Ankilozan Spondilitin Fare Modelinde Du-Moxibustion

Özet

Bu yazıda deneysel farelerde ankilozan spondilit tedavisinde Du-yakı sırasında ameliyat prosedürleri ve alınması gereken önlemler ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

Özet

Ankilozan spondilit (AS), primer olarak aksiyel iskeleti etkileyen, giderek kötüleşen ve sakat bırakan bir artrit formudur. Bu hastalık esas olarak omurga ve sakroiliak eklemi içerir. Hastalığın ilerleyen dönemlerinde omurga ve sakroiliak eklemin kaynaşması meydana gelebilmekte ve omurga sertliği ve kifozun yanı sıra yürüme güçlüğü ile sonuçlanmakta, bu da iş ve günlük yaşam aktivitelerinin kalitesini ciddi şekilde etkileyerek hastaya, aileye ve topluma ağır bir yük getirmektedir. AS için alternatif bir tedavi olarak farmakoterapiye artan bir ilgi gösterilmiştir. Yakı, Geleneksel Çin Tıbbında (TCM) kullanılan eski bir terapötik tekniktir. Sıradan yakı temelinde geliştirilen benzersiz ve yenilikçi bir dış tedavi olan yakı tedavisi, AS üzerinde kesin bir terapötik etkiye sahiptir. Du-moxibustion, meridyenleri, akupunktur noktalarını, Çin bitkisel tıbbını ve yakıyı entegre etmek için TCM'nin uyumlu tekniklerini ustaca birleştirir. Bu makale, AS tedavisinde Du-yakı mekanizmasının incelenmesi için deneysel bir temel sağlamak amacıyla deneysel farelerde Du-yakı sırasında alınacak operasyon prosedürlerini ve alınacak önlemleri ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Giriş

Ankilozan spondilit (AS), primer olarak aksiyel iskeleti etkileyen, giderek kötüleşen ve sakat bırakan bir artrit formudur. En son epidemiyolojik araştırmaya göre, dünyadaki insanların ~%0,01-%1,8'i bu durumdan muzdariptir¹, bunların çoğu genç erkeklerdir (erkek/kadın oranı ~2-3:1'dir)². Çin popülasyonunda AS insidansı %0.2-%0.4'tür. Bu hastalık esas olarak omurga ve sakroiliak eklemi içerir. Hastalığın ilerleyen dönemlerinde omurga ve sakroiliak eklemin kaynaşması ortaya çıkarak omurga sertliği ve kifozun yanı sıra yürüme güçlüğü ile sonuçlanabilir, bu da iş ve günlük yaşam aktivitelerinin kalitesini ciddi şekilde etkileyerek hastaya, aileye ve topluma ağır bir yük getirir¹. Şu anda, AS için kesin bir çözüm yoktur ve hem farmakolojik hem de farmakolojik olmayan sağlanan tedaviler öncelikle ağrıyı hafifletmeye, hastalığın ilerlemesini yavaşlatmaya ve yaşam kalitesini artırmaya odaklanmaktadır. Son yıllarda, farmakoterapötik seçeneklerin^{çok sınırlı olması} nedeniyle3, AS için alternatif bir tedavi haline gelen farmakoterapiye artan bir ilgi gösterilmiştir. Çin'de hastalar genellikle küçük yan etkileri olan ve tedavi sırasında büyük kolaylık sağlayan Geleneksel Çin Tıbbı'ndan (TCM) oluşan harici tedaviyi tercih ederler.

Yakı, TCM'de kullanılan eski bir terapötik tekniktir. Du-yakı, Du meridyeninin omurga segmentinde "köpüklü ilaçlı yakı"dan oluşan harici bir tedavi tekniğidir. Esas olarak AS tedavisinde kullanılır ve güvenlik ve etkinlik göstermiştir. Sıradan yakı ile karşılaştırıldığında, Du-yakı geniş bir yakı alanı, büyük bir moxa konisi, güçlü ateş gücü ve yüksek sıcaklık^{özelliklerine sahiptir 4}. Sistematik bir inceleme ve meta-analiz, yakının AS⁵ için etkili bir tamamlayıcı tedavi olduğunu göstermektedir. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, AS hastalarının klinik semptomlarının ve bazı inflamatuar faktörlerinin yakı⁶ ile düzeldiğini doğrulamıştır. Çalışmalar, Du-yakının β-endorfinin beyin içeriğini artırabildiğini ve merkezi bir analjezik etki⁷ uygulayabildiğini, HLA-B27 geninin⁸ ekspresyonunu aşağı regüle edebildiğini ve AS'nin nüks oranını geciktirdiğini ortaya koymuştur. Du-yakı ayrıca inflamatuar indeks ESR (ESR) ve C-reaktif protein (CRP), tip I kollajenin C-terminal peptidi (CTX-I) ve Dickkopf1 proteini (DKK1) seviyelerini azaltarak AS'nin ilerlemesi üzerinde iyileştirici bir etkiye ^sahiptir9,10.

Başka bir klinik çalışma, Du-yakının, bağışıklık mekanizmasını dengelemek için düzensiz T hücresi alt kümelerini, Ig'yi ve kompleman C3'ü daha da ayarlayabildiğini gösterdi¹¹. Kemik metabolizması açısından, yakı serum alkalin fosfataz (ALP) ve serum fosforunun (SP) yükselişini inhibe edebilir, serum kalsiyumunu (S-Ca), kemik mineral yoğunluğunu (BMD) ve kemik gücünü artırabilir¹². Ayrıca, Du-moxibustion, AS hastalarında yorgunluk semptomlarını hafifletmek için omurga fonksiyonunu birden fazla noktada onarabilir¹³. Bazı hayvan çalışmaları, AS tedavisinde yakının potansiyel mekanizmasını ortaya koymuştur. Bir çalışma, yakının genel sağlık durumunu önemli ölçüde iyileştirdiğini, pençe kalınlığı seviyelerini azalttığını ve omurganın bağ dokusu örneklerinde IL-1β, PGE2, IL-6 ve TNF-α seviyelerini azalttığını göstermiştir. Metabolik yol analizi, tanımlanan metabolitleri TCA döngüsünün yanı sıra lipit, amino asit, bağırsak florası ve pürin metabolizmasına bağladı¹⁴. Başka bir çalışma, yakının pro-inflamatuar sitokinler, IL-1β, TNF-α, IL-17 ve IL-6'nın ekspresyonunu baskıladığını gösterdi; RANKL, RANK, ALP ve OCN'nin mRNA seviyelerini azalttı; ve AS farelerinde histopatolojik özellikleri geliştirdi¹⁵.

Bu çalışmalar yakının AS tedavisinde etkili olabileceğini düşündürse de, bu bulguları doğrulamak ve AS'li hastalarda yakı için optimal tedavi protokolünü belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Ekibimiz, 35 yılı aşkın bir süredir Çin klinik pratiğinde yaygın olarak yürütülen ve uygulanan geleneksel Çin yakısının temel teorisine ve pratik işleyişine dayalı olarak yakı tedavisini yarattı ve değiştirdi. Yakı ile AS tedavisi ile ilgili az sayıda yüksek kaliteli çalışma olmasına rağmen, AS tedavisindeki endikasyonu kanıtlarla desteklenmiştir. Bununla birlikte, AS'yi Du-yakı ile tedavi etme mekanizması daha fazla çalışmaya değer. Hayvan çalışması, AS tedavisinde Du-yakı mekanizmasını araştırmak için önemli bir yöntemdir. Du-yakının klinik çalışması nispeten olgundur, ancak hayvan deneylerinde mekanizmanın incelenmesinde nadiren kullanılır. Bu yazıda AS deney farelerinin tedavisinde yakı sırasında yapılması gereken işlemler ve alınması gereken önlemler ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Shandong Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Deneysel Hayvan Refahı Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır (No. SDUTCM20230831301).

1. Hayvan hazırlama

1. Deney gruplarını ve grup başına hayvan sayısını önceden belirleyin.
2. Erkek BALb/c fareleri seçin, onları 22 ± 1 °C sabit sıcaklıkta, %60 ± %5 sabit nemde ve 12 saat günlük döngü ışık ortamında barındırın.

2. AS fare modelinin kurulması

NOT: AS modeli, klasik bir modelleme yöntemi^{olan kıkırdak} proteoglikan (PG) ile indüklenmiştir 16,17,18,19,20,21. BALB / c suş fareleri, tendinit ve spondiliti indüklemek için tekrar tekrar PG ile aşılandı. Bu protokolde kullanılan malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 200 μL PG ve CFA (veya IFA) çekmek için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Santrifüj tüpündeki sıvıyı karıştırmak için hafifçe çalkalayın.
2. Santrifüj tüpünü homojenizasyon için doku öğütücüye yerleştirin ve ardından 4 dakika buz üzerinde inkübe edin. Doku öğütücüde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 60 Hz, öğütme 30 s, aralık 10 s toplam 6 döngü.
3. 1 mL'lik bir şırınga ile santrifüj tüpünden 0.2 mL emülsifiye PG proteini çıkarın.
4. Fareyi sol elinizle tutun ve sabitleyin. Şırınga yerleştirildiğinde karın organlarına zarar vermemek için fareyi sırtüstü pozisyonda tutun, başını kuyruktan daha aşağıda tutun.
5. Sağ elinizi kullanarak karnı alkollü bezlerle sterilize edin.
6. Şırınga sağ elinizdeyken, iğneyi karnın alt yarısındaki linea alba ventralis'in soluna veya sağına hafifçe sokun.
7. İğneyi orta karın çizgisine paralel olarak deri altından 3-5 mm itin ve ardından iğneyi cilde 45° açıyla karın boşluğuna itin.
8. Peritona nüfuz edin, iğne tıkacını çekin ve emülsifiye edilmiş PG proteinini yavaşça enjekte edin.

3. Yakı

NOT: Yakı için en önemli üç hammaddeyi önceden hazırlayın (Şekil 1).

1. Moxa kozalakları hazırlayın. Kadifeyi elinize alın, iki avuç içi zıt yönlere bakacak şekilde kadifeyi bir mil şekline sokmak için bir büküm kuvveti uygulayın (Şekil 2)
2. Zencefili küçük parçalar halinde kesin ve bir meyve sıkacağı içinde püre haline getirin (Şekil 3). Zencefil püresini pamuklu gazlı bezden süzün. Bir sonraki adıma hazırlanmak için zencefil suyunu ve zencefil çamurunu zencefil püresinden ayırın.
3. 10 gr zencefil çamuru ve 20 mL zencefil suyu hazırlayın ve daha sonra kullanmak üzere kağıt bardaklara koyun.
4. 0.1 g TCM tozunu (tarçın tozu, karanfil tozu, notopteryjium tozu, antaridin tozu ve yapay misk karışımı)²² tartın ve bir havanda öğütün.
5. Fareleri hayvan anestezi makinesinin anestezi indüksiyon kutusuna yerleştirin ve 2 L / dak akış hızında% 2-3 izofluran ve oksijen karışımı ile uyuşturun.
6. Başlangıçta bir irkilme refleksinin yokluğunu gözlemleyerek anestezi derinliğini değerlendirin ve hafif bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt olarak bir pedal refleksinin olup olmadığını kontrol ederek cerrahi anestezi seviyesini doğrulayın.
7. Fare cerrahi düzlem anestezisine ulaştıktan sonra, kutudan çıkarın ve yüzüstü pozisyonda ameliyat masasına sabitleyin. Farenin ağzını ve burnunu anestezinin çıkışıyla hizalayın.
8. Anesteziyi, izofluran ve oksijenin yeniden solunmayan bir devre yoluyla iletildiği anestezik makineye bağlı bir maske aracılığıyla uygulayın. Anesteziyi koruyun ve tüm çalışma prosedürü boyunca fareyi 37 °C'lik bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Kurumayı önlemek için gözlere kayganlaştırıcı sürün.
9. Akupunktur noktalarını bulun ve stimülasyon alanını tanımlayın (Şekil 4).
10. Farenin arkasındaki ten rengi deri görünene kadar farenin arkasındaki kılları tıraş edin. Epilasyon genişliğinin ~ 1.5 cm olduğundan ve uzunluğun yedinci servikal omurdan kuyruk omuruna kadar olduğundan emin olun (Şekil 5A).
11. Hazırlanan zencefil suyunu pamuklu gazlı bezle traş edilen bölgeye uygulayın (Şekil 3).
12. TCM tozunu farenin arkasının orta çizgisine bir yazı fırçasıyla eşit şekilde serpin ve dut kağıdıyla örtün (Şekil 5B-D).
13. Zencefil çamuru ile 6 cm uzunluğunda, 1,5 cm genişliğinde ve 3 mm kalınlığında trapez bir zencefil sütunu yapın. Zencefil sütununu dut kağıdına sabitleyin (Şekil 5E).
14. Zencefil kolonunun orta hattının üzerinde bir oluk açın (Şekil 3) ve moxa konisini zencefil kolonunun üzerine yerleştirin.
15. Bir önceki moxa konisi yandıktan sonra yeni bir moxa konisi yerleştirerek moxa konisini yakın. Farenin yanmasını önlemek için zencefil sütununun sertliğini kontrol edin, toplam üç koni yansın (Şekil 5F).
16. Moxa kozalaklarının yanmasından sonra zencefili ve TCM tozunu silin ve farenin arkasını temizleyin. Bu noktada anesteziyi durdurun.
17. Farenin, yiyecek ve suya sınırsız erişimi olan yeni bir kafeste bilincini yeniden kazanmasına izin verin. Kurtarma işlemine yardımcı olması için kafesi ısıtılmış bir ped üzerine yerleştirin. Yeterli bilinci geri kazanana kadar hayvanı izleyin.
18. Fare tamamen iyileştikten sonra, normal yuvasına geri döndürmeden önce düzeltme refleksinin varlığını onaylayın.
    NOT: Operasyon sırasında, zayıf nefes almayı önlemek için farelerin zihinsel durumunu izlemek gerekir. Haşlanmayı önleyin, ancak fareleri sıcak tutun ve pençelerin ve kuyruğun morarmasını önleyin.

4. Artrit indeksinin (AI) değerlendirilmesi

1. AI puanını üç kez değerlendirin: modellemeden önce, modellemeden sonra ve tedaviden sonra. Değerlendirme standartları aşağıdaki gibidir: 0, kızarıklık veya şişlik yok; 1, birkaç ayak parmağında hafif kızarıklık veya şişlik; 2, çoğu ayak eklemi ve ayak parmağında kızarıklık ve şişlik; 3, ayaklarda ve ayak bileği ekleminin altında ciddi kızarıklık ve şişlik; ve 4, ayaklarda ve ayak bileği ekleminde kızarıklık ve şişlik²³.
2. Dört pençenin de AI puanlarını maksimum 16 değeriyle hesaplayın.

5. Rotarod testi

NOT: Rotarod testi, farelerin dönen tambur üzerinde geçirdikleri süreyi kaydederek motor koordinasyonunu ve dengesini değerlendirmek için kullanılır. Bu deney, 20 dakikalık aralıklarla ayrılmış üç denemeden oluşuyordu. Resmi test verileri üçüncü denemeden kaydedildi ve ilk ikisi eğitim tatbikatları olarak hizmet etti.

1. Fareleri, 4 s 40 üzerinde 300 ila²⁴ rpm arasında sürekli hızlanma altında dönen dönen tamburlara yerleştirin.
2. Gecikme süresini ölçün (fare çubuktan düşene kadar geçen süre). Düştüğünde yaralanmayı önlemek için dolgu sağlayın.

6. Açık alan testi (OFT)

NOT: OFT, patolojik davranışı tanımlamayı amaçlayan otonom hareket durumunu değerlendirmek için kullanılır. Aparatı oluşturmak için dört kare açık alan arena (50 cm x 50 cm x 40 cm) bir araya getirildi. Kutunun alt kısmı dokuz eşit kareye bölünmüştür.

1. Laboratuvarın arka plan gürültüsünü 65 dB'nin altına kadar kontrol edin.
2. Her denemeden önce tüm aparatı %75 etanol ile silin.
3. Ortamlarına uyum sağlamaları için tüm fareleri testten 1 saat önce test odasına yerleştirin.
4. Fareleri kare açık alan arenalarına koyun ve 10 dakika boyunca keşfetmelerine izin verin.
5. 10 dakika boyunca toplam mesafeyi ve hareket hızını kaydedin.

7. Ötenazi ve örnek toplama

1. Fareyi anestezi indüksiyon kutusuna yerleştirin ve 2 L/dk akış hızında% 2-3 izofluran ve oksijen karışımı ile uyuşturun. Fare, pedal refleksi eksikliği ile onaylanan derin anestezi durumuna girdiğinde, idame anestezisi için ameliyat masasına aktarın.
2. Baskın olmayan elinizle fareyi tutun ve sabitleyin.
3. Gözbebeklerinin tıkanmasını ve dışarı çıkmasını sağlamak için göz bölgesine hafifçe bastırın.
4. Kılların neden olduğu hemolizi önlemek için farenin bıyıklarını kesmek için makas kullanın.
5. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt olarak pedal refleksinin olup olmadığını kontrol ederek anestezi derinliğini onaylayın. Göz küresini kavramak için forseps kullanın ve hızlı bir şekilde çıkarın, kanın göz yuvasından bir mikrosantrifüj tüpüne akmasına izin verin.
   NOT: Kardiyak ponksiyon gibi alternatif kan alma yöntemleri de kullanılabilir.
6. Kan damlama hızı yavaşladığında, kan pompalamayı hızlandırmak ve daha fazla kan elde etmek için farenin kalp bölgesine hafifçe bastırın. Ardından, servikal çıkık kullanarak fareyi ötenazi yapın.
7. Baskın olmayan elde forseps kullanarak bacağı ayak bileği ekleminin hemen üzerinde tutun. Ardından, makas kullanarak ayak bileği ekleminin hemen üzerindeki bacağı kesin.

8. Histolojik analiz

1. Ayak bileği örneklerini 24 saatten fazla %4 paraformaldehit içine daldırın. 1 ay boyunca% 10 EDTA'da (pH = 7.4) kireçten arındırın.
2. Numuneleri 2 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde bekletin.
3. Ardından, numuneleri artan etanol konsantrasyonları (%70, %80, %90, %100, %100, %100) gradyanına batırın. Her etanol konsantrasyonunu 1 saat bekletin.
4. Numuneleri 3 saat ksilen içinde bekletin.
5. Ayak bileği örneklerini 7 saat boyunca parafine batırın. Parafin bloklarını 4 °C'lik bir buzdolabında bir kenara koyun.
6. Yarı otomatik bir parafin kesitleme makinesi kullanarak parafin bloklarını 6 μm kalınlığa kadar dilimleyin.
7. Mum alma işlemini tamamlamak için dilimleri 4 x 5 dakika ksilen içinde bekletin.
8. Dilimleri azalan etanol konsantrasyonları (%100, %100, %95, %75) gradyanlarında her biri 2 dakika bekletin. Damıtılmış suda 2 dakika bekletin.
9. Dilimleri 10 dakika hematoksilen ile boyayın ve 5 saniye boyunca damıtılmış suyla durulayın.
10. Dilimleri farklılaştırma sıvısında 30 saniye bekletin ve 5 saniye damıtılmış suyla durulayın.
11. Dilimleri 1 dakika eozin ile boyayın ve 3 dakika damıtılmış su ile durulayın.
12. Dilimleri artan etanol konsantrasyonları (%80, %95, %100, %100) gradyanında her biri 1 dakika bekletin. 3 x 3 dakika ksilen içinde bekletin ve dilimleri^{kapatın 25}.

9. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)

1. Üreticinin talimatlarına göre ilgili kitleri kullanarak plazmadaki IL-17 ve TNF-α konsantrasyonlarını ölçün.

10. İstatistiksel analiz

1. Verileri, ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak ifade edin.
2. Tek yönlü varyans analizi (ANOVA) veya iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ve ardından Bonferroni veya Tamhane T2'nin post hoc testleri ile anlamlılığı belirleyin.
3. P < 0.05'in istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.

Sonuçlar

PG kaynaklı model fareler, ekstremitelerde ve ayak parmaklarında kızarıklık ve şişme ile karakterize periferik artrit semptomları geliştirdi ve AS'nin tezahürüne çok benzeyen 14. hafta gibi erken bir tarihte yavaş yavaş eksenel artrit geliştirdi. Bu nedenle, son enjeksiyondan²² hafta sonra artrit indeksi (AI) 3 puanın üzerindeyse AS fare modeli başarılı kabul edildi. Farelerin pençeleri şişmiş göründüğünde, Du-moxibustion tedavisi haftada bir kez toplam 3x olarak gerç...

Tartışmalar

AS klinik olarak sırt, bel ve eklem şişliği ağrısı olarak kendini gösterir ve ağır vakalarda omurga deformitesi ve eklem sertliği oluşabilir²⁶. Erken tanı ve tedavi, AS'li hastaların yaşam kalitesini artırabilir, özürlülük oranlarını azaltabilir ve prognozlarını iyileştirebilir. Geleneksel Çin tıbbına (TCM) göre, AS'nin böbrekte ve Du meridyeninde Yang eksikliğinin yanı sıra dahili olarak soğuk kötülüğün birikmesinden kaynaklandığına inanılmaktadır. TCM,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% EDTA	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol pads	HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machine	Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubes	Axygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)	aladdin,Shanghai, China	F393378
cotton ball	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauze	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting board	self-preparation
decorin from bovine articular cartilage	Sigma-Aldrich, MO, USA	D8428
depilatory cream	Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scale	Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tube	Axygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricant	Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
ginger	self-preparation
GraphPad Prism 7 software	GraphPad Software,Boston, USA
hair clipper	Super human Group CO LTD, Jinhua, China
heating pads	Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	aladdin,Shanghai, China	F393371
injection syringe	Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isoflurane	Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China	R510-22-10
joss stick	Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicer	Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knife	self-preparation
lighter	Zhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortar	Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kit	absin, Shanghai, China	abs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	Wuhan Sanying, Wuhan, China	KE10002
mulberry paper	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFT	Xinruan,Shanghai, China	XR-XZ301
paper cup	self-preparation
pipettes	OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvet	self-preparation
rotarod	Xinruan,Shanghai, China	XR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissors	Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machine	Leica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 software	International Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powder	self-preparation
tips	Biosharp, Labgic, Beijing, China
writing brush	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China