Du-Moxibustión en un modelo de ratón de espondilitis anquilosante

Resumen

En este trabajo se describen en detalle los procedimientos de operación y las precauciones que deben tomarse durante la Du-moxibustión en el tratamiento de la espondilitis anquilosante en ratones experimentales.

Resumen

La espondilitis anquilosante (EA) es una forma de artritis que empeora progresivamente y es incapacitante y afecta principalmente al esqueleto axial. Esta enfermedad afecta principalmente a la columna vertebral y a la articulación sacroilíaca. La fusión de la columna vertebral y la articulación sacroilíaca puede ocurrir en la etapa posterior de la enfermedad, lo que resulta en rigidez y cifosis de la columna, así como dificultad para caminar, lo que afecta gravemente la calidad del trabajo y las actividades de la vida diaria e impone una pesada carga al paciente, la familia y la sociedad. Se ha prestado cada vez más atención a la no farmacoterapia como terapia alternativa para la EA. La moxibustión es una técnica terapéutica milenaria utilizada en la Medicina Tradicional China (MTC). La terapia de du-moxibustión, un tratamiento externo único e innovador desarrollado sobre la base de la moxibustión ordinaria, tiene un efecto terapéutico definitivo sobre la EA. La du-moxibustión combina hábilmente las técnicas compatibles de la medicina tradicional china para integrar los meridianos, los puntos de acupuntura, la medicina herbal china y la moxibustión. En este trabajo se describen en detalle los procedimientos de operación y las precauciones que se deben tomar durante la Du-moxibustión en ratones experimentales para proporcionar una base experimental para el estudio del mecanismo de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA.

Introducción

La espondilitis anquilosante (EA) es una forma de artritis que empeora progresivamente y es incapacitante y afecta principalmente al esqueleto axial. Según la última encuesta epidemiológica, ~0,01%-1,8% de las personas en el mundo padecen esta afección¹, la mayoría de los cuales son hombres jóvenes (la proporción hombre-mujer es de ~2-3:1)². La incidencia de EA en la población china es del 0,2% al 0,4%. Esta enfermedad afecta principalmente a la columna vertebral y a la articulación sacroilíaca. La fusión de la columna vertebral y la articulación sacroilíaca puede ocurrir en las últimas etapas de la enfermedad, lo que resulta en rigidez y cifosis de la columna, así como dificultad para caminar, lo que afecta seriamente la calidad del trabajo y las actividades de la vida diaria e impone una pesada carga para el paciente, la familia y la sociedad¹. En la actualidad, no existe una solución definitiva para la EA, y los tratamientos proporcionados, tanto farmacológicos como no farmacológicos, se centran principalmente en aliviar el dolor, ralentizar la progresión de la enfermedad y mejorar la calidad de vida. En los últimos años, debido a que las opciones farmacoterapéuticas han sido muy limitadas³, se ha prestado cada vez más atención a la no farmacoterapia, que se ha convertido en una terapia alternativa para la EA. En China, los pacientes suelen preferir un tratamiento externo que consiste en la Medicina Tradicional China (MTC), que tiene efectos secundarios menores y una gran comodidad durante el tratamiento.

La moxibustión es una técnica terapéutica antigua utilizada en la medicina tradicional china. La du-moxibustión es una técnica de tratamiento externo que consiste en "moxibustión medicada con espuma" en el segmento de la columna vertebral del meridiano de Du. Se utiliza principalmente en el tratamiento de la EA y ha demostrado su seguridad y eficacia. En comparación con la moxibustión ordinaria, la Du-moxibustión tiene las características de una amplia área de moxibustión, un gran cono de moxa, una gran potencia de fuego y una alta temperatura⁴. Una revisión sistemática y un metanálisis sugieren que la moxibustión es un tratamiento complementario eficaz para la EA⁵. Un estudio reciente confirmó que los síntomas clínicos y algunos factores inflamatorios de los pacientes con EA mejoraron con la moxibustión⁶. Los estudios han revelado que la Du-moxibustión puede aumentar el contenido cerebral de β-endorfina y ejercer un efecto analgésico central⁷, regular a la baja la expresión del gen HLA-B27 ⁸ y retrasar la tasa de recurrencia de la EA. La du-moxibustión también tiene un efecto mejorador en la progresión de la EA al disminuir el índice inflamatorio VSG (VSG) y los niveles de proteína C reactiva (PCR), péptido C-terminal de colágeno tipo I (CTX-I) y proteína Dickkopf1 (DKK1)^9,10.

Otro estudio clínico mostró que la Du-moxibustión puede ajustar aún más los subconjuntos de células T desordenadas, Ig y complemento C3 para equilibrar el mecanismo inmunológico¹¹. En términos de metabolismo óseo, la moxibustión puede inhibir el aumento de la fosfatasa alcalina sérica (ALP) y el fósforo sérico (S-P), aumentar el calcio sérico (S-Ca), la densidad mineral ósea (DMO) y la fuerza ósea¹². Además, la Du-moxibustión puede reparar la función de la columna vertebral en múltiples puntos para aliviar los síntomas de fatiga en pacientes con EA¹³. Algunos estudios en animales han revelado el mecanismo potencial de la moxibustión en el tratamiento de la EA. Un estudio indicó que la moxibustión mejoró significativamente el estado de salud general, redujo los niveles de grosor de las patas y disminuyó los niveles de IL-1β, PGE2, IL-6 y TNF-α en las muestras de tejido ligamentoso de la columna vertebral. El análisis de la vía metabólica vinculó los metabolitos identificados con el ciclo del TCA, así como con el metabolismo de lípidos, aminoácidos, flora intestinal y purinas¹⁴. Otro estudio mostró que la moxibustión suprimió la expresión de citocinas proinflamatorias, IL-1β, TNF-α, IL-17 e IL-6; redujeron los niveles de ARNm de RANKL, RANK, ALP y OCN; y mejoró las características histopatológicas en ratones AS¹⁵.

Si bien estos estudios sugieren que la moxibustión puede ser eficaz en el tratamiento de la EA, se necesita más investigación para confirmar estos hallazgos y determinar el protocolo de tratamiento óptimo para la moxibustión en pacientes con EA. Nuestro equipo creó y modificó la terapia de moxibustión basada en la teoría básica y el funcionamiento práctico de la moxibustión tradicional china, que se ha llevado a cabo y aplicado ampliamente en la práctica clínica china durante más de 35 años. Aunque hay pocos estudios de alta calidad sobre el tratamiento de la EA mediante Du-moxibustión, su indicación en el tratamiento de la EA ha sido respaldada por la evidencia. Sin embargo, el mecanismo de tratamiento de la EA con Du-moxibustión es digno de un estudio más profundo. El estudio en animales es un método importante para explorar el mecanismo de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA. El funcionamiento clínico de la Du-moxibustión está relativamente maduro, pero rara vez se utiliza en el estudio del mecanismo en experimentos con animales. En este trabajo se describe en detalle el funcionamiento y las precauciones que deben tomarse durante la Du-moxibustión en el tratamiento de ratones experimentales con EA.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Revisión de Ética del Bienestar de los Animales Experimentales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong (No. SDUTCM20230831301).

1. Preparación animal

1. Determinar de antemano los grupos experimentales y el número de animales por grupo.
2. Elija ratones machos BALb/c, alójelos a una temperatura constante de 22 ± 1 °C, humedad constante de 60 ± 5% y ambiente de luz de ciclo diurno de 12 h.

2. Establecimiento del modelo de ratón AS

NOTA: El modelo de EA fue inducido con proteoglicano de cartílago (PG), que es un método clásico de modelado 16,17,18,19,20,21. Los ratones de la cepa BALB/c fueron inmunizados repetidamente con PG para inducir tendinitis y espondilitis. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Utilice una pipeta de 200 μl para extraer 200 μl de PG y CFA (o IFA) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agitar suavemente para mezclar el líquido en el tubo de la centrífuga.
2. Coloque el tubo de centrífuga en la trituradora de pañuelos para homogeneizar y luego incube en hielo durante 4 min. Repita 5 veces. Ajuste los siguientes parámetros en la amoladora de tejidos: 60 Hz, molienda 30 s, intervalo 10 s para un total de 6 ciclos.
3. Extraiga 0,2 mL de proteína PG emulsionada del tubo de centrífuga con una jeringa de 1 mL.
4. Agarra y fija el ratón con la mano izquierda. Coloque al ratón en posición supina, manteniendo la cabeza más baja que la cola para evitar daños en los órganos abdominales cuando se inserte la jeringa.
5. Esterilizar el abdomen con hisopos con alcohol con la mano derecha.
6. Con la jeringa en la mano derecha, inserte la aguja por vía subcutánea ligeramente a la izquierda o derecha de la línea alba ventralis en la mitad inferior del abdomen.
7. Empuje la aguja 3-5 mm subcutáneamente paralela a la línea abdominal media y luego empuje la aguja dentro de la cavidad abdominal en un ángulo de 45° con respecto a la piel.
8. Penetrar en el peritoneo, retirar el tapón de la aguja e inyectar lentamente la proteína PG emulsionada.

3. Du-moxibustión

NOTA: Prepare con anticipación las tres materias primas más importantes para la Du-moxibustión (Figura 1).

1. Prepara los conos de moxa. Tome el terciopelo en la mano, con dos palmas mirando en direcciones opuestas ejerciendo una fuerza de torsión para frotar el terciopelo en forma de huso (Figura 2)
2. Corta el jengibre en trozos pequeños y hazlo puré en un exprimidor (Figura 3). Filtra el puré de jengibre a través de una gasa de algodón. Separe el jugo de jengibre y el barro de jengibre del puré de jengibre para prepararse para el siguiente paso.
3. Prepara 10 g de barro de jengibre y 20 ml de jugo de jengibre y colócalos en vasos de papel para su uso posterior.
4. Pesar 0,1 g de polvo de MTC (una mezcla de canela en polvo, clavo en polvo, notopterigión en polvo, polvo de antharidina y almizcle artificial)²² y molerlo en un mortero.
5. Colocar los ratones en la caja de inducción de anestesia de la máquina de anestesia animal y anestesiarlos con una mezcla de isoflurano al 2-3% y oxígeno a un caudal de 2 L/min.
6. Evalúe la profundidad de la anestesia observando la ausencia de un reflejo de sobresalto inicialmente y verifique el nivel de anestesia quirúrgica verificando la ausencia de un reflejo pedal en respuesta a un pellizco suave del dedo del pie.
7. Una vez que el ratón haya alcanzado la anestesia quirúrgica, sáquelo de la caja y fíjelo en la mesa de operaciones en posición prona. Alinee la boca y la nariz del ratón con la salida del anestésico.
8. Administrar la anestesia a través de una máscara conectada a la máquina anestésica, a través de la cual se administra isoflurano y oxígeno a través de un circuito sin reinhalación. Mantenga la anestesia y mantenga el mouse sobre una almohadilla térmica a 37 °C durante todo el procedimiento operativo. Aplique lubricante en los ojos para evitar la desecación.
9. Localice los puntos de acupuntura e identifique el área de estimulación (Figura 4).
10. Afeita el pelo de la parte posterior del ratón hasta que se vea la piel de color carne en la parte posterior del ratón. Asegúrese de que el ancho de la depilación sea de ~ 1,5 cm y que la longitud sea desde la séptima vértebra cervical hasta la vértebra de la cola (Figura 5A).
11. Aplique el jugo de jengibre preparado con una gasa de algodón en el área afeitada (Figura 3).
12. Espolvoree el polvo de MTC uniformemente con un pincel de escritura en la línea media de la parte posterior del ratón y cúbralo con papel de morera (Figura 5B-D).
13. Haz una columna trapezoidal de jengibre de 6 cm de largo, 1,5 cm de ancho y 3 mm de grosor con barro de jengibre. Fije la columna de jengibre en el papel de morera (Figura 5E).
14. Haz una ranura por encima de la línea media de la columna de jengibre (Figura 3) y coloca el cono de moxa en la columna de jengibre.
15. Enciende el cono de moxa, colocando un nuevo cono de moxa después de que el anterior se queme. Verifique la firmeza de la columna de jengibre para evitar quemar el ratón, quemando un total de tres conos (Figura 5F).
16. Después de quemar los conos de moxa, limpie el jengibre y el polvo de MTC y limpie la parte posterior del ratón. Suspenda la anestesia en este punto.
17. Permita que el ratón recupere la conciencia en una nueva jaula con acceso sin restricciones a comida y agua. Coloque la jaula sobre una almohadilla térmica para ayudar en el proceso de recuperación. Vigile al animal hasta que recupere la conciencia suficiente.
18. Una vez que el ratón se haya recuperado por completo, confirme la presencia del reflejo de enderezamiento antes de devolverlo a su alojamiento habitual.
    NOTA: Durante la operación, es necesario monitorear el estado mental de los ratones para evitar una respiración débil. Evite las quemaduras, pero mantenga a los ratones calientes y evite magulladuras en las garras y la cola.

4. Evaluación del índice de artritis (IA)

1. Evalúe la puntuación de la IA tres veces: antes del modelado, después del modelado y después del tratamiento. Los estándares de evaluación son los siguientes: 0, sin enrojecimiento ni hinchazón; 1, ligero enrojecimiento o hinchazón en algunos dedos de los pies; 2, enrojecimiento e hinchazón en la mayoría de las articulaciones de los dedos de los pies y los dedos de los pies; 3, enrojecimiento e hinchazón graves en los pies y debajo de la articulación del tobillo; y 4, enrojecimiento e hinchazón en la articulación de los pies y el tobillo²³.
2. Calcula las puntuaciones de IA de las cuatro patas, con un valor máximo de 16.

5. Prueba de Rotarod

NOTA: La prueba de rotarod se utiliza para evaluar la coordinación motora y el equilibrio mediante el registro del tiempo que los ratones pasan en el tambor giratorio. Este experimento consistió en tres ensayos separados por intervalos de 20 minutos. Los datos oficiales de las pruebas se registraron en el tercer ensayo, y los dos primeros sirvieron como ejercicios de entrenamiento.

1. Coloque los ratones en tambores giratorios que giran bajo aceleración continua de 4 a 40 rpm durante 300 s²⁴.
2. Mide el tiempo de latencia (el tiempo que transcurre hasta que el ratón se cae de la varilla). Proporcione almohadillas para evitar lesiones cuando se caiga.

6. Prueba de campo abierto (OFT)

NOTA: La OFT se utiliza para evaluar el estado de movimiento autónomo, con el objetivo de identificar el comportamiento patológico. Cuatro arenas cuadradas de campo abierto (50 cm x 50 cm x 40 cm) se colocaron juntas para formar el aparato. La parte inferior de la caja estaba dividida en nueve cuadrados iguales.

1. Controle el ruido de fondo del laboratorio por debajo de 65 dB.
2. Limpie todo el aparato con etanol al 75% antes de cada prueba.
3. Coloque a todos los ratones en la sala de pruebas 1 hora antes de la prueba para que puedan adaptarse a su entorno.
4. Pon a los ratones en las arenas cuadradas de campo abierto y déjalos explorar durante 10 minutos.
5. Registre la distancia total y la velocidad de movimiento durante 10 minutos.

7. Eutanasia y recogida de muestras

1. Colocar el ratón en la caja de inducción de anestesia y anestesiarlo con una mezcla de isoflurano al 2-3% y oxígeno a un caudal de 2 L/min. Una vez que el ratón entre en un estado de anestesia profunda confirmado por la falta de reflejo del pedal, transfiéralo a la mesa de operaciones para la anestesia de mantenimiento.
2. Agarra y fija el ratón con la mano no dominante.
3. Presione ligeramente el área de los ojos para que los globos oculares se congestionen y sobresalgan.
4. Use tijeras para recortar los bigotes del ratón para evitar la hemólisis causada por los pelos.
5. Confirme la profundidad de la anestesia verificando la ausencia de un reflejo pedal en respuesta a un pellizco en el dedo del pie. Use fórceps para agarrar el globo ocular y extraerlo rápidamente, permitiendo que la sangre fluya hacia un tubo de microcentrífuga desde la cuenca del ojo.
   NOTA: También se pueden utilizar métodos alternativos de extracción de sangre, como la punción cardíaca.
6. Cuando la velocidad de goteo de la sangre disminuya, presione suavemente el área del corazón del ratón para acelerar el bombeo de sangre y obtener más sangre. Luego, sacrifica al ratón usando la dislocación cervical.
7. Sostenga la pierna justo por encima de la articulación del tobillo con fórceps en la mano no dominante. Luego, corta la pierna justo por encima de la articulación del tobillo con unas tijeras.

8. Análisis histológico

1. Sumergir las muestras de tobillo en paraformaldehído al 4% durante más de 24 h. Descalcificar en EDTA al 10% (pH = 7,4) durante 1 mes.
2. Remojar las muestras en paraformaldehído al 4% durante 2 h.
3. Luego, sumerja las muestras en un gradiente de concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). Remojar cada concentración de etanol durante 1 h.
4. Remojar las muestras en xileno durante 3 h.
5. Sumergir las muestras de tobillo en parafina durante 7 h. Reservar bloques de parafina en un frigorífico a 4 °C.
6. Cortar bloques de parafina a un grosor de 6 μm utilizando una máquina seccionadora de parafina semiautomática.
7. Remoje las rodajas durante 4 x 5 minutos en xileno para completar la desparafinación.
8. Remoje las rodajas en un gradiente de concentraciones decrecientes de etanol (100%, 100%, 95%, 75%) durante 2 minutos cada una. Remojar en agua destilada durante 2 min.
9. Tiñir las rodajas con hematoxilina durante 10 min y enjuagar con agua destilada durante 5 s.
10. Remojar las rodajas durante 30 s en el líquido de diferenciación y enjuagar con agua destilada durante 5 s.
11. Tiñe las rodajas con eosina durante 1 minuto y enjuaga con agua destilada durante 3 minutos.
12. Remoje las rodajas en un gradiente de concentraciones crecientes de etanol (80%, 95%, 100%, 100%) durante 1 minuto cada una. Remojar en xileno durante 3 x 3 min y sellar las rodajas²⁵.

9. Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

1. Mida las concentraciones de IL-17 y TNF-α en plasma utilizando los kits respectivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

10. Análisis estadístico

1. Exprese los datos como media ± error estándar de la media (SEM).
2. Determinar la significancia a través del análisis de varianza de una vía (ANOVA) o ANOVA de medidas repetidas de dos vías, seguido de las pruebas post hoc de Bonferroni o Tamhane T2.
3. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.

Resultados

Los ratones modelo inducidos por PG desarrollaron síntomas de artritis periférica, caracterizada por enrojecimiento e hinchazón de las extremidades y los dedos de los pies, y desarrollaron gradualmente artritis axial ya en la semana 14, que es muy similar a la manifestación de la EA. Por lo tanto, el modelo de ratón AS se consideró exitoso si el índice de artritis (IA) era superior a 3 puntos a las 14 semanas después de la última inyección²². Cuando las patas de los ratones parecían hin...

Discusión

La EA se manifiesta clínicamente como dolor de espalda, lumbar e hinchazón articular, y en casos graves puede producirse deformidad de la columna vertebral y rigidez articular²⁶. El diagnóstico y el tratamiento tempranos pueden mejorar la calidad de vida, reducir las tasas de discapacidad y mejorar el pronóstico de los pacientes con EA. Según la medicina tradicional china (MTC), se cree que el síndrome de Asperger es causado por una deficiencia de Yang en el riñón y el meridiano Du, así c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% EDTA	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol pads	HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machine	Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubes	Axygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)	aladdin,Shanghai, China	F393378
cotton ball	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauze	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting board	self-preparation
decorin from bovine articular cartilage	Sigma-Aldrich, MO, USA	D8428
depilatory cream	Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scale	Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tube	Axygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricant	Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
ginger	self-preparation
GraphPad Prism 7 software	GraphPad Software,Boston, USA
hair clipper	Super human Group CO LTD, Jinhua, China
heating pads	Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	aladdin,Shanghai, China	F393371
injection syringe	Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isoflurane	Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China	R510-22-10
joss stick	Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicer	Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knife	self-preparation
lighter	Zhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortar	Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kit	absin, Shanghai, China	abs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	Wuhan Sanying, Wuhan, China	KE10002
mulberry paper	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFT	Xinruan,Shanghai, China	XR-XZ301
paper cup	self-preparation
pipettes	OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvet	self-preparation
rotarod	Xinruan,Shanghai, China	XR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissors	Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machine	Leica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 software	International Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powder	self-preparation
tips	Biosharp, Labgic, Beijing, China
writing brush	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China