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요약

이 논문은 실험용 마우스의 강직성 척추염 치료에서 Du-moxibustion 동안 취해야 할 수술 절차와 예방 조치를 자세히 설명합니다.

초록

강직성 척추염(AS)은 주로 축 골격에 영향을 미치는 점진적으로 악화되고 무력화되는 형태의 관절염입니다. 이 질병은 주로 척추와 천장관절을 침범한다. 말기에는 척추와 천장관절의 유합이 일어나 척추 경직과 후만증, 보행의 어려움 등이 발생할 수 있으며, 이는 업무의 질과 일상생활에 심각한 영향을 미치고 환자와 가족, 사회에 큰 부담을 줍니다. AS의 대체 요법으로 비약물 요법에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 뜸은 중국 전통 의학(TCM)에서 사용되는 고대 치료 기법입니다. 듀뜸 요법은 일반 뜸을 기반으로 개발된 독특하고 혁신적인 외부 치료법으로 AS에 확실한 치료 효과가 있습니다. Du-moxibustion은 TCM의 호환 기술을 능숙하게 결합하여 경락, 경혈, 한약 및 뜸을 통합합니다. 본 논문은 AS의 치료에서 Du-moxibustion의 메커니즘 연구를 위한 실험적 기초를 제공하기 위해 실험용 마우스에서 Du-moxibustion 동안 취해야 할 수술 절차 및 주의사항을 자세히 설명합니다.

서문

강직성 척추염(AS)은 주로 축 골격에 영향을 미치는 점진적으로 악화되고 무력화되는 형태의 관절염입니다. 최신 역학 조사에 따르면, 전 세계 인구의 ~0.01%-1.8%가이 질환을 앓고 있으며1, 그 중 대부분은 젊은 남성입니다(남녀 비율은 ~2-3:1)2. 중국 인구의 AS 발생률은 0.2%-0.4%입니다. 이 질병은 주로 척추와 천장관절을 침범한다. 말기에는 척추와 천장관절의 유합이 일어나 척추 경직과 후만증, 보행의 어려움 등이 발생할 수 있으며, 이는 업무의 질과 일상생활에 심각한 영향을 미치고 환자와 가족, 사회에 큰 부담을 준다1. 현재 AS에 대한 확실한 해결책은 없으며, 제공되는 약리학적 및 비약물적 치료법은 주로 통증 완화, 질병 진행 지연 및 삶의 질 향상에 중점을 둡니다. 최근 몇 년 동안 약물 요법 옵션이 매우 제한적이었기 때문에3 AS의 대체 요법이 된 비약물 요법에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 중국에서는 환자들이 종종 중국 전통 의학(TCM)으로 구성된 외부 치료를 선호하는데, 이는 부작용이 적고 치료 중 편의성이 매우 높습니다.

뜸은 한의학에서 사용되는 고대 치료 기법입니다. Du-moxibustion은 Du meridian의 척추 분절에 "거품이 있는 약용 뜸"으로 구성된 외부 치료 기술입니다. 주로 AS 치료에 사용되며 안전성과 효과를 보여주었습니다. 일반 뜸에 비해 두뜸은 넓은 뜸 면적, 큰 뜸 원뿔, 강한 화력 및 고온4의 특성을 가지고 있습니다. 체계적 문헌고찰 및 메타 분석에 따르면 뜸은 AS5에 대한 효과적인 보완 치료법이다. 최근 연구에 따르면 AS 환자의 임상 증상과 일부 염증 요인이 뜸에 의해 개선되는 것으로 확인되었다6. 연구에 따르면 듀뜸은 뇌에서 β-엔돌핀의 함량을 증가시키고 중추 진통 효과를 발휘하며7 HLA-B27 유전자의 발현을 하향 조절하고8 AS의 재발률을 지연시킬 수 있다. Du-moxibustion은 또한 염증 지수 ESR(ESR)과 C-반응성 단백질(CRP), I형 콜라겐의 C-말단 펩타이드(CTX-I) 및 Dickkopf1 단백질(DKK1)9,10의 수준을 감소시켜 AS의 진행을 개선하는 효과가 있습니다.

또 다른 임상 연구에서는 Du-moxibustion이 무질서한 T 세포 하위 집합인 Ig를 추가로 조정하고 C3를 보완하여 면역 메커니즘의 균형을 맞출 수 있음을 보여주었습니다11. 뼈 대사 측면에서 뜸은 혈청 알칼리성 인산가수분해효소(ALP)와 혈청 인(S-P)의 증가를 억제하고 혈청 칼슘(S-Ca), 골밀도(BMD) 및 골강도를 증가시킬 수 있다12. 또한, 두뜸은 여러 지점에서 척추 기능을 회복시켜 AS 환자의 피로 증상을 완화할 수 있다13. 일부 동물 연구에서는 AS를 치료하는 데 있어 뜸의 잠재적 메커니즘이 밝혀졌습니다. 한 연구에 따르면 뜸은 척추의 인대 조직 샘플에서 전반적인 건강 상태를 크게 개선하고 발 두께를 줄이며 IL-1β, PGE2, IL-6 및 TNF-α 수치를 감소시키는 것으로 나타났습니다. 대사 경로 분석은 확인된 대사 산물을 TCA 회로뿐만 아니라 지질, 아미노산, 장내 세균총 및 퓨린 대사와 연결시켰다14. 또 다른 연구에 따르면 뜸은 전염증성 사이토카인, IL-1β, TNF-α, IL-17 및 IL-6의 발현을 억제했습니다. RANKL, RANK, ALP 및 OCN의 mRNA 수준을 감소시켰습니다. AS 마우스15에서 조직병리학적 특징을 개선하였다.

이러한 연구는 뜸이 AS 치료에 효과적일 수 있음을 시사하지만, 이러한 결과를 확인하고 AS 환자의 뜸에 대한 최적의 치료 프로토콜을 결정하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다. 우리 팀은 35년 이상 중국 임상 실습에서 널리 수행되고 적용되어 온 중국 전통 뜸의 기본 이론과 실제 작동을 기반으로 뜸 요법을 만들고 수정했습니다. 듀뜸에 의한 AS 치료에 대한 양질의 연구는 거의 없지만, AS의 치료에 대한 적응증은 증거에 의해 뒷받침되었습니다. 그러나 Du-moxibustion으로 AS를 치료하는 메커니즘은 추가 연구가 필요합니다. 동물 연구는 AS 치료에서 Du-moxibustion의 메커니즘을 탐구하는 중요한 방법입니다. Du-moxibustion의 임상 운영은 비교적 성숙하지만 동물 실험에서 메커니즘 연구에 거의 사용되지 않습니다. 이 논문은 AS 실험 마우스의 처리에서 Du-moxibustion 동안 취해야 할 작동 및 예방 조치에 대해 자세히 설명합니다.

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프로토콜

모든 동물실험은 산둥중의학대학 실험동물복지윤리심의위원회의 승인을 받았다(No. SDUTCM20230831301).

1. 동물 준비

  1. 실험군과 집단당 동물의 수를 미리 결정한다.
  2. 수컷 BALb/c 마우스를 선택하여 22 ± 1 °C의 일정한 온도, 60 ± 5%의 일정한 습도 및 12시간의 일주기 조명 환경에서 보관합니다.

2. AS 마우스 모델 구축

참고: AS 모델은 고전적인 모델링 방법 16,17,18,19,20,21인 연골 프로테오글리칸(PG)으로 유도되었습니다. BALB/c 균주 마우스를 PG로 반복적으로 면역시켜 건염 및 척추염을 유발했습니다. 이 프로토콜에 사용된 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

  1. 200μL 피펫을 사용하여 200μL의 PG 및 CFA(또는 IFA)를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 원심분리기 튜브에 있는 액체를 섞기 위해 부드럽게 흔듭니다.
  2. 균질화를 위해 원심분리기 튜브를 조직 분쇄기에 넣은 다음 얼음 위에서 4분 동안 배양합니다. 티슈 그라인더에서 다음 매개변수를 설정합니다: 60Hz, 연삭 30초, 간격 10초 동안 총 6사이클.
  3. 1mL 주사기로 원심분리 튜브에서 0.2mL의 유화된 PG 단백질을 추출합니다.
  4. 왼손으로 마우스를 잡고 고정합니다. 주사기를 삽입할 때 복부 장기가 손상되지 않도록 머리를 꼬리보다 낮게 유지하면서 마우스를 누운 자세로 눕힙니다.
  5. 오른손을 사용하여 알코올 면봉으로 복부를 소독합니다.
  6. 오른손에 주사기를 들고 바늘을 복부 하반부에 있는 복부(linea alba ventralis)의 왼쪽 또는 오른쪽으로 약간 피하 삽입합니다.
  7. 바늘을 복부 중간선과 평행하게 피하 3-5mm 밀어 넣은 다음 바늘을 피부에 대해 45° 각도로 복강에 밀어 넣습니다.
  8. 복막에 침투하여 바늘 플러그를 빼고 유화 된 PG 단백질을 천천히 주입합니다.

3. 두뜸

알림: Du-moxibustion을 위한 가장 중요한 세 가지 원료를 미리 준비하십시오(그림 1).

  1. 뜸 콘을 준비합니다. 두 손바닥이 반대 방향을 향하도록 벨벳을 손에 들고 비틀림 힘을 가하여 벨벳을 스핀들 모양으로 문지릅니다(그림 2)
  2. 생강을 작은 조각으로 자르고 착즙기에 넣어 퓌레로 만듭니다(그림 3). 생강 퓌레를 면 거즈로 걸러냅니다. 생강 퓌레에서 생강 주스와 생강 진흙을 분리하여 다음 단계를 준비합니다.
  3. 생강 진흙 10g과 생강즙 20mL를 준비하여 나중에 사용할 수 있도록 종이컵에 담습니다.
  4. TCM 분말(계피 분말, 정향 분말, 노토페리지움 분말, 안타리딘 분말 및 인공 사향의 혼합물)22 0.1g의 무게를 달고 절구에 갈아 넣습니다.
  5. 마우스를 동물 마취 기계의 마취 유도 상자에 넣고 2L/min의 유속으로 2-3% 이소플루란과 산소의 혼합물로 마취합니다.
  6. 초기에 놀람 반사가 없는지 관찰하여 마취 깊이를 평가하고 부드러운 발가락 꼬집기에 반응하여 페달 반사가 없는지 확인하여 수술 마취 수준을 확인합니다.
  7. 마우스가 수술면 마취에 도달한 후 상자에서 꺼내 엎드린 자세로 수술대에 고정합니다. 마우스의 입과 코를 마취제의 배출구에 맞춥니다.
  8. 마취 기계에 부착된 마스크를 통해 마취를 투여하고, 이를 통해 이소플루란과 산소가 비재호흡 회로를 통해 전달됩니다. 마취를 유지하고 전체 수술 절차 동안 마우스를 37°C 가열 패드에 유지하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈에 윤활제를 바르십시오.
  9. 경혈을 찾아 자극 부위를 확인합니다(그림 4).
  10. 쥐 뒷면의 살색 피부가 보일 때까지 쥐 뒷면의 털을 면도합니다. 제모 너비가 ~1.5cm이고 길이가 일곱 번째 경추에서 꼬리 척추까지인지 확인합니다(그림 5A).
  11. 면도 부위에 면봉으로 준비한 생강즙을 면도 부위에 바릅니다(그림 3).
  12. 마우스 뒷면의 중앙선에 붓으로 TCM 가루를 골고루 뿌리고 뽕나무 종이로 덮습니다(그림 5B-D).
  13. 생강 진흙으로 길이 6cm, 너비 1.5cm, 두께 3mm의 사다리꼴 생강 기둥을 만듭니다. 뽕나무 종이에 생강 기둥을 고정합니다(그림 5E).
  14. 생강 기둥의 정중선 위에 홈을 만들고(그림 3) 생강 기둥에 뜸쑥 콘을 놓습니다.
  15. 뜸 원뿔에 불을 붙이고 이전 원뿔이 타버린 후 새 뜸 원뿔을 놓습니다. 마우스가 타는 것을 방지하기 위해 생강 기둥의 견고성을 확인하여 총 3개의 원뿔을 태웁니다(그림 5F).
  16. 뜸쑥 콘을 태운 후 생강과 TCM 가루를 닦아내고 마우스 뒷면을 청소합니다. 이 시점에서 마취를 중단하십시오.
  17. 쥐가 음식과 물에 제한 없이 접근할 수 있는 새 케이지에서 의식을 되찾을 수 있도록 합니다. 회복 과정을 돕기 위해 가열된 패드에 케이지를 놓습니다. 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지 관찰하십시오.
  18. 마우스가 완전히 회복되면 일반 하우징으로 되돌리기 전에 오른쪽 반사의 존재를 확인하십시오.
    알림: 수술 중에는 약한 호흡을 피하기 위해 쥐의 정신 상태를 모니터링해야 합니다. 화상을 입지 않도록 하되 쥐를 따뜻하게 유지하고 발톱과 꼬리에 멍이 들지 않도록 하십시오.

4. 관절염 지수(AI) 평가

  1. AI 점수를 모델링 전, 모델링 후, 처리 후의 세 번 평가합니다. 평가 기준은 다음과 같습니다 : 0, 발적이나 부종이 없습니다. 1, 몇 개의 발가락에 약간의 발적 또는 부기; 2, 대부분의 발가락 관절과 발가락의 발적과 부기; 3, 발과 발목 관절 아래의 심각한 발적 및 부종; 4, 발과 발목 관절의 발적 및 부종23.
  2. 최대값 16으로 네 발 모두의 AI 점수를 계산합니다.

5. 로타로드 테스트

알림: 회전 테스트는 마우스가 회전 드럼에서 보내는 시간을 기록하여 운동 조정과 균형을 평가하는 데 사용됩니다. 이 실험은 20분 간격으로 3번의 시행으로 구성되었습니다. 공식 테스트 데이터는 세 번째 실험에서 기록되었으며, 처음 두 번은 훈련 연습으로 사용되었습니다.

  1. 마우스를 300초24에 걸쳐 4에서 40rpm까지 연속 가속도로 회전하는 회전 드럼 위에 놓는다.
  2. 대기 시간(마우스가 로드에서 떨어질 때까지의 시간)을 측정합니다. 패딩이 떨어질 때 부상을 방지하기 위해 패딩을 제공하십시오.

6. 오픈 필드 테스트(OFT)

알림: OFT는 병리학적 행동을 식별하기 위해 자율 운동 상태를 평가하는 데 사용됩니다. 4 개의 정사각형 오픈 필드 경기장 (50cm x 50cm x 40cm)을 함께 배치하여 장치를 형성했습니다. 상자의 바닥은 9개의 동일한 사각형으로 나뉘어져 있습니다.

  1. 실험실의 배경 소음을 65dB 미만으로 제어합니다.
  2. 각 시도 전에 75% 에탄올로 전체 장치를 닦으십시오.
  3. 모든 마우스를 테스트 1시간 전에 시험실에 두어 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
  4. 정사각형 야외 경기장에 쥐를 놓고 10분 동안 탐험하게 합니다.
  5. 10분 동안 총 거리와 이동 속도를 기록합니다.

7. 안락사 및 검체 채취

  1. 마우스를 마취 유도 상자에 넣고 2L/min의 유속으로 2-3% 이소플루란과 산소의 혼합물로 마취합니다. 마우스가 페달 반사 부족으로 확인된 깊은 마취 상태에 들어가면 유지 마취를 위해 수술대로 옮깁니다.
  2. 자주 사용하지 않는 손으로 마우스를 잡고 고정합니다.
  3. 눈가를 가볍게 누르면 안구가 울혈되어 튀어나오게 됩니다.
  4. 머리카락으로 인한 용혈을 방지하기 위해 가위를 사용하여 쥐의 수염을 다듬습니다.
  5. 발가락 꼬집음에 대한 반응으로 페달 반사가 없는지 확인하여 마취 깊이를 확인합니다. 겸자를 사용하여 안구를 잡고 신속하게 제거하여 혈액이 안와에서 미세 원심분리기 튜브로 흐르도록 합니다.
    알림: 심장 천자와 같은 대체 혈액 수집 방법도 사용할 수 있습니다.
  6. 혈액 방울 속도가 느려지면 쥐의 심장 부위를 부드럽게 눌러 혈액 펌핑 속도를 높이고 더 많은 혈액을 얻습니다. 그런 다음 자궁 경부 탈구를 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.
  7. 주로 사용하지 않는 손의 집게를 사용하여 발목 관절 바로 위의 다리를 잡습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 발목 관절 바로 위의 다리를 자릅니다.

8. 조직학적 분석

  1. 발목 표본을 4% 파라포름알데히드에 24시간 이상 담그십시오. 1개월 동안 10% EDTA(pH = 7.4)로 석회질을 제거합니다.
  2. 표본을 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 담그십시오.
  3. 그런 다음 에탄올 농도가 증가하는 그래디언트(70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%)에 표본을 담그십시오. 각 에탄올 농도를 1시간 동안 담그십시오.
  4. 표본을 크실렌에 3시간 동안 담그십시오.
  5. 발목 표본을 파라핀에 7시간 동안 담그십시오. 파라핀 블록은 4°C 냉장고에 따로 보관합니다.
  6. 반자동 파라핀 절편 기계를 사용하여 파라핀 블록을 6μm 두께로 자릅니다.
  7. 왁스 제거를 완료하기 위해 자일렌에 4 x 5분 동안 조각을 담그십시오.
  8. 에탄올 농도가 감소하는 그라데이션(100%, 100%, 95%, 75%)에 각각 2분 동안 슬라이스를 담그십시오. 증류수에 2분 동안 담그십시오.
  9. 헤마톡실린으로 조각을 10분 동안 얼룩을 묻히고 증류수로 5초 동안 헹굽니다.
  10. 슬라이스를 분화액에 30초 동안 담그고 증류수로 5초 동안 헹굽니다.
  11. 조각에 에오신을 1분 동안 얼룩지게 하고 증류수로 3분 동안 헹굽니다.
  12. 에탄올 농도가 증가하는 그라데이션(80%, 95%, 100%, 100%)에 각각 1분 동안 슬라이스를 담그십시오. 크실렌에 3 x 3분 동안 담그고 슬라이스를밀봉합니다 25.

9. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)

  1. 제조업체의 지침에 따라 각 키트를 사용하여 혈장 내 IL-17 및 TNF-α 농도를 측정합니다.

10. 통계 분석

  1. 데이터를 평균± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현합니다.
  2. 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 이원 반복 측도 분산 분석(ANOVA)을 통해 유의성을 확인한 후 Bonferroni 또는 Tamhane T2의 사후 검정을 수행합니다.
  3. P < 0.05가 통계적으로 유의하다고 가정합니다.

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결과

PG에 의해 유발된 모델 마우스는 사지와 발가락의 발적과 부종을 특징으로 하는 말초 관절염 증상을 보였고, AS의 발현과 매우 유사한 14주차에 점차적으로 축성 관절염이 발생했다. 따라서, AS 마우스 모델은 마지막 주사 후 14주에 관절염 지수(AI)가 3점 이상이면 성공한 것으로 간주되었다22. 쥐의 발이 부어오른 것처럼 보이면 일주일에 한 번 총 3회 두뜸 치료를 실시하였다. 치료 ...

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토론

AS는 임상적으로 등, 요추 및 관절 부종 통증으로 나타나며, 심한 경우 척추 기형 및 관절 경직이 발생할 수 있다26. 조기 진단과 치료는 삶의 질을 향상시키고, 장애율을 낮추며, AS 환자의 예후를 개선할 수 있습니다. 중국 전통 의학(TCM)에 따르면 AS는 신장과 두경락의 양(陽)이 결핍되어 내부에 냉악이 축적되어 발생하는 것으로 알려져 있습니다. TCM은 경락의 개념에 기초한 뜸이 ...

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공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.82174491)의 일반 프로그램 (No.82174491)과 Qilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project (No. Lu Weihan [2020]132). 실험 조건을 제공해 주신 Shandong University of Traditional Chinese Medicine의 Laboratory Animal Center에 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10% EDTAShanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol padsHYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machineMedical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubesAxygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)aladdin,Shanghai, ChinaF393378
cotton ballHenan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauzeHenan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting boardself-preparation
decorin from bovine articular cartilageSigma-Aldrich, MO, USAD8428
depilatory creamVeet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scaleShanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tubeAxygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricantBeijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
gingerself-preparation
GraphPad Prism 7 softwareGraphPad Software,Boston, USA
hair clipperSuper human Group CO LTD, Jinhua, China
heating padsShenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)aladdin,Shanghai, ChinaF393371
injection syringeShandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isofluraneShenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, ChinaR510-22-10
joss stickShijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicerBraun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knifeself-preparation
lighterZhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortarLuoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kitabsin, Shanghai, Chinaabs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA KitWuhan Sanying, Wuhan, ChinaKE10002
mulberry paperYishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFTXinruan,Shanghai, ChinaXR-XZ301
paper cupself-preparation
pipettesOXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvetself-preparation
rotarodXinruan,Shanghai, ChinaXR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinderNingbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissorsShandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machineLeica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 softwareInternational Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powderself-preparation
tipsBiosharp, Labgic, Beijing, China
writing brushYishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China

참고문헌

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