Du-moxibustione in un modello murino di spondilite anchilosante

Riepilogo

Questo documento descrive in dettaglio le procedure operative e le precauzioni da prendere durante la Du-moxibustione nel trattamento della spondilite anchilosante nei topi da esperimento.

Abstract

La spondilite anchilosante (AS) è una forma di artrite progressivamente peggiorante e invalidante che colpisce principalmente lo scheletro assiale. Questa malattia coinvolge principalmente la colonna vertebrale e l'articolazione sacroiliaca. La fusione della colonna vertebrale e dell'articolazione sacroiliaca può verificarsi nella fase successiva della malattia, con conseguente rigidità spinale e cifosi, nonché difficoltà a camminare, che influisce seriamente sulla qualità del lavoro e delle attività quotidiane e impone un pesante fardello al paziente, alla famiglia e alla società. Una crescente attenzione è stata rivolta alla non-farmacoterapia come terapia alternativa per la SA. La moxibustione è un'antica tecnica terapeutica utilizzata nella Medicina Tradizionale Cinese (MTC). La terapia della du-moxibustione, un trattamento esterno unico e innovativo sviluppato sulla base della moxibustione ordinaria, ha un effetto terapeutico definito sulla SA. La du-moxibustione combina abilmente le tecniche compatibili della MTC per integrare meridiani, agopunti, fitoterapia cinese e moxibustione. Questo articolo descrive in dettaglio le procedure operative e le precauzioni da prendere durante la Du-moxibustione nei topi sperimentali per fornire una base sperimentale per lo studio del meccanismo della Du-moxibustione nel trattamento della SA.

Introduzione

La spondilite anchilosante (AS) è una forma di artrite progressivamente peggiorante e invalidante che colpisce principalmente lo scheletro assiale. Secondo l'ultima indagine epidemiologica, ~0,01%-1,8% delle persone nel mondo soffre di questa condizione¹, la maggior parte dei quali sono giovani maschi (il rapporto maschi/femmine è ~2-3:1)². L'incidenza della SA nella popolazione cinese è dello 0,2%-0,4%. Questa malattia coinvolge principalmente la colonna vertebrale e l'articolazione sacroiliaca. La fusione della colonna vertebrale e dell'articolazione sacroiliaca può verificarsi nelle fasi successive della malattia, con conseguente rigidità spinale e cifosi, nonché difficoltà a camminare, che influisce seriamente sulla qualità del lavoro e delle attività della vita quotidiana e impone un pesante onere al paziente, alla famiglia e alla società¹. Attualmente, non esiste una soluzione definitiva per la SA e i trattamenti forniti, sia farmacologici che non farmacologici, si concentrano principalmente sull'alleviare il dolore, rallentare la progressione della malattia e migliorare la qualità della vita. Negli ultimi anni, poiché le opzioni farmacoterapeutiche sono state molto limitate³, è stata prestata una crescente attenzione alla non farmacoterapia, che è diventata una terapia alternativa per la SA. In Cina, i pazienti spesso preferiscono un trattamento esterno costituito dalla Medicina Tradizionale Cinese (MTC), che ha effetti collaterali minori e una grande comodità durante il trattamento.

La moxibustione è un'antica tecnica terapeutica utilizzata nella MTC. La du-moxibustione è una tecnica di trattamento esterno che consiste in una "moxibustione medicata con schiuma" sul segmento della colonna vertebrale del meridiano Du. Viene utilizzato principalmente nel trattamento della SA e ha dimostrato sicurezza ed efficacia. Rispetto alla moxibustione ordinaria, la Du-moxibustione ha le caratteristiche di un'ampia area di moxibustione, un grande cono di moxa, una forte potenza di fuoco e un'alta temperatura⁴. Una revisione sistematica e una meta-analisi suggeriscono che la moxibustione è un trattamento complementare efficace per l'AS⁵. Uno studio recente ha confermato che i sintomi clinici e alcuni fattori infiammatori dei pazienti con SA sono stati migliorati dalla moxibustione⁶. Gli studi hanno rivelato che la du-moxibustione può aumentare il contenuto cerebrale di β-endorfine ed esercitare un effetto analgesico centrale⁷, sottoregolare l'espressione del gene HLA-B27 ⁸ e ritardare il tasso di recidiva di AS. La du-moxibustione ha anche un effetto migliorativo sulla progressione della SA diminuendo l'indice infiammatorio VES (VES) e i livelli di proteina C-reattiva (CRP), peptide C-terminale del collagene di tipo I (CTX-I) e proteina Dickkopf1 (DKK1)^9,10.

Un altro studio clinico ha dimostrato che la du-moxibustione può regolare ulteriormente i sottoinsiemi di cellule T disordinate, Ig e C3 del complemento per bilanciare il meccanismo immunitario¹¹. In termini di metabolismo osseo, la moxibustione può inibire l'aumento della fosfatasi alcalina sierica (ALP) e del fosforo sierico (S-P), aumentare il calcio sierico (S-Ca), la densità minerale ossea (BMD) e la resistenza ossea¹². Inoltre, la du-moxibustione può riparare la funzione spinale in più punti per alleviare i sintomi di affaticamento nei pazienti con SA¹³. Alcuni studi sugli animali hanno rivelato il potenziale meccanismo della moxibustione nel trattamento della SA. Uno studio ha indicato che la moxibustione ha migliorato significativamente lo stato di salute generale, ha ridotto i livelli di spessore della zampa e ha diminuito i livelli di IL-1β, PGE2, IL-6 e TNF-α nei campioni di tessuto legamentoso della colonna vertebrale. L'analisi della via metabolica ha collegato i metaboliti identificati al ciclo del TCA, nonché al metabolismo dei lipidi, degli aminoacidi, della flora intestinale e delle purine¹⁴. Un altro studio ha dimostrato che la moxibustione sopprime l'espressione di citochine pro-infiammatorie, IL-1β, TNF-α, IL-17 e IL-6; riduzione dei livelli di mRNA di RANKL, RANK, ALP e OCN; e migliorato le caratteristiche istopatologiche nei topi AS¹⁵.

Sebbene questi studi suggeriscano che la moxibustione possa essere efficace nel trattamento della SA, sono necessarie ulteriori ricerche per confermare questi risultati e determinare il protocollo di trattamento ottimale per la moxibustione nei pazienti con AS. Il nostro team ha creato e modificato la terapia di moxibustione basata sulla teoria di base e sul funzionamento pratico della moxibustione tradizionale cinese, che è stata ampiamente eseguita e applicata nella pratica clinica cinese per oltre 35 anni. Sebbene esistano pochi studi di alta qualità sul trattamento della SA mediante Du-moxibustione, la sua indicazione nel trattamento della SA è stata supportata da prove. Tuttavia, il meccanismo di trattamento della SA con Du-moxibustione merita ulteriori studi. Lo studio sugli animali è un metodo importante per esplorare il meccanismo della Du-moxibustione nel trattamento della SA. Il funzionamento clinico della Du-moxibustione è relativamente maturo, ma raramente utilizzato nello studio del meccanismo negli esperimenti sugli animali. Questo articolo descrive in dettaglio il funzionamento e le precauzioni da prendere durante la du-moxibustione nel trattamento di topi sperimentali con SA.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Revisione Etica del Benessere Animale Sperimentale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong (n. SDUTCM20230831301).

1. Preparazione dell'animale

1. Determinare in anticipo i gruppi sperimentali e il numero di animali per gruppo.
2. Scegliere topi maschi BALb/c, alloggiarli a una temperatura costante di 22 ± 1 °C, un'umidità costante del 60 ± 5% e un ambiente leggero a ciclo diurno di 12 ore.

2. Messa a punto del modello murino AS

NOTA: Il modello AS è stato indotto con proteoglicano cartilagineo (PG), che è un metodo di modellazione classico 16,17,18,19,20,21. I topi del ceppo BALB/c sono stati ripetutamente immunizzati con PG per indurre tendinite e spondilite. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi ai materiali, ai reagenti e agli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Utilizzare una pipetta da 200 μL per aspirare 200 μL di PG e CFA (o IFA) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Agitare delicatamente per mescolare il liquido nella provetta da centrifuga.
2. Posizionare la provetta da centrifuga nel macinino per l'omogeneizzazione e quindi incubare su ghiaccio per 4 min. Ripetere 5 volte. Impostare i seguenti parametri nella smerigliatrice per tessuti: 60 Hz, macinatura 30 s, intervallo 10 s per un totale di 6 cicli.
3. Estrarre 0,2 mL di proteina PG emulsionata dalla provetta da centrifuga con una siringa da 1 mL.
4. Afferra e fissa il mouse con la mano sinistra. Appoggiare il topo in posizione supina, tenendo la testa più bassa della coda per evitare danni agli organi addominali quando la siringa viene inserita.
5. Sterilizzare l'addome con tamponi imbevuti di alcol usando la mano destra.
6. Con la siringa nella mano destra, inserire l'ago per via sottocutanea leggermente a sinistra o a destra della linea alba ventralis nella metà inferiore dell'addome.
7. Spingere l'ago per via sottocutanea di 3-5 mm parallelamente alla linea addominale centrale e poi spingere l'ago nella cavità addominale con un angolo di 45° rispetto alla pelle.
8. Penetrare nel peritoneo, estrarre il tappo dell'ago e iniettare lentamente la proteina PG emulsionata.

3. Du-moxibustione

NOTA: Preparare in anticipo le tre materie prime più importanti per la Du-moxibustione (Figura 1).

1. Preparare i coni di moxa. Prendi il velluto in mano, con due palmi rivolti in direzioni opposte che esercitano una forza di torsione per strofinare il velluto a forma di fuso (Figura 2)
2. Tagliate lo zenzero a pezzetti e frullatelo in uno spremiagrumi (Figura 3). Filtrare la purea di zenzero attraverso una garza di cotone. Separa il succo di zenzero e il fango di zenzero dalla purea di zenzero per prepararti al passaggio successivo.
3. Preparare 10 g di fango allo zenzero e 20 ml di succo di zenzero e metterli nei bicchieri di carta per un uso successivo.
4. Pesare 0,1 g di polvere di MTC (una miscela di cannella in polvere, chiodi di garofano in polvere, notopterigium in polvere, polvere di antaridina e muschio artificiale)²² e macinarla in un mortaio.
5. Posizionare i topi nella scatola di induzione dell'anestesia della macchina per anestesia animale e anestetizzarli con una miscela di isoflurano al 2-3% e ossigeno a una portata di 2 L/min.
6. Valutare la profondità dell'anestesia osservando inizialmente l'assenza di un riflesso di trasalimento e verificare il livello di anestesia chirurgica controllando l'assenza di un riflesso del pedale in risposta a un leggero pizzicamento delle dita dei piedi.
7. Dopo che il topo ha raggiunto l'anestesia piana chirurgica, estrarlo dalla scatola e fissarlo sul tavolo operatorio in posizione prona. Allineare la bocca e il naso del topo con l'uscita dell'anestetico.
8. Somministrare l'anestesia tramite una maschera collegata alla macchina per anestesia, attraverso la quale l'isoflurano e l'ossigeno vengono erogati tramite un circuito di non respirazione. Mantenere l'anestesia e tenere il mouse su un termoforo a 37 °C durante l'intera procedura operativa. Applicare il lubrificante sugli occhi per prevenire l'essiccazione.
9. Individuare i punti di agopuntura e identificare l'area di stimolazione (Figura 4).
10. Radersi i peli sul dorso del mouse fino a quando non si vede la pelle color carne sul dorso del topo. Assicurarsi che la larghezza della depilazione sia ~1,5 cm e che la lunghezza vada dalla settima vertebra cervicale alla vertebra della coda (Figura 5A).
11. Applicare il succo di zenzero preparato con una garza di cotone sulla zona rasata (Figura 3).
12. Cospargere uniformemente la polvere di MTC con un pennello da scrittura sulla linea mediana del dorso del mouse e coprirla con carta di gelso (Figura 5B-D).
13. Realizzare una colonna trapezoidale di zenzero lunga 6 cm, larga 1,5 cm e spessa 3 mm con fango di zenzero. Fissate la colonna di zenzero sulla carta di gelso (Figura 5E).
14. Fai una scanalatura sopra la linea mediana della colonna di zenzero (Figura 3) e posiziona il cono di moxa sulla colonna di zenzero.
15. Accendi il cono di moxa, posizionando un nuovo cono di moxa dopo che il precedente si è bruciato. Controllare la solidità della colonna di zenzero per evitare di bruciare il topo, bruciando un totale di tre coni (Figura 5F).
16. Dopo aver bruciato i coni di moxa, rimuovi lo zenzero e la polvere di MTC e pulisci la parte posteriore del mouse. A questo punto interrompere l'anestesia.
17. Consenti al topo di riprendere conoscenza in una nuova gabbia con accesso illimitato a cibo e acqua. Posiziona la gabbia su un cuscinetto riscaldato per aiutare il processo di recupero. Monitora l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza.
18. Una volta che il mouse si è completamente ripreso, confermare la presenza del riflesso di raddrizzamento prima di riportarlo nel suo alloggiamento normale.
    NOTA: Durante l'operazione, è necessario monitorare lo stato mentale dei topi per evitare una respirazione debole. Previeni le scottature, ma tieni i topi al caldo ed evita di ammaccare gli artigli e la coda.

4. Valutazione dell'indice di artrite (AI)

1. Valutare il punteggio AI tre volte: prima della modellazione, dopo la modellazione e dopo il trattamento. Gli standard di valutazione sono i seguenti: 0, nessun arrossamento o gonfiore; 1, leggero arrossamento o gonfiore in alcune dita dei piedi; 2, arrossamento e gonfiore nella maggior parte delle articolazioni delle dita dei piedi e delle dita dei piedi; 3, grave arrossamento e gonfiore ai piedi e sotto l'articolazione della caviglia; e 4, arrossamento e gonfiore ai piedi e all'articolazione della caviglia²³.
2. Calcola i punteggi AI di tutte e quattro le zampe, con un valore massimo di 16.

5. Prova di Rotarod

NOTA: Il test rotarod viene utilizzato per valutare la coordinazione motoria e l'equilibrio registrando il tempo che i topi trascorrono sul tamburo rotante. Questo esperimento consisteva in tre prove separate da intervalli di 20 minuti. I dati ufficiali dei test sono stati registrati dalla terza prova, con le prime due che sono servite come esercizi di addestramento.

1. Posizionare i mouse su tamburi rotanti che ruotano con accelerazione continua da 4 a 40 giri/min per 300 s²⁴.
2. Misura il tempo di latenza (il tempo fino a quando il mouse non cade dall'asta). Fornire un'imbottitura per evitare lesioni quando cade.

6. Test in campo aperto (OFT)

NOTA: L'OFT viene utilizzato per valutare lo stato del movimento autonomo, con l'obiettivo di identificare il comportamento patologico. Quattro arene quadrate in campo aperto (50 cm x 50 cm x 40 cm) sono state posizionate insieme per formare l'apparato. Il fondo della scatola era diviso in nove quadrati uguali.

1. Controllare il rumore di fondo del laboratorio al di sotto di 65 dB.
2. Pulire l'intero apparecchio con etanolo al 75% prima di ogni prova.
3. Posizionare tutti i topi nella sala di prova 1 ora prima del test per consentire loro di adattarsi al loro ambiente.
4. Metti i topi nelle arene quadrate in campo aperto e lascia che esplorino per 10 minuti.
5. Registra la distanza totale e la velocità di movimento per 10 minuti.

7. Eutanasia e raccolta di campioni

1. Posizionare il topo nella scatola di induzione dell'anestesia e anestetizzarlo con una miscela di isoflurano al 2-3% e ossigeno a una portata di 2 L/min. Una volta che il topo entra in uno stato di anestesia profonda confermato da una mancanza di riflesso del pedale, trasferirlo sul tavolo operatorio per l'anestesia di mantenimento.
2. Afferra e fissa il mouse con la mano non dominante.
3. Premere leggermente sul contorno occhi per congestionare e sporgere i bulbi oculari.
4. Usa le forbici per tagliare i baffi del topo per prevenire l'emolisi causata dai peli.
5. Confermare la profondità dell'anestesia controllando l'assenza di un riflesso del pedale in risposta a un pizzicamento del dito del piede. Usa una pinza per afferrare il bulbo oculare e rimuoverlo rapidamente, consentendo al sangue di fluire in una provetta da microcentrifuga dall'orbita oculare.
   NOTA: È possibile utilizzare anche metodi alternativi di raccolta del sangue, come la puntura cardiaca.
6. Quando la velocità di gocciolamento del sangue rallenta, premere delicatamente sull'area cardiaca del topo per accelerare il pompaggio del sangue e ottenere più sangue. Quindi, sopprimere il topo usando la lussazione cervicale.
7. Tieni la gamba appena sopra l'articolazione della caviglia usando le pinze nella mano non dominante. Quindi, taglia la gamba appena sopra l'articolazione della caviglia usando le forbici.

8. Analisi istologica

1. Immergere i campioni di caviglia in paraformaldeide al 4% per più di 24 ore. Decalcificare in EDTA al 10% (pH = 7,4) per 1 mese.
2. Immergere i campioni in paraformaldeide al 4% per 2 ore.
3. Quindi, immergere i campioni in un gradiente di concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). Immergere ogni concentrazione di etanolo per 1 ora.
4. Immergere i campioni in xilene per 3 ore.
5. Immergere i campioni di caviglia in paraffina per 7 ore. Mettere da parte i blocchi di paraffina in frigorifero a 4 °C.
6. Affettare i blocchi di paraffina fino a uno spessore di 6 μm utilizzando una sezionatrice semiautomatica per paraffina.
7. Immergere le fette per 4 x 5 minuti nello xilene per completare la deceratura.
8. Immergere le fette in un gradiente di concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 100%, 95%, 75%) per 2 minuti ciascuna. Immergere in acqua distillata per 2 min.
9. Colorare le fette con ematossilina per 10 minuti e risciacquare con acqua distillata per 5 secondi.
10. Immergere le fette per 30 secondi nel liquido di differenziazione e risciacquare con acqua distillata per 5 secondi.
11. Colorare le fette con eosina per 1 minuto e sciacquare con acqua distillata per 3 minuti.
12. Immergere le fette in un gradiente di concentrazioni crescenti di etanolo (80%, 95%, 100%, 100%) per 1 minuto ciascuna. Immergere nello xilene per 3 x 3 minuti e sigillare le fette²⁵.

9. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

1. Misurare le concentrazioni plasmatiche di IL-17 e TNF-α utilizzando i rispettivi kit secondo le istruzioni del produttore.

10. Analisi statistica

1. Esprimere i dati come media ± errore standard della media (SEM).
2. Determinare la significatività attraverso l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) o l'ANOVA a misure ripetute a due vie, seguite dai test post hoc di Bonferroni o Tamhane T2.
3. Si consideri statisticamente significativo P < 0,05.

Risultati

I topi modello indotti da PG hanno sviluppato sintomi di artrite periferica, caratterizzata da arrossamento e gonfiore delle estremità e delle dita dei piedi, e hanno gradualmente sviluppato l'artrite assiale già alla settimana 14, che è molto simile alla manifestazione dell'AS. Pertanto, il modello murino AS è stato considerato efficace se l'indice di artrite (AI) era superiore a 3 punti a 14 settimane dopo l'ultima iniezione²². Quando le zampe dei topi apparivano gonfie, il trattamento Du-mo...

Discussione

La SA si manifesta clinicamente con dolore alla schiena, lombare e articolare e nei casi più gravi possono verificarsi deformità della colonna vertebrale e rigidità articolare²⁶. La diagnosi e il trattamento precoci possono migliorare la qualità della vita, ridurre i tassi di disabilità e migliorare la prognosi dei pazienti con AS. Secondo la medicina tradizionale cinese (MTC), si ritiene che la SA sia causata da una carenza di Yang nel rene e nel meridiano Du, nonché da un accumulo di male ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% EDTA	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol pads	HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machine	Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubes	Axygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)	aladdin,Shanghai, China	F393378
cotton ball	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauze	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting board	self-preparation
decorin from bovine articular cartilage	Sigma-Aldrich, MO, USA	D8428
depilatory cream	Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scale	Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tube	Axygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricant	Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
ginger	self-preparation
GraphPad Prism 7 software	GraphPad Software,Boston, USA
hair clipper	Super human Group CO LTD, Jinhua, China
heating pads	Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	aladdin,Shanghai, China	F393371
injection syringe	Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isoflurane	Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China	R510-22-10
joss stick	Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicer	Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knife	self-preparation
lighter	Zhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortar	Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kit	absin, Shanghai, China	abs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	Wuhan Sanying, Wuhan, China	KE10002
mulberry paper	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFT	Xinruan,Shanghai, China	XR-XZ301
paper cup	self-preparation
pipettes	OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvet	self-preparation
rotarod	Xinruan,Shanghai, China	XR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissors	Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machine	Leica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 software	International Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powder	self-preparation
tips	Biosharp, Labgic, Beijing, China
writing brush	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China