بحد أقصى 16.

5. اختبار الروتارود

ملاحظة: يستخدم اختبار الروتارود لتقييم التنسيق الحركي والتوازن عن طريق تسجيل الوقت الذي تقضيه الفئران على الأسطوانة الدوارة. تألفت هذه التجربة من ثلاث تجارب تفصل بينها فواصل زمنية مدتها 20 دقيقة. تم تسجيل بيانات الاختبار الرسمية من التجربة الثالثة ، حيث كان أول اختبارين بمثابة تمارين تدريبية.

1. ضع الفئران على براميل دوارة تدور تحت تسارع مستمر من 4 إلى 40 دورة في الدقيقة على 300 ثانية²⁴.
2. قم بقياس وقت الكمون (الوقت حتى يسقط الماوس من القضيب). توفير حشوة لمنع الإصابة عند سقوطها.

6. اختبار المجال المفتوح (OFT)

ملاحظة: يستخدم OFT لتقييم حالة الحركة اللاإرادية ، بهدف تحديد السلوك المرضي. تم وضع أربع ساحات مربعة مفتوحة المجال (50 سم × 50 سم × 40 سم) معا لتشكيل الجهاز. تم تقسيم الجزء السفلي من الصندوق إلى تسعة مربعات متساوية.

1. التحكم في ضوضاء خلفية المختبر إلى أقل من 65 ديسيبل.
2. امسح الجهاز بالكامل بنسبة 75٪ من الإيثانول قبل كل تجربة.
3. ضع جميع الفئران في غرفة الاختبار قبل 1 ساعة من الاختبار للسماح لها بالتكيف مع بيئتها.
4. ضع الفئران في ساحات الحقول المفتوحة المربعة واسمح لها بالاستكشاف لمدة 10 دقائق.
5. سجل المسافة الإجمالية وسرعة الحركة لمدة 10 دقائق.

7. القتل الرحيم وجمع العينات

1. ضع الماوس في صندوق تحريض التخدير وقم بتخديره بمزيج من 2-3٪ إيزوفلوران وأكسجين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة. بمجرد دخول الماوس في حالة تخدير عميق يؤكدها عدم وجود منعكس دواسة ، قم بنقله إلى طاولة العمليات لتخدير الصيانة.
2. الاستيلاء على الماوس وإصلاحه باليد غير المهيمنة.
3. اضغطي برفق على منطقة العين لجعل مقل العيون مزدحمة وبارزة.
4. استخدم المقص لتقليم شعيرات الماوس لمنع انحلال الدم الناجم عن الشعر.
5. تأكد من عمق التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس دواسة استجابة لقرصة إصبع القدم. استخدم الملقط للإمساك بمقلة العين وإزالتها بسرعة ، مما يسمح للدم بالتدفق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من مقبس العين.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طرق بديلة لجمع الدم ، مثل ثقب القلب.
6. عندما يتباطأ معدل تنقيط الدم ، اضغط برفق على منطقة قلب الفأر لتسريع ضخ الدم والحصول على المزيد من الدم. ثم القتل الرحيم للفأر باستخدام خلع عنق الرحم.
7. امسك الساق فوق مفصل الكاحل مباشرة باستخدام ملقط في اليد غير المهيمنة. ثم ، قم بقص الساق فوق مفصل الكاحل مباشرة باستخدام المقص.

8. التحليل النسيجي

1. اغمر عينات الكاحل في 4٪ بارافورمالدهيد لأكثر من 24 ساعة. إزالة الكلسify في 10 ٪ EDTA (درجة الحموضة = 7.4) لمدة 1 شهر.
2. نقع العينات في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 2 ساعة.
3. ثم ، نقع العينات في تدرج زيادة تركيزات الإيثانول (70 ٪ ، 80 ٪ ، 90 ٪ ، 100 ٪ ، 100 ٪ ، 100 ٪). نقع كل تركيز الإيثانول لمدة 1 ساعة.
4. نقع العينات في الزيلين لمدة 3 ساعات.
5. اغمر عينات الكاحل في البارافين لمدة 7 ساعات. توضع مكعبات البارافين جانبا في ثلاجة على حرارة 4 درجة مئوية.
6. قم بتقطيع كتل البارافين إلى سمك 6 ميكرومتر باستخدام آلة تقطيع البارافين شبه الأوتوماتيكية.
7. انقع الشرائح لمدة 4 × 5 دقائق في الزيلين لإكمال إزالة الشمع.
8. انقع الشرائح في تدرج من تركيزات الإيثانول المتناقصة (100٪ ، 100٪ ، 95٪ ، 75٪) لمدة 2 دقيقة لكل منها. نقع في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
9. تلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق واشطفها بالماء المقطر لمدة 5 ثوان.
10. نقع الشرائح لمدة 30 ثانية في سائل التمايز وشطف بالماء المقطر لمدة 5 ثوان.
11. تلطيخ شرائح مع eosin لمدة 1 دقيقة وشطف بالماء المقطر لمدة 3 دقائق.
12. نقع الشرائح في تدرج من تركيزات الإيثانول المتزايدة (80 ٪ ، 95 ٪ ، 100 ٪ ، 100 ٪) لمدة 1 دقيقة لكل منهما. ينقع في الزيلين لمدة 3 × 3 دقائق ويغلق الشرائح²⁵.

9. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)

1. قم بقياس تركيزات IL-17 و TNF-α في البلازما باستخدام المجموعات المعنية وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.

10. التحليل الإحصائي

1. التعبير عن البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM).
2. تحديد الأهمية من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) أو المقاييس المتكررة ثنائية الاتجاه ANOVA ، تليها اختبارات Bonferroni أو Tamhane T2 اللاحقة.
3. ضع في اعتبارك أن P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

طورت الفئران النموذجية التي يسببها PG أعراض التهاب المفاصل المحيطي ، والتي تتميز باحمرار وتورم الأطراف وأصابع القدم ، وطورت تدريجيا التهاب المفاصل المحوري في وقت مبكر من الأسبوع 14 ، وهو مشابه جدا لمظهر AS. لذلك ، اعتبر نموذج الماوس AS ناجحا إذا كان مؤشر التهاب المفاصل (الذكاء الاصطناعي) أكثر ...

Discussion

يتجلى AS سريريا كألم تورم في الظهر وأسفل الظهر والمفاصل ، وقد يحدث تشوه في العمود الفقري وصلابة المفاصل في الحالات الشديدة²⁶. يمكن أن يؤدي التشخيص والعلاج المبكر إلى تحسين نوعية الحياة وتقليل معدلات الإعاقة وتحسين توقعات المرضى الذين يعانون من AS. وفقا للطب الصيني التقليدي (TCM) ،...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% EDTA	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol pads	HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machine	Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubes	Axygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)	aladdin,Shanghai, China	F393378
cotton ball	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauze	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting board	self-preparation
decorin from bovine articular cartilage	Sigma-Aldrich, MO, USA	D8428
depilatory cream	Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scale	Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tube	Axygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricant	Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
ginger	self-preparation
GraphPad Prism 7 software	GraphPad Software,Boston, USA
hair clipper	Super human Group CO LTD, Jinhua, China
heating pads	Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	aladdin,Shanghai, China	F393371
injection syringe	Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isoflurane	Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China	R510-22-10
joss stick	Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicer	Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knife	self-preparation
lighter	Zhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortar	Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kit	absin, Shanghai, China	abs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	Wuhan Sanying, Wuhan, China	KE10002
mulberry paper	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFT	Xinruan,Shanghai, China	XR-XZ301
paper cup	self-preparation
pipettes	OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvet	self-preparation
rotarod	Xinruan,Shanghai, China	XR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissors	Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machine	Leica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 software	International Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powder	self-preparation
tips	Biosharp, Labgic, Beijing, China
writing brush	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China