Du-Moxibustion במודל עכבר של ספונדיליטיס Ankylosing

Summary

מאמר זה מתאר בפירוט את נהלי הניתוח ואמצעי הזהירות שיש לנקוט במהלך Du-moxibustion בטיפול בספונדיליטיס ankylosing בעכברי ניסוי.

Abstract

Ankylosing spondylitis (AS) היא צורה מחמירה ומשביתה בהדרגה של דלקת פרקים המשפיעה בעיקר על השלד הצירי. מחלה זו מערבת בעיקר את עמוד השדרה ואת המפרק sacroiliac. איחוי עמוד השדרה והמפרק הסקרואיליאק עלול להתרחש בשלב מאוחר יותר של המחלה, וכתוצאה מכך נוקשות בעמוד השדרה וקיפוזיס, כמו גם קושי בהליכה, המשפיע קשות על איכות העבודה ופעילויות היומיום ומטיל נטל כבד על החולה, המשפחה והחברה. תשומת לב גוברת הוקדשה ללא טיפול תרופתי כטיפול אלטרנטיבי עבור AS. מוקסיבציה היא טכניקה טיפולית עתיקה המשמשת ברפואה הסינית המסורתית (TCM). טיפול Du-moxibustion, טיפול חיצוני ייחודי וחדשני שפותח על בסיס moxibustion רגיל, יש השפעה טיפולית מובהקת על AS. Du-moxibustion משלב במיומנות את הטכניקות התואמות של TCM כדי לשלב מרידיאנים, acupoints, צמחי מרפא סיניים, ו moxibustion. מאמר זה מתאר בפירוט את נהלי הפעולה ואמצעי הזהירות שיש לנקוט במהלך Du-moxibustion בעכברי ניסוי כדי לספק בסיס ניסיוני לחקר מנגנון Du-moxibustion בטיפול ב- AS.

Introduction

Ankylosing spondylitis (AS) היא צורה מחמירה ומשביתה בהדרגה של דלקת פרקים המשפיעה בעיקר על השלד הצירי. על פי הסקר האפידמיולוגי האחרון, ~ 0.01%-1.8% מהאנשים בעולם סובלים ממצב זה¹, רובם גברים צעירים (יחס זכר לנקבה הוא ~ 2-3: 1)². שכיחות AS באוכלוסייה הסינית היא 0.2%-0.4%. מחלה זו מערבת בעיקר את עמוד השדרה ואת המפרק sacroiliac. איחוי עמוד השדרה ומפרק העצה עלול להתרחש בשלבים מאוחרים יותר של המחלה, וכתוצאה מכך נוקשות בעמוד השדרה וקיפוזיס, כמו גם קושי בהליכה, המשפיע קשות על איכות העבודה ופעילויות היומיום ומטיל נטל כבד על החולה, המשפחה והחברה¹. נכון לעכשיו, אין פתרון מוחלט עבור AS, והטיפולים הניתנים, הן תרופתיים והן לא תרופתיים, מתמקדים בעיקר בהקלה על כאב, האטת התקדמות המחלה, ושיפור איכות החיים. בשנים האחרונות, מכיוון שהאפשרויות הפרמקותרפיות היו מוגבלות מאוד³, תשומת לב גוברת הוקדשה לטיפול לא תרופתי, שהפך לטיפול אלטרנטיבי עבור AS. בסין, מטופלים מעדיפים לעתים קרובות טיפול חיצוני המורכב מרפואה סינית מסורתית (TCM), שיש לו תופעות לוואי קלות ונוחות רבה במהלך הטיפול.

מוקסיבציה היא טכניקה טיפולית עתיקה המשמשת ברפואה סינית מסורתית. Du-moxibustion היא טכניקת טיפול חיצונית המורכבת מ"מוקסיבציה תרופתית עם קצף" על קטע עמוד השדרה של מרידיאן דו. הוא משמש בעיקר לטיפול ב- AS והראה בטיחות ויעילות. בהשוואה למוקסיבציה רגילה, Du-moxibustion יש את המאפיינים של אזור moxibustion רחב, חרוט מוקסה גדול, כוח אש חזק, טמפרטורה גבוהה⁴. סקירה שיטתית ומטא-אנליזה מציעות כי מוקסיבציה היא טיפול משלים יעיל עבור AS⁵. מחקר שנערך לאחרונה אישר כי הסימפטומים הקליניים וכמה גורמים דלקתיים של חולי AS השתפרו על ידי moxibustion⁶. מחקרים גילו כי Du-moxibustion יכול להגדיל את התוכן במוח של β-אנדורפין ולהפעיל אפקט משכך כאבים מרכזי⁷, לווסת את הביטוי של הגן HLA-B27 ⁸, ולעכב את שיעור ההישנות של AS. Du-moxibustion יש גם השפעה משפרת על התקדמות AS על ידי הפחתת אינדקס דלקתי ESR (ESR) ורמות של חלבון מגיב C (CRP), פפטיד C-terminal של קולגן מסוג I (CTX-I), וחלבון Dickkopf1 (DKK1)^9,10.

מחקר קליני אחר הראה כי Du-moxibustion יכול להתאים עוד יותר את תת-קבוצות תאי T הלא מסודרות, Ig, ולהשלים C3 כדי לאזן את מנגנון החיסון¹¹. במונחים של חילוף חומרים בעצמות, מוקסיבציה יכולה לעכב את עליית פוספטאז אלקליין בסרום (ALP) וזרחן בסרום (S-P), להגדיל את רמת הסידן בסרום (S-Ca), צפיפות מינרלים בעצם (BMD) וחוזק העצם¹². יתר על כן, Du-moxibustion יכול לתקן את תפקוד עמוד השדרה במספר נקודות כדי להקל על תסמיני עייפות בחולי AS¹³. כמה מחקרים בבעלי חיים חשפו את המנגנון הפוטנציאלי של מוקסיבציה בטיפול ב- AS. מחקר הצביע על כך שמוקסיבציה שיפרה באופן משמעותי את המצב הבריאותי הכללי, הפחיתה את רמות עובי כפות הרגליים והפחיתה את רמות IL-1β, PGE2, IL-6 ו-TNF-α בדגימות רקמת הרצועה בעמוד השדרה. ניתוח מסלולים מטבוליים קישר את המטבוליטים שזוהו למחזור TCA, כמו גם שומנים, חומצות אמינו, פלורת מעיים ומטבוליזם של פורין¹⁴. מחקר אחר הראה כי מוקסיבציה דיכאה את הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת, IL-1β, TNF-α, IL-17 ו-IL-6; הפחתת רמות ה-mRNA של RANKL, RANK, ALP ו-OCN; ושיפר את התכונות ההיסטופתולוגיות בעכברי AS¹⁵.

בעוד מחקרים אלה מציעים כי moxibustion עשוי להיות יעיל בטיפול AS, מחקר נוסף נדרש כדי לאשר ממצאים אלה ולקבוע את פרוטוקול הטיפול האופטימלי עבור moxibustion בחולים עם AS. הצוות שלנו יצר ושינה את הטיפול במוקסיבציה בהתבסס על התיאוריה הבסיסית והפעולה המעשית של מוקסיבציה סינית מסורתית, אשר בוצעה באופן נרחב ויושמה בפרקטיקה הקלינית הסינית במשך למעלה מ -35 שנה. למרות שיש מעט מחקרים באיכות גבוהה על הטיפול ב- AS על ידי Du-moxibustion, האינדיקציה שלה בטיפול ב- AS נתמכה בראיות. עם זאת, מנגנון הטיפול ב- AS עם Du-moxibustion ראוי למחקר נוסף. מחקר בבעלי חיים הוא שיטה חשובה לחקור את המנגנון של Du-moxibustion בטיפול ב- AS. הפעולה הקלינית של Du-moxibustion היא בוגרת יחסית, אך משמשת לעתים רחוקות בחקר המנגנון בניסויים בבעלי חיים. מאמר זה מתאר בפירוט את הפעולות ואמצעי הזהירות שיש לנקוט במהלך Du-moxibustion בטיפול בעכברי ניסוי AS.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסויית לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת שאנדונג לרפואה סינית מסורתית (לא. SDUTCM20230831301).

1. הכנת בעלי חיים

1. לקבוע מראש את קבוצות הניסוי ואת מספר בעלי החיים בכל קבוצה.
2. בחר עכברי BALb/c זכרים, שכן אותם בטמפרטורה קבועה של 22 ± 1 °C, לחות קבועה של 60 ± 5%, וסביבת אור מחזור יומי של 12 שעות.

2. הקמת מודל עכבר AS

הערה: מודל AS הושרה עם פרוטאוגליקן סחוס (PG), שהיא שיטת מידול קלאסית 16,17,18,19,20,21. עכברים מזן BALB/c חוסנו שוב ושוב ב-PG כדי לגרום לדלקת בגידים וספונדיליטיס. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לחומרים, ריאגנטים ומכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. השתמש פיפטה 200 μL כדי למשוך 200 μL של PG ו- CFA (או IFA) לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. מנערים בעדינות כדי לערבב את הנוזל בצינור הצנטריפוגה.
2. מניחים את צינור הצנטריפוגה במטחנת הרקמה לצורך הומוגניזציה ולאחר מכן דוגרים על קרח למשך 4 דקות. חזור על הפעולה 5x. הגדר את הפרמטרים הבאים במטחנת הרקמות: 60 הרץ, טחינה 30 שניות, מרווח 10 שניות בסך הכל 6 מחזורים.
3. חלץ 0.2 מ"ל של חלבון PG מתחלב מצינור הצנטריפוגה עם מזרק 1 מ"ל.
4. תפוס ותקן את העכבר ביד שמאל. הניחו את העכבר במצב שכיבה, תוך שמירה על הראש נמוך מהזנב כדי למנוע נזק לאברי הבטן כאשר המזרק מוכנס.
5. לעקר את הבטן עם מקלוני אלכוהול באמצעות יד ימין.
6. עם מזרק ביד ימין, להכניס את המחט תת עורית מעט משמאל או מימין של linea alba ventralis במחצית התחתונה של הבטן.
7. דוחפים את המחט 3-5 מ"מ תת עורית במקביל לקו אמצע הבטן ואז דוחפים את המחט לתוך חלל הבטן בזווית של 45° לעור.
8. לחדור את הצפק, למשוך את פקק המחט, ולהזריק לאט את חלבון PG מתחלב.

3. דו-מוקסיבציה

הערה: הכינו מראש את שלושת חומרי הגלם החשובים ביותר עבור Du-moxibustion (איור 1).

1. הכינו קונוסים מוקסה. קחו את הקטיפה ביד, כששתי כפות ידיים פונות לכיוונים מנוגדים ומפעילות כוח פיתול כדי לשפשף את הקטיפה לצורת ציר (איור 2)
2. חתכו את הג'ינג'ר לחתיכות קטנות ומחסו אותו במסחטת מיצים (איור 3). מסננים את מחית הג'ינג'ר דרך גזה כותנה. הפרידו את מיץ הג'ינג'ר ובוץ הג'ינג'ר ממחית הג'ינג'ר כדי להתכונן לשלב הבא.
3. מכינים 10 גרם בוץ ג'ינג'ר ו 20 מ"ל מיץ ג'ינג'ר ומניחים אותם בכוסות נייר לשימוש מאוחר יותר.
4. שקלו 0.1 גרם אבקת TCM (תערובת של אבקת קינמון, אבקת ציפורן, אבקת נוטופטריגיום, אבקת אנתרידין ומושק מלאכותי)²² וטחנו אותה במכתש.
5. הכניסו את העכברים לקופסת השראת ההרדמה של מכונת ההרדמה והרדימו אותם בתערובת של 2-3% איזופלורן וחמצן בקצב זרימה של 2 ליטר/דקה.
6. להעריך את עומק ההרדמה על ידי התבוננות בהיעדר רפלקס בהלה בתחילה ולוודא את רמת ההרדמה הכירורגית על ידי בדיקת היעדר רפלקס דוושה בתגובה לצביטת בוהן עדינה.
7. לאחר שהעכבר הגיע להרדמה כירורגית, הוציאו אותו מהקופסה וקיבעו אותו על שולחן הניתוחים במצב נוטה. יישרו את הפה והאף של העכבר עם מוצא חומר ההרדמה.
8. יש לבצע הרדמה באמצעות מסכה המחוברת למכונת ההרדמה, דרכה מועברים איזופלורן וחמצן באמצעות מעגל חשמלי שאינו נושם. שמור על ההרדמה ושמור את העכבר על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס במהלך כל ההליך הניתוחי. החל חומר סיכה על העיניים כדי למנוע התייבשות.
9. אתרו את נקודות הדיקור וזהו את אזור הגירוי (איור 4).
10. לגלח את השיער על גב העכבר עד העור בצבע בשר על גב העכבר נראה. יש לוודא שרוחב הסרת השיער הוא ~1.5 ס"מ והאורך הוא מהחוליה הצווארית השביעית ועד חוליית הזנב (איור 5A).
11. מרחו את מיץ הג'ינג'ר המוכן עם גזה כותנה על האזור המגולח (איור 3).
12. פזרו את אבקת ה-TCM באופן שווה בעזרת מברשת כתיבה על הקו החציוני של גב העכבר וכסו אותה בנייר תות (איור 5B-D).
13. הכינו עמוד ג'ינג'ר טרפזי באורך 6 ס"מ, רוחב 1.5 ס"מ ועובי 3 מ"מ עם בוץ ג'ינג'ר. תקנו את עמוד הג'ינג'ר על נייר התות (איור 5E).
14. צרו חריץ מעל קו האמצע של עמוד הג'ינג'ר (איור 3), והניחו את חרוט המוקסה על עמוד הג'ינג'ר.
15. הדליקו את חרוט המוקסה והניחו חרוט מוקסה חדש לאחר שהקודם נשרף. בדקו את מוצקות עמוד הג'ינג'ר כדי למנוע צריבה של העכבר, ובסך הכל צריבה של שלושה מדוכים (איור 5F).
16. לאחר שריפת קונוסים מוקסה, לנגב את זנגביל ואת אבקת TCM, ולנקות את החלק האחורי של העכבר. יש להפסיק את ההרדמה בשלב זה.
17. אפשרו לעכבר לחזור להכרה בכלוב חדש עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים. הניחו את הכלוב על פד מחומם כדי לסייע בתהליך ההחלמה. עקוב אחר בעל החיים עד שהוא חוזר להכרה מספקת.
18. לאחר שהעכבר התאושש לחלוטין, אשר את נוכחותו של רפלקס הימין לפני החזרתו לדיור הרגיל שלו.
    הערה: במהלך הניתוח, יש צורך לפקח על המצב הנפשי של העכברים כדי למנוע נשימה חלשה. הימנעו מקשקשים, אך שמרו על חום העכברים, והימנעו מחבלות בטפרים ובזנב.

4. הערכת מדד דלקת פרקים (AI)

1. הערך את ציון הבינה המלאכותית שלוש פעמים: לפני הדוגמנות, לאחר המידול ואחרי הטיפול. תקני ההערכה הם כדלקמן: 0, ללא אדמומיות או נפיחות; 1, אדמומיות קלה או נפיחות בכמה אצבעות; 2, אדמומיות ונפיחות ברוב מפרקי הבוהן והבהונות; 3, אדמומיות חמורה ונפיחות בכפות הרגליים ומתחת למפרק הקרסול; ו-4, אדמומיות ונפיחות בכפות הרגליים ובמפרק הקרסול²³.
2. חשב את ציוני הבינה המלאכותית של כל ארבע הכפות, עם ערך מרבי של 16.

5. מבחן רוטרוד

הערה: מבחן הרוטרוד משמש להערכת קואורדינציה מוטורית ושיווי משקל על ידי רישום הזמן שהעכברים מבלים על התוף המסתובב. ניסוי זה כלל שלושה ניסויים המופרדים במרווחים של 20 דקות. נתוני המבחן הרשמיים נרשמו מהניסוי השלישי, כאשר שני הראשונים שימשו כתרגילי אימון.

1. הניחו את העכברים על תופים מסתובבים שמסתובבים בתאוצה רציפה מ-4 עד 40 סל"ד מעל 300 שניות²⁴.
2. מדוד את זמן ההשהיה (הזמן עד שהעכבר נופל מהמוט). ספק ריפוד כדי למנוע פציעה כאשר הוא נופל.

6. בדיקת שדה פתוח (OFT)

הערה: OFT משמש להערכת מצב התנועה האוטונומית, במטרה לזהות התנהגות פתולוגית. ארבע זירות שדה פתוחות מרובעות (50 ס"מ x 50 ס"מ x 40 ס"מ) הוצבו יחד כדי ליצור את המנגנון. תחתית הקופסה חולקה לתשעה ריבועים שווים.

1. שלוט ברעשי הרקע של המעבדה מתחת ל -65 dB.
2. נגבו את כל המכשיר עם 75% אתנול לפני כל ניסוי.
3. הכניסו את כל העכברים לחדר הבדיקה שעה לפני הבדיקה כדי לאפשר להם להסתגל לסביבתם.
4. שימו את העכברים בזירות השדה הפתוחות המרובעות ואפשרו להם לחקור במשך 10 דקות.
5. הקלט את המרחק הכולל ואת מהירות התנועה במשך 10 דקות.

7. המתת חסד ואיסוף דגימות

1. הכניסו את העכבר לקופסת השראת ההרדמה והרדימו אותו בתערובת של 2-3% איזופלורן וחמצן בקצב זרימה של 2 ליטר/דקה. ברגע שהעכבר נכנס למצב של הרדמה עמוקה שאושרה על ידי חוסר רפלקס דוושה, העבר אותו לשולחן הניתוחים להרדמה תחזוקתית.
2. תפוס ותקן את העכבר ביד הלא דומיננטית.
3. לחץ קלות על אזור העיניים כדי להפוך את גלגלי העיניים צפופים ובולטים.
4. השתמש מספריים כדי לקצץ את השפם של העכבר כדי למנוע המוליזה הנגרמת על ידי שערות.
5. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת היעדר רפלקס דוושה בתגובה לצביטת בוהן. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את גלגל העין ולהסיר אותו במהירות, המאפשר לדם לזרום לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מארובות העין.
   הערה: ניתן להשתמש גם בשיטות איסוף דם חלופיות, כגון ניקוב לב.
6. כאשר קצב טפטוף הדם מאט, לחץ בעדינות על אזור הלב של העכבר כדי להאיץ את שאיבת הדם ולקבל יותר דם. לאחר מכן, להרדים את העכבר באמצעות נקע צוואר הרחם.
7. החזיקו את הרגל ממש מעל מפרק הקרסול באמצעות מלקחיים ביד הלא דומיננטית. לאחר מכן, חתכו את הרגל ממש מעל מפרק הקרסול באמצעות מספריים.

8. ניתוח היסטולוגי

1. יש לטבול את דגימות הקרסול ב-4% פרפורמלדהיד במשך יותר מ-24 שעות. בטל את ההסתיידות ב- 10% EDTA (pH = 7.4) למשך חודש אחד.
2. השרו את הדגימות ב-4% פרפורמלדהיד למשך שעתיים.
3. לאחר מכן, השרו את הדגימות בשיפוע של עלייה בריכוזי אתנול (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). השרו כל ריכוז אתנול למשך שעה אחת.
4. משרים את הדגימות בקסילן למשך 3 שעות.
5. לטבול את דגימות הקרסול בפרפין במשך 7 שעות. מניחים בצד קוביות פרפין במקרר 4°C.
6. פורסים קוביות פרפין לעובי של 6 מיקרומטר באמצעות מכונת חתך פרפין חצי אוטומטית.
7. משרים את הפרוסות במשך 4X5 דקות בקסילן להשלמת השעווה.
8. משרים את הפרוסות בשיפוע של ירידה בריכוז האתנול (100%, 100%, 95%, 75%) למשך 2 דקות כל אחת. משרים במים מזוקקים למשך 2 דקות.
9. מכתימים את הפרוסות בהמטוקסילין למשך 10 דקות ושוטפים במים מזוקקים במשך 5 שניות.
10. משרים את הפרוסות במשך 30 שניות בנוזל ההבחנה ושוטפים במים מזוקקים במשך 5 שניות.
11. מכתימים את הפרוסות באאוזין למשך דקה אחת ושוטפים במים מזוקקים במשך 3 דקות.
12. משרים את הפרוסות בשיפוע של עלייה בריכוזי אתנול (80%, 95%, 100%, 100%) למשך דקה אחת כל אחת. משרים קסילן למשך 3X3 דקות ואוטמים את הפרוסות²⁵.

9. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA)

1. למדוד את ריכוזי IL-17 ו- TNF-α בפלזמה באמצעות הערכות המתאימות בהתאם להוראות היצרן.

10. ניתוח סטטיסטי

1. בטא את הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
2. קבע את המשמעות באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) או מדדים חוזרים דו-כיווניים ANOVA, ואחריו מבחני פוסט-הוק של Bonferroni או Tamhane T2.
3. שקול P < 0.05 להיות מובהק סטטיסטית.

תוצאות

עכברי מודל הנגרמים על ידי PG פיתחו תסמינים של דלקת מפרקים היקפית, המאופיינת באדמומיות ונפיחות של הגפיים והבהונות, ופיתחו בהדרגה דלקת מפרקים צירית כבר בשבוע 14, הדומה מאוד לביטוי של AS. לכן, מודל העכבר AS נחשב מוצלח אם מדד דלקת פרקים (AI) היה מעל 3 נקודות ב 14 שבועות לאחר הזריקה האחרונה²²

Discussion

AS מתבטא קלינית בכאבי נפיחות בגב, במותניים ובמפרקים, ועיוות בעמוד השדרה ונוקשות המפרקים עלולים להתרחש במקרים חמורים²⁶. אבחון וטיפול מוקדם יכולים לשפר את איכות החיים, להפחית את שיעורי הנכות ולשפר את הפרוגנוזות של חולים עם AS. על פי הרפואה הסינית המסורתית (TCM), AS הוא האמין להיגרם על ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% EDTA	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol pads	HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machine	Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubes	Axygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)	aladdin,Shanghai, China	F393378
cotton ball	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauze	Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting board	self-preparation
decorin from bovine articular cartilage	Sigma-Aldrich, MO, USA	D8428
depilatory cream	Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scale	Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tube	Axygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricant	Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
ginger	self-preparation
GraphPad Prism 7 software	GraphPad Software,Boston, USA
hair clipper	Super human Group CO LTD, Jinhua, China
heating pads	Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	aladdin,Shanghai, China	F393371
injection syringe	Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isoflurane	Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China	R510-22-10
joss stick	Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicer	Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knife	self-preparation
lighter	Zhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortar	Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kit	absin, Shanghai, China	abs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	Wuhan Sanying, Wuhan, China	KE10002
mulberry paper	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFT	Xinruan,Shanghai, China	XR-XZ301
paper cup	self-preparation
pipettes	OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvet	self-preparation
rotarod	Xinruan,Shanghai, China	XR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder	Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissors	Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machine	Leica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 software	International Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powder	self-preparation
tips	Biosharp, Labgic, Beijing, China
writing brush	Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China