Du-moxibustion dans un modèle murin de spondylarthrite ankylosante

Résumé

Cet article décrit en détail les procédures opératoires et les précautions à prendre lors de la Du-moxibustion dans le traitement de la spondylarthrite ankylosante chez la souris expérimentale.

Résumé

La spondylarthrite ankylosante (SA) est une forme d’arthrite qui s’aggrave progressivement et qui touche principalement le squelette axial. Cette maladie touche principalement la colonne vertébrale et l’articulation sacro-iliaque. La fusion de la colonne vertébrale et de l’articulation sacro-iliaque peut se produire à un stade avancé de la maladie, entraînant une raideur de la colonne vertébrale et une cyphose, ainsi que des difficultés à marcher, ce qui affecte gravement la qualité du travail et des activités de la vie quotidienne et impose un lourd fardeau au patient, à la famille et à la société. Une attention croissante a été accordée à la non-pharmacothérapie en tant que traitement alternatif de la SA. La moxibustion est une technique thérapeutique ancienne utilisée en médecine traditionnelle chinoise (MTC). La thérapie de du-moxibustion, un traitement externe unique et innovant développé sur la base de la moxibustion ordinaire, a un effet thérapeutique certain sur la SA. La damoxibustion combine habilement les techniques compatibles de la MTC pour intégrer les méridiens, les points d’acupuncture, la phytothérapie chinoise et la moxibustion. Cet article décrit en détail les procédures opératoires et les précautions à prendre lors de la Du-moxibustion chez les souris expérimentales afin de fournir une base expérimentale pour l’étude du mécanisme de la Du-moxibustion dans le traitement de la SA.

Introduction

La spondylarthrite ankylosante (SA) est une forme d’arthrite qui s’aggrave progressivement et qui touche principalement le squelette axial. Selon la dernière enquête épidémiologique, ~0,01 % à 1,8 % des personnes dans le monde souffrent de cette maladie¹, dont la plupart sont de jeunes hommes (le rapport hommes/femmes est de ~2-3 :1)². L’incidence de la SA dans la population chinoise est de 0,2 % à 0,4 %. Cette maladie touche principalement la colonne vertébrale et l’articulation sacro-iliaque. La fusion de la colonne vertébrale et de l’articulation sacro-iliaque peut se produire dans les derniers stades de la maladie, entraînant une raideur de la colonne vertébrale et une cyphose, ainsi que des difficultés à marcher, ce qui affecte gravement la qualité du travail et des activités de la vie quotidienne et impose un lourd fardeau au patient, à sa famille et à la société¹. À l’heure actuelle, il n’existe pas de solution définitive pour la SA, et les traitements fournis, tant pharmacologiques que non pharmacologiques, visent principalement à soulager la douleur, à ralentir la progression de la maladie et à améliorer la qualité de vie. Au cours des dernières années, les options pharmacothérapeutiques ayant été^{très limitées3}, une attention croissante a été accordée à la non-pharmacothérapie, qui est devenue une thérapie alternative pour la SA. En Chine, les patients préfèrent souvent un traitement externe consistant en la médecine traditionnelle chinoise (MTC), qui a des effets secondaires mineurs et une grande commodité pendant le traitement.

La moxibustion est une technique thérapeutique ancienne utilisée en MTC. La durobustion est une technique de traitement externe consistant en une « moxibustion médicamenteuse avec de la mousse » sur le segment rachidien du méridien du Du. Il est principalement utilisé dans le traitement de la spondylarthrite ankylosante et a démontré son innocuité et son efficacité. Par rapport à la moxibustion ordinaire, la Du-moxibustion présente les caractéristiques d’une large zone de moxibustion, d’un grand cône de moxa, d’une forte puissance de feu et d’une température élevée⁴. Une revue systématique et une méta-analyse suggèrent que la moxibustion est un traitement complémentaire efficace pour la SA⁵. Une étude récente a confirmé que les symptômes cliniques et certains facteurs inflammatoires des patients atteints de SA étaient améliorés par la moxibustion⁶. Des études ont révélé que la Du-moxibustion peut augmenter le contenu cérébral en β-endorphine et exercer un effet analgésique central⁷, réguler à la baisse l’expression du gène HLA-B27 ⁸ et retarder le taux de récurrence de la SA. La du-moxibustion a également un effet d’amélioration sur la progression de la SA en diminuant l’indice inflammatoire VS (ESR) et les niveaux de protéine C-réactive (CRP), de peptide C-terminal de collagène de type I (CTX-I) et de protéine Dickkopf1 (DKK1)^9,10.

Une autre étude clinique a montré que la Du-moxibustion peut ajuster davantage les sous-ensembles désordonnés de lymphocytes T, Ig, et compléter C3 pour équilibrer le mécanisme immunitaire¹¹. En termes de métabolisme osseux, la moxibustion peut inhiber l’augmentation de la phosphatase alcaline sérique (ALP) et du phosphore sérique (S-P), augmenter le calcium sérique (S-Ca), la densité minérale osseuse (DMO) et la solidité osseuse¹². De plus, la Du-moxibustion peut réparer la fonction de la colonne vertébrale en plusieurs points pour soulager les symptômes de fatigue chez les patients atteints de SA¹³. Certaines études animales ont révélé le mécanisme potentiel de la moxibustion dans le traitement de la SA. Une étude a indiqué que la moxibustion améliorait considérablement l’état de santé général, réduisait les niveaux d’épaisseur des pattes et diminuait les niveaux d’IL-1β, de PGE2, d’IL-6 et de TNF-α dans les échantillons de tissu ligamentaire de la colonne vertébrale. L’analyse des voies métaboliques a permis d’établir un lien entre les métabolites identifiés et le cycle du TCA, ainsi que le métabolisme des lipides, des acides aminés, de la flore intestinale et des purines¹⁴. Une autre étude a montré que la moxibustion supprimait l’expression des cytokines pro-inflammatoires, l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-17 et l’IL-6 ; réduit les niveaux d’ARNm de RANKL, RANK, ALP et OCN ; et amélioré les caractéristiques histopathologiques chez les souris AS¹⁵.

Bien que ces études suggèrent que la moxibustion peut être efficace dans le traitement de la SA, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour confirmer ces résultats et déterminer le protocole de traitement optimal pour la moxibustion chez les patients atteints de SA. Notre équipe a créé et modifié la thérapie de moxibustion basée sur la théorie de base et le fonctionnement pratique de la moxibustion traditionnelle chinoise, qui a été largement réalisée et appliquée dans la pratique clinique chinoise depuis plus de 35 ans. Bien qu’il existe peu d’études de haute qualité sur le traitement de la SA par la Du-moxibustion, son indication dans le traitement de la SA a été étayée par des preuves. Cependant, le mécanisme de traitement de la SA avec la Du-moxibustion mérite une étude plus approfondie. L’étude animale est une méthode importante pour explorer le mécanisme de la Du-moxibustion dans le traitement de la SA. L’opération clinique de la Du-moxibustion est relativement mature mais rarement utilisée dans l’étude du mécanisme en expérimentation animale. Cet article décrit en détail le fonctionnement et les précautions à prendre lors de la Du-moxibustion dans le traitement des souris expérimentales SA.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’examen de l’éthique du bien-être animal expérimental de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Shandong (No. SDUTCM20230831301).

1. Préparation des animaux

1. Déterminez à l’avance les groupes expérimentaux et le nombre d’animaux par groupe.
2. Choisissez des souris BALb/c mâles, abritez-les à une température constante de 22 ± 1 °C, à une humidité constante de 60 ± 5 % et à un environnement lumineux à cycle diurne de 12 h.

2. Mise en place du modèle de souris AS

NOTE : Le modèle AS a été induit avec du protéoglycane cartilagineux (PG), qui est une méthode de modélisation classique 16,17,18,19,20,21. Des souris de souche BALB/c ont été immunisées à plusieurs reprises avec du PG pour induire une tendinite et une spondylarthrite. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux, les réactifs et les instruments utilisés dans ce protocole.

1. À l’aide d’une pipette de 200 μL, aspirer 200 μL de PG et de CFA (ou IFA) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Agiter doucement pour mélanger le liquide dans le tube de la centrifugeuse.
2. Placez le tube de centrifugation dans le broyeur de tissus pour l’homogénéisation, puis incubez sur de la glace pendant 4 min. Répétez 5 fois. Réglez les paramètres suivants dans la meuleuse de tissus : 60 Hz, broyage 30 s, intervalle de 10 s pour un total de 6 cycles.
3. Extraire 0,2 mL de protéine PG émulsionnée du tube à centrifuger à l’aide d’une seringue de 1 mL.
4. Saisissez et fixez la souris avec la main gauche. Posez la souris en décubitus dorsal, en gardant la tête plus basse que la queue pour éviter d’endommager les organes abdominaux lors de l’insertion de la seringue.
5. Stérilisez l’abdomen avec des tampons imbibés d’alcool à l’aide de la main droite.
6. Avec la seringue dans la main droite, insérez légèrement l’aiguille par voie sous-cutanée à gauche ou à droite de la linea alba ventralis dans la moitié inférieure de l’abdomen.
7. Poussez l’aiguille de 3 à 5 mm par voie sous-cutanée parallèlement à la ligne médio-abdominale, puis enfoncez l’aiguille dans la cavité abdominale à un angle de 45° par rapport à la peau.
8. Pénétrez dans le péritoine, retirez le bouchon de l’aiguille et injectez lentement la protéine PG émulsionnée.

3. Du-moxibustion

REMARQUE : Préparez à l’avance les trois matières premières les plus importantes pour la Du-moxibustion (Figure 1).

1. Préparez les cornets de moxa. Prenez le velours dans la main, avec deux paumes tournées dans des directions opposées exerçant une force de torsion pour frotter le velours en forme de fuseau (Figure 2)
2. Coupez le gingembre en petits morceaux et réduisez-le en purée dans un presse-agrumes (Figure 3). Filtrez la purée de gingembre à travers de la gaze de coton. Séparez le jus de gingembre et la boue de gingembre de la purée de gingembre pour vous préparer à l’étape suivante.
3. Préparez 10 g de boue de gingembre et 20 ml de jus de gingembre et placez-les dans des gobelets en carton pour une utilisation ultérieure.
4. Pesez 0,1 g de poudre de MTC (un mélange de poudre de cannelle, de poudre de clou de girofle, de poudre de notoptérygion, de poudre d’antharidine et de musc artificiel)²² et broyez-la dans un mortier.
5. Placez les souris dans la boîte d’induction d’anesthésie de l’appareil d’anesthésie animale et anesthésiez-les avec un mélange de 2 à 3 % d’isoflurane et d’oxygène à un débit de 2 L/min.
6. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en observant l’absence d’un réflexe de sursaut dans un premier temps et vérifiez le niveau d’anesthésie chirurgicale en vérifiant l’absence d’un réflexe de la pédale en réponse à un léger pincement des orteils.
7. Une fois que la souris a atteint l’anesthésie du plan chirurgical, sortez-la de la boîte et fixez-la sur la table d’opération en position couchée. Alignez la bouche et le nez de la souris avec la sortie de l’anesthésique.
8. Administrer l’anesthésie à l’aide d’un masque fixé à l’appareil d’anesthésie, à travers lequel l’isoflurane et l’oxygène sont délivrés via un circuit sans réinspiration. Maintenez l’anesthésie et maintenez la souris sur un coussin chauffant à 37 °C pendant toute la durée de l’opération. Appliquez du lubrifiant sur les yeux pour éviter la dessiccation.
9. Localisez les points d’acupuncture et identifiez la zone de stimulation (Figure 4).
10. Rasez les poils sur le dos de la souris jusqu’à ce que la peau de couleur chair sur le dos de la souris soit visible. Assurez-vous que la largeur de l’épilation est de ~1,5 cm et que la longueur va de la septième vertèbre cervicale à la vertèbre caudale (Figure 5A).
11. Appliquez le jus de gingembre préparé à l’aide d’une gaze de coton sur la zone rasée (Figure 3).
12. Saupoudrez uniformément la poudre de MTC à l’aide d’un pinceau d’écriture sur la ligne médiane du dos de la souris et recouvrez-la de papier mûrier (Figure 5B-D).
13. Faites une colonne de gingembre trapézoïdale de 6 cm de long, 1,5 cm de large et 3 mm d’épaisseur avec de la boue de gingembre. Fixez la colonne de gingembre sur le papier de mûrier (Figure 5E).
14. Faites une rainure au-dessus de la ligne médiane de la colonne de gingembre (Figure 3) et placez le cône de moxa sur la colonne de gingembre.
15. Allumez le cône de moxa, en plaçant un nouveau cône de moxa après que le précédent ait brûlé. Vérifiez la fermeté de la colonne de gingembre pour éviter de brûler la souris, brûlant un total de trois cônes (Figure 5F).
16. Après avoir brûlé les cônes de moxa, essuyez le gingembre et la poudre de MTC et nettoyez l’arrière de la souris. Arrêtez l’anesthésie à ce stade.
17. Permettez à la souris de reprendre conscience dans une nouvelle cage avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Placez la cage sur un coussin chauffant pour faciliter le processus de récupération. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne suffisamment conscience.
18. Une fois que la souris a complètement récupéré, confirmez la présence du réflexe de redressement avant de la remettre dans son logement habituel.
    REMARQUE : Pendant l’opération, il est nécessaire de surveiller l’état mental des souris pour éviter une respiration faible. Évitez les brûlures, mais gardez les souris au chaud et évitez les ecchymoses aux griffes et à la queue.

4. Évaluation de l’indice d’arthrite (IA)

1. Évaluez le score de l’IA trois fois : avant la modélisation, après la modélisation et après le traitement. Les normes d’évaluation sont les suivantes : 0, pas de rougeur ou d’enflure ; 1, légère rougeur ou gonflement de quelques orteils ; 2, rougeur et gonflement dans la plupart des articulations des orteils et des orteils ; 3, rougeur grave et gonflement des pieds et de l’articulation inférieure de la cheville ; et 4, rougeur et gonflement des pieds et de l’articulation de la cheville²³.
2. Calculez les scores d’IA des quatre pattes, avec une valeur maximale de 16.

5. Test de Rotarod

REMARQUE : Le test rotarod est utilisé pour évaluer la coordination motrice et l’équilibre en enregistrant le temps que les souris passent sur le tambour rotatif. Cette expérience consistait en trois essais séparés par des intervalles de 20 minutes. Les données officielles des tests ont été enregistrées lors du troisième essai, les deux premiers servant d’exercices d’entraînement.

1. Placez les souris sur des tambours rotatifs qui tournent sous l’effet d’une accélération continue de 4 à 40 tr/min pendant 300 s²⁴.
2. Mesurez le temps de latence (le temps jusqu’à ce que la souris tombe de la tige). Prévoyez un rembourrage pour éviter les blessures lorsqu’il tombe.

6. Test en champ ouvert (OFT)

REMARQUE : L’OFT est utilisé pour évaluer l’état du mouvement autonome, dans le but d’identifier le comportement pathologique. Quatre arènes carrées en plein champ (50 cm x 50 cm x 40 cm) ont été placées ensemble pour former l’agrès. Le fond de la boîte était divisé en neuf carrés égaux.

1. Contrôlez le bruit de fond du laboratoire en dessous de 65 dB.
2. Essuyez l’ensemble de l’appareil avec de l’éthanol à 75 % avant chaque essai.
3. Placez toutes les souris dans la salle de test 1 h avant le test pour leur permettre de s’adapter à leur environnement.
4. Placez les souris dans les arènes carrées en plein champ et laissez-les explorer pendant 10 minutes.
5. Enregistrez la distance totale et la vitesse de déplacement pendant 10 min.

7. Euthanasie et prélèvement d’échantillons

1. Placez la souris dans la boîte d’induction d’anesthésie et anesthésiez-la avec un mélange de 2 à 3 % d’isoflurane et d’oxygène à un débit de 2 L/min. Une fois que la souris entre dans un état d’anesthésie profonde confirmé par un manque de réflexe de la pédale, transférez-la sur la table d’opération pour une anesthésie d’entretien.
2. Saisissez et fixez la souris avec la main non dominante.
3. Appuyez légèrement sur le contour des yeux pour que les globes oculaires soient congestionnés et saillants.
4. Utilisez des ciseaux pour couper les moustaches de la souris afin d’éviter l’hémolyse causée par les poils.
5. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant l’absence d’un réflexe de pédale en réponse à un pincement des orteils. Utilisez une pince pour saisir le globe oculaire et le retirer rapidement, permettant au sang de s’écouler dans un tube de microcentrifugation à partir de l’orbite.
   REMARQUE : D’autres méthodes de prélèvement sanguin, telles que la ponction cardiaque, peuvent également être utilisées.
6. Lorsque le taux d’écoulement du sang ralentit, appuyez doucement sur la zone cardiaque de la souris pour accélérer le pompage du sang et obtenir plus de sang. Ensuite, euthanasiez la souris à l’aide d’une luxation cervicale.
7. Tenez la jambe juste au-dessus de l’articulation de la cheville à l’aide d’une pince dans la main non dominante. Ensuite, coupez la jambe juste au-dessus de l’articulation de la cheville à l’aide de ciseaux.

8. Analyse histologique

1. Immergez les échantillons de cheville dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant plus de 24 h. Détartrer dans 10% EDTA (pH = 7,4) pendant 1 mois.
2. Faire tremper les échantillons dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h.
3. Ensuite, faites tremper les échantillons dans un gradient de concentrations croissantes d’éthanol (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 %). Faire tremper chaque concentration d’éthanol pendant 1 h.
4. Faire tremper les échantillons dans du xylène pendant 3 h.
5. Immergez les spécimens de cheville dans de la paraffine pendant 7 h. Réserver les blocs de paraffine au réfrigérateur à 4 °C.
6. Coupez les blocs de paraffine à une épaisseur de 6 μm à l’aide d’une sectionneuse de paraffine semi-automatique.
7. Faites tremper les tranches pendant 4 x 5 min dans du xylène pour terminer le déparaffinage.
8. Faites tremper les tranches dans un gradient de concentrations d’éthanol décroissantes (100 %, 100 %, 95 %, 75 %) pendant 2 min chacune. Faire tremper dans de l’eau distillée pendant 2 min.
9. Colorer les tranches avec de l’hématoxyline pendant 10 min et rincer à l’eau distillée pendant 5 s.
10. Faites tremper les tranches pendant 30 s dans le liquide de différenciation et rincez à l’eau distillée pendant 5 s.
11. Colorez les tranches avec de l’éosine pendant 1 min et rincez à l’eau distillée pendant 3 min.
12. Faites tremper les tranches dans un gradient de concentrations croissantes d’éthanol (80 %, 95 %, 100 %, 100 %) pendant 1 min chacune. Faire tremper dans le xylène pendant 3 x 3 min et sceller les^{tranches 25}.

9. Test immuno-enzymatique (ELISA)

1. Mesurez les concentrations d’IL-17 et de TNF-α dans le plasma à l’aide des kits respectifs conformément aux instructions du fabricant.

10. Analyse statistique

1. Exprimez les données sous forme de moyenne ± d’erreur type de la moyenne (SEM).
2. Déterminer la signification par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) ou une ANOVA à mesures répétées à deux facteurs, suivie des tests post hoc de Bonferroni ou Tamhane T2.
3. Considérez que P < 0,05 sont statistiquement significatifs.

Résultats

Les souris modèles induites par le PG ont développé des symptômes d’arthrite périphérique, caractérisés par une rougeur et un gonflement des extrémités et des orteils, et ont progressivement développé une arthrite axiale dès la semaine 14, qui est très similaire à la manifestation de la SA. Par conséquent, le modèle murin AS était considéré comme réussi si l’indice d’arthrite (IA) était supérieur à 3 points à 14 semaines après la dernière injection²². Lorsque les p...

Discussion

La SA se manifeste cliniquement par un gonflement du dos, des lombaires et des articulations, et une déformation de la colonne vertébrale et une rigidité articulaire peuvent survenir dans les cas graves²⁶. Un diagnostic et un traitement précoces peuvent améliorer la qualité de vie, réduire les taux d’invalidité et améliorer le pronostic des patients atteints de SA. Selon la médecine traditionnelle chinoise (MTC), on pense que la sida ankylosante est causée par une carence en Yang dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% EDTA	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol pads	HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machine	Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubes	Axygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)	aladdin,Shanghai, China	F393378
cotton ball	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauze	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting board	self-preparation
decorin from bovine articular cartilage	Sigma-Aldrich, MO, USA	D8428
depilatory cream	Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scale	Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tube	Axygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricant	Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
ginger	self-preparation
GraphPad Prism 7 software	GraphPad Software,Boston, USA
hair clipper	Super human Group CO LTD, Jinhua, China
heating pads	Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	aladdin,Shanghai, China	F393371
injection syringe	Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isoflurane	Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China	R510-22-10
joss stick	Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicer	Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knife	self-preparation
lighter	Zhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortar	Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kit	absin, Shanghai, China	abs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	Wuhan Sanying, Wuhan, China	KE10002
mulberry paper	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFT	Xinruan,Shanghai, China	XR-XZ301
paper cup	self-preparation
pipettes	OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvet	self-preparation
rotarod	Xinruan,Shanghai, China	XR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissors	Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machine	Leica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 software	International Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powder	self-preparation
tips	Biosharp, Labgic, Beijing, China
writing brush	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China