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Resumo

Este trabalho descreve em detalhes os procedimentos operacionais e precauções a serem tomadas durante a Dumoxabustão no tratamento da espondilite anquilosante em camundongos experimentais.

Resumo

A espondilite anquilosante (EA) é uma forma de artrite que piora e incapacita progressivamente e afeta principalmente o esqueleto axial. Esta doença envolve principalmente a coluna vertebral e a articulação sacroilíaca. A fusão da coluna vertebral e da articulação sacroilíaca pode ocorrer no estágio mais avançado da doença, resultando em rigidez e cifose da coluna vertebral, bem como dificuldade para deambular, o que afeta seriamente a qualidade do trabalho e das atividades de vida diária e impõe uma pesada sobrecarga ao paciente, à família e à sociedade. Cada vez mais atenção tem sido dada à não-farmacoterapia como terapia alternativa para EA. A moxabustão é uma técnica terapêutica milenar utilizada na Medicina Tradicional Chinesa (MTC). A terapia de dumoxabustão, um tratamento externo único e inovador desenvolvido com base na moxabustão comum, tem um efeito terapêutico definitivo na EA. Du-moxabustão combina habilmente as técnicas compatíveis da MTC para integrar meridianos, acupontos, fitoterapia chinesa e moxabustão. Este trabalho descreve detalhadamente os procedimentos operacionais e precauções a serem tomadas durante a Du-moxabustão em camundongos experimentais para fornecer uma base experimental para o estudo do mecanismo da Du-moxabustão no tratamento da EA.

Introdução

A espondilite anquilosante (EA) é uma forma de artrite que piora e incapacita progressivamente e afeta principalmente o esqueleto axial. De acordo com o último levantamento epidemiológico, ~0,01%-1,8% das pessoas no mundo sofrem dessa condição1, a maioria dos quais são homens jovens (a proporção homem:mulher é ~2-3:1)2. A incidência de EA na população chinesa é de 0,2%-0,4%. Esta doença envolve principalmente a coluna vertebral e a articulação sacroilíaca. A fusão da coluna vertebral e da articulação sacroilíaca pode ocorrer nos estágios mais avançados da doença, resultando em rigidez e cifose da coluna vertebral, além de dificuldade de deambulação, o que afeta seriamente a qualidade do trabalho e das atividades de vida diária e impõe sobrecarga ao paciente, à família e àsociedade1. Atualmente, não há uma solução definitiva para a EA, e os tratamentos oferecidos, tanto farmacológicos quanto não farmacológicos, concentram-se principalmente no alívio da dor, retardando a progressão da doença e melhorando a qualidade de vida. Nos últimos anos, como as opções farmacoterapêuticas têm sido muito limitadas3, cada vez mais atenção tem sido dada à não farmacoterapia, que se tornou uma terapia alternativa para EA. Na China, os pacientes geralmente preferem o tratamento externo que consiste em Medicina Tradicional Chinesa (MTC), que tem efeitos colaterais menores e grande conveniência durante o tratamento.

A moxabustão é uma técnica terapêutica milenar utilizada na MTC. Du-moxabustão é uma técnica de tratamento externo que consiste em "moxabustão medicamentosa com espuma" no segmento da coluna vertebral do meridiano de Du. É usado principalmente no tratamento da EA e tem mostrado segurança e eficácia. Comparada com a moxabustão comum, a Du-moxabustão tem as características de uma ampla área de moxabustão, um grande cone de moxa, forte poder de fogo e alta temperatura4. Uma revisão sistemática e metanálise sugerem que a moxabustão é um tratamento complementar eficaz para EA5. Um estudo recente confirmou que os sintomas clínicos e alguns fatores inflamatórios de pacientes com EA melhoraram com a moxabustão6. Estudos revelaram que a Dumoxabustão pode aumentar o conteúdo cerebral de β-endorfina e exercer um efeito analgésico central7, diminuir a expressãodo gene HLA-B27 8 e retardar a taxa de recorrência da EA. A dumoxabustão também tem um efeito melhorador na progressão da EA, diminuindo o índice inflamatório VHS (VHS) e os níveis de proteína C reativa (PCR), peptídeo C-terminal do colágeno tipo I (CTX-I) e proteína Dickkopf1 (DKK1)9,10.

Outro estudo clínico mostrou que a Dumoxabustão pode ajustar ainda mais os subtipos desordenados de células T, Ig e complemento C3 para equilibrar o mecanismo imunológico11. Em termos de metabolismo ósseo, a moxabustão pode inibir a elevação da fosfatase alcalina (FA) e do fósforo séricos (S-P), aumentar o cálcio sérico (S-Ca), a densidade mineral óssea (DMO) e a resistência óssea12. Além disso, a Dumoxabustão pode reparar a função espinhal em múltiplos pontos para aliviar os sintomas de fadiga em pacientes com EA13. Alguns estudos em animais revelaram o mecanismo potencial da moxabustão no tratamento da EA. Um estudo indicou que a moxabustão melhorou significativamente o estado geral de saúde, reduziu os níveis de espessura da pata e diminuiu os níveis de IL-1β, PGE2, IL-6 e TNF-α nas amostras de tecido ligamentar da coluna vertebral. A análise das vias metabólicas relacionou os metabólitos identificados ao ciclo do ADT, bem como ao metabolismo de lipídios, aminoácidos, flora intestinal e purinas14. Outro estudo mostrou que a moxabustão suprimiu a expressão de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β, TNF-α, IL-17 e IL-6; reduziu os níveis de mRNA de RANKL, RANK, ALP e OCN; e melhorou as características histopatológicas em camundongos EA15.

Embora esses estudos sugiram que a moxabustão pode ser eficaz no tratamento da EA, mais pesquisas são necessárias para confirmar esses achados e determinar o protocolo de tratamento ideal para moxabustão em pacientes com EA. Nossa equipe criou e modificou a terapia de moxabustão com base na teoria básica e operação prática da moxabustão tradicional chinesa, que tem sido amplamente realizada e aplicada na prática clínica chinesa há mais de 35 anos. Embora existam poucos estudos de alta qualidade sobre o tratamento da EA por Dumoxabustão, sua indicação no tratamento da EA tem sido apoiada por evidências. No entanto, o mecanismo de tratamento da EA com Dumoxabustão merece mais estudos. O estudo em animais é um método importante para explorar o mecanismo da Du-moxabustão no tratamento da EA. A operação clínica da Du-moxabustão é relativamente madura, mas raramente utilizada no estudo do mecanismo em experimentos animais. Este trabalho descreve em detalhes a operação e as precauções a serem tomadas durante a Du-moxabustão no tratamento de camundongos experimentais EA.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Revisão de Ética em Bem-Estar Animal Experimental da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong (nº. SDUTCM20230831301).

1. Preparo dos animais

  1. Determinar previamente os grupos experimentais e o número de animais por grupo.
  2. Escolha camundongos BALb/c machos, abrigue-os a uma temperatura constante de 22 ± 1 °C, umidade constante de 60 ± 5% e ambiente de luz de ciclo diurno de 12 h.

2. Estabelecimento do modelo de mouse AS

OBS: O modelo de EA foi induzido com proteoglicano de cartilagem (PG), que é um método clássico de modelagem16,17,18,19,20,21. Camundongos da linhagem BALB/c foram repetidamente imunizados com PG para induzir tendinite e espondilite. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados aos materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

  1. Use uma pipeta de 200 μL para extrair 200 μL de PG e CFA (ou IFA) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Agitar suavemente para misturar o líquido no tubo da centrífuga.
  2. Coloque o tubo de centrífuga no moedor de tecido para homogeneização e, em seguida, incube no gelo por 4 min. Repita 5x. Defina os seguintes parâmetros no moedor de tecidos: 60 Hz, moagem 30 s, intervalo 10 s para um total de 6 ciclos.
  3. Extrair 0,2 ml de proteína PG emulsificada do tubo de centrifugação com uma seringa de 1 ml.
  4. Pegue e fixe o mouse com a mão esquerda. Coloque o rato em posição supina, mantendo a cabeça mais baixa do que a cauda para evitar danos aos órgãos abdominais quando a seringa for inserida.
  5. Esterilize o abdômen com compressas de álcool usando a mão direita.
  6. Com a seringa na mão direita, insira a agulha por via subcutânea ligeiramente à esquerda ou à direita da linha alba ventralis na metade inferior do abdómen.
  7. Empurre a agulha 3-5 mm subcutaneamente paralela à linha abdominal média e, em seguida, empurre a agulha para a cavidade abdominal em um ângulo de 45° em relação à pele.
  8. Penetre no peritônio, retire o tampão da agulha e injete lentamente a proteína PG emulsionada.

3. Dumoxabustão

NOTA: Preparar com antecedência as três matérias-primas mais importantes para a Du-moxabustão (Figura 1).

  1. Prepare cones de moxa. Pegue o veludo na mão, com duas palmas voltadas para direções opostas exercendo uma força de torção para esfregar o veludo em forma de fuso (Figura 2)
  2. Corte o gengibre em pedaços pequenos e purê em um espremedor de suco (Figura 3). Filtre o purê de gengibre através de gaze de algodão. Separe o suco de gengibre e a lama de gengibre do purê de gengibre para se preparar para o próximo passo.
  3. Prepare 10 g de lama de gengibre e 20 mL de suco de gengibre e coloque-os em copos de papel para uso posterior.
  4. Pesar 0,1 g de pó de MTC (uma mistura de canela em pó, cravo em pó, notopterygium em pó, antagarina em pó e almíscar artificial)22 e triturá-lo em uma argamassa.
  5. Colocar os ratos na caixa de indução anestésica do aparelho de anestesia animal e anestesiar-os com uma mistura de isoflurano a 2-3% e oxigênio a uma taxa de fluxo de 2 L/min.
  6. Avaliar a profundidade da anestesia observando a ausência de um reflexo de sobressalto inicialmente e verificar o nível de anestesia cirúrgica verificando a ausência de um reflexo pedal em resposta a um suave pinçamento dos dedos.
  7. Depois que o mouse atingir a anestesia no plano cirúrgico, retire-o da caixa e fixe-o na mesa de cirurgia em decúbito ventral. Alinhe a boca e o nariz do rato com a saída do anestésico.
  8. Administrar anestesia através de uma máscara acoplada ao aparelho de anestesia, através da qual isoflurano e oxigênio são administrados através de um circuito sem reinalação. Manter a anestesia e manter o mouse sobre uma almofada de aquecimento a 37 °C durante todo o procedimento operacional. Aplique lubrificante nos olhos para evitar a dessecação.
  9. Localizar os acupontos e identificar a área de estimulação (Figura 4).
  10. Faça a barba no cabelo na parte de trás do rato até que a pele cor de carne na parte de trás do rato seja vista. Certifique-se de que a largura da depilação seja de ~1,5 cm e que o comprimento seja da sétima vértebra cervical até a vértebra caudal (Figura 5A).
  11. Aplicar o suco de gengibre preparado com gaze de algodão na área raspada (Figura 3).
  12. Polvilhe o pó de MTC uniformemente com um pincel de escrita na linha mediana do dorso do rato e cubra-o com papel amoreira (Figura 5B-D).
  13. Faça uma coluna trapezoidal de gengibre com 6 cm de comprimento, 1,5 cm de largura e 3 mm de espessura com lama de gengibre. Fixe a coluna de gengibre no papel amoreira (Figura 5E).
  14. Faça um sulco acima da linha média da coluna de gengibre (Figura 3) e coloque o cone de moxa na coluna de gengibre.
  15. Acenda o cone de moxa, colocando um novo cone de moxa depois que o anterior queimar. Verifique a firmeza da coluna de gengibre para evitar a queimadura do rato, queimando um total de três cones (Figura 5F).
  16. Após a queima dos cones de moxa, limpe o gengibre e o pó TCM e limpe a parte de trás do mouse. Interrompa a anestesia neste momento.
  17. Permita que o rato recupere a consciência numa nova gaiola com acesso irrestrito a comida e água. Coloque a gaiola em uma almofada aquecida para ajudar no processo de recuperação. Monitore o animal até que ele recupere a consciência suficiente.
  18. Uma vez que o mouse tenha se recuperado completamente, confirme a presença do reflexo de retificação antes de devolvê-lo ao seu alojamento normal.
    NOTA: Durante a operação, é necessário monitorar o estado mental dos ratos para evitar a respiração fraca. Evite escaldamento, mas mantenha os ratos aquecidos e evite hematomas nas garras e na cauda.

4. Avaliação do índice de artrite (IA)

  1. Avalie o escore de IA três vezes: antes da modelagem, após a modelagem e após o tratamento. Os padrões de avaliação são os seguintes: 0, sem vermelhidão ou inchaço; 1, ligeira vermelhidão ou inchaço em alguns dedos; 2, vermelhidão e inchaço na maioria das articulações dos dedos dos pés e dos pés; 3, vermelhidão grave e inchaço nos pés e abaixo da articulação do tornozelo; e 4, vermelhidão e inchaço nos pés e articulação do tornozelo23.
  2. Calcule os escores de IA das quatro patas, com um valor máximo de 16.

5. Teste de Rotarod

NOTA: O teste rotarod é usado para avaliar a coordenação motora e o equilíbrio, registrando o tempo que os ratos passam no tambor giratório. Este experimento consistiu de três tentativas separadas por intervalos de 20 min. Os dados oficiais do teste foram registrados a partir da terceira tentativa, com os dois primeiros servindo como exercícios de treinamento.

  1. Coloque os mouses em tambores giratórios que giram sob aceleração contínua de 4 a 40 rpm sobre 300 s24.
  2. Meça o tempo de latência (o tempo até o mouse cair da haste). Providencie acolchoamento para evitar lesões quando cair.

6. Teste de campo aberto (OFT)

OBS: O TPO é utilizado para avaliar o estado de movimento autonômico, visando identificar o comportamento patológico. Quatro arenas quadradas de campo aberto (50 cm x 50 cm x 40 cm) foram colocadas juntas para formar o aparelho. O fundo da caixa foi dividido em nove quadrados iguais.

  1. Controlar o ruído de fundo do laboratório para menos de 65 dB.
  2. Limpe todo o aparelho com etanol a 75% antes de cada ensaio.
  3. Coloque todos os ratos na sala de testes 1 h antes do teste para permitir que eles se adaptem ao seu ambiente.
  4. Coloque os ratos nas arenas quadradas de campo aberto e deixe-os explorar por 10 min.
  5. Registre a distância total e a velocidade de movimento por 10 min.

7. Eutanásia e coleta de espécimes

  1. Coloque o camundongo na caixa de indução anestésica e anestesia-o com uma mistura de isoflurano a 2-3% e oxigênio a uma taxa de fluxo de 2 L/min. Uma vez que o rato entra em um estado de anestesia profunda confirmado pela falta de reflexo pedal, transfira-o para a mesa de cirurgia para anestesia de manutenção.
  2. Pegue e fixe o mouse com a mão não dominante.
  3. Pressione levemente a área dos olhos para deixar os globos oculares congestionados e salientes.
  4. Use tesouras para aparar os bigodes do rato para evitar a hemólise causada pelos pelos.
  5. Confirme a profundidade da anestesia verificando a ausência de um reflexo pedal em resposta a uma pinça do dedo do pé. Use pinças para agarrar o globo ocular e removê-lo rapidamente, permitindo que o sangue flua para um tubo de microcentrífuga da cavidade ocular.
    NOTA: Métodos alternativos de coleta de sangue, como punção cardíaca, também podem ser usados.
  6. Quando a taxa de gotejamento de sangue diminuir, pressione suavemente a área cardíaca do rato para acelerar o bombeamento de sangue e obter mais sangue. Em seguida, eutanasiar o camundongo usando deslocamento cervical.
  7. Segure a perna logo acima da articulação do tornozelo usando pinça na mão não dominante. Em seguida, corte a perna logo acima da articulação do tornozelo usando uma tesoura.

8. Análise histológica

  1. Imergir os espécimes de tornozelo em paraformaldeído a 4% por mais de 24 h. Descalcificar em EDTA a 10% (pH = 7,4) por 1 mês.
  2. Mergulhe os espécimes em paraformaldeído a 4% por 2 h.
  3. Em seguida, mergulhe os espécimes em um gradiente de concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). Deixe de molho cada concentração de etanol por 1 h.
  4. Mergulhe os espécimes em xileno por 3 h.
  5. Imergir os espécimes de tornozelo em parafina por 7 h. Reserve os blocos de parafina em geladeira a 4 °C.
  6. Corte blocos de parafina até uma espessura de 6 μm usando uma máquina de seccionamento de parafina semiautomática.
  7. Deixe as fatias de molho por 4 x 5 min em xileno para completar a desparafinação.
  8. Mergulhe as fatias em um gradiente de concentrações decrescentes de etanol (100%, 100%, 95%, 75%) por 2 min cada. Mergulhe em água destilada por 2 min.
  9. Manchar as fatias com hematoxilina por 10 min e enxaguar com água destilada por 5 s.
  10. Mergulhe as fatias por 30 s no fluido de diferenciação e enxágue com água destilada por 5 s.
  11. Manchar as fatias com eosina por 1 min e enxaguar com água destilada por 3 min.
  12. Mergulhe as fatias em um gradiente de concentrações crescentes de etanol (80%, 95%, 100%, 100%) por 1 min cada. Mergulhe em xileno por 3 x 3 min e sele as fatias25.

9. Ensaio imunoenzimático (ELISA)

  1. Medir as concentrações de IL-17 e TNF-α no plasma usando os respectivos kits de acordo com as instruções do fabricante.

10. Análise estatística

  1. Expresse os dados como média ± erro padrão da média (EPM).
  2. Determinar a significância por meio de análise de variância (ANOVA) one-way ou ANOVA de medidas repetidas two-way, seguida pelos testes post hoc de Bonferroni ou Tamhane T2.
  3. Considere P < 0,05 estatisticamente significante.

Resultados

Camundongos modelo induzidos por PG desenvolveram sintomas de artrite periférica, caracterizada por vermelhidão e inchaço das extremidades e dos dedos, e gradualmente desenvolveram artrite axial já na semana 14, que é muito semelhante à manifestação da EA. Portanto, o modelo de EA em camundongos foi considerado bem-sucedido se o índice de artrite (IA) fosse superior a 3 pontos em 14 semanas após a última injeção22. Quando as patas dos camundongos pareciam inchadas, o tratamento Du-mox...

Discussão

A EA manifesta-se clinicamente como dor nas costas, lombar e edema articular, podendo ocorrer deformidade da coluna vertebral e rigidez articular em casos graves26. O diagnóstico e o tratamento precoces podem melhorar a qualidade de vida, reduzir as taxas de incapacidade e melhorar o prognóstico de pacientes com EA. De acordo com a medicina tradicional chinesa (MTC), acredita-se que a EA seja causada por uma deficiência de Yang no rim e no meridiano de Du, bem como um acúmulo de mal frio inter...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Geral da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No.82174491) e pelo Projeto de Herança da Escola Acadêmica de Medicina Tradicional Chinesa da Qilu (No. Lu Weihan [2020]132). Obrigado ao Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong por nos fornecer condições experimentais.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10% EDTAShanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol padsHYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machineMedical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubesAxygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)aladdin,Shanghai, ChinaF393378
cotton ballHenan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauzeHenan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting boardself-preparation
decorin from bovine articular cartilageSigma-Aldrich, MO, USAD8428
depilatory creamVeet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scaleShanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tubeAxygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricantBeijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
gingerself-preparation
GraphPad Prism 7 softwareGraphPad Software,Boston, USA
hair clipperSuper human Group CO LTD, Jinhua, China
heating padsShenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)aladdin,Shanghai, ChinaF393371
injection syringeShandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isofluraneShenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, ChinaR510-22-10
joss stickShijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicerBraun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knifeself-preparation
lighterZhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortarLuoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kitabsin, Shanghai, Chinaabs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA KitWuhan Sanying, Wuhan, ChinaKE10002
mulberry paperYishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFTXinruan,Shanghai, ChinaXR-XZ301
paper cupself-preparation
pipettesOXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvetself-preparation
rotarodXinruan,Shanghai, ChinaXR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinderNingbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissorsShandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machineLeica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 softwareInternational Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powderself-preparation
tipsBiosharp, Labgic, Beijing, China
writing brushYishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China

Referências

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