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要約

この論文では、実験マウスの強直性脊椎炎の治療におけるDu-hoxisulation中に取るべき手術手順と注意事項について詳しく説明します。

要約

強直性脊椎炎(AS)は、主に軸骨格に影響を与える関節炎の漸進的に悪化し、障害となる形態です。この病気は主に脊椎と仙腸関節に関係しています。病気の後期には脊椎と仙腸関節の癒合が起こり、脊椎のこわばりや後弯症、歩行困難などを引き起こし、仕事や日常生活の質に深刻な影響を与え、患者や家族、社会に大きな負担をかけています。ASの代替療法として、非薬物療法への注目が高まっています。お灸は、伝統的な中国医学(TCM)で使用される古代の治療法です。Du-moxibustion Therapyは、通常のお灸をベースに開発されたユニークで革新的な外用療法であり、ASに対して明確な治療効果があります。Du-hoxibustionは、TCMの互換性のある技術を巧みに組み合わせて、経絡、ツボ、漢方薬、およびお灸を統合します。本稿では、AS治療におけるDu-灸のメカニズムを研究するための実験的基礎を提供するために、実験マウスにおけるDu-hoxibustionの操作手順と注意事項を詳細に記述する。

概要

強直性脊椎炎(AS)は、主に軸骨格に影響を与える関節炎の漸進的に悪化し、障害となる形態です。最新の疫学調査によると、世界の人々の~0.01%-1.8%がこの症状に苦しんでおり1、そのほとんどが若い男性です(男女比は~2-3:1)2。中国人人口におけるASの発生率は0.2%〜0.4%です。この病気は主に脊椎と仙腸関節に関係しています。病気の後期には脊椎と仙腸関節の癒合が起こり、脊椎のこわばりや後弯症、歩行困難などを引き起こし、仕事や日常生活の質に深刻な影響を与え、患者や家族、社会に大きな負担をかけています1。現在、ASに対する決定的な解決策はなく、提供される治療法は、薬理学的および非薬理学的の両方で、主に痛みの緩和、疾患の進行の遅延、および生活の質の向上に焦点を当てています。近年、薬物療法の選択肢は非常に限られているため3、ASの代替療法である非薬物療法への注目が高まっています。中国では、患者はしばしば伝統的な漢方薬(TCM)からなる外用療法を好むが、これは副作用が軽く、治療中の利便性が高い。

灸は、中医学で使用される古代の治療技術です。杜灸は、杜経絡の脊椎部分に「泡を使った薬用灸」からなる外用治療技術です。主にASの治療に使用され、安全性と有効性が示されています。杜灸は、通常の灸と比較して、灸面積が広く、灸錐が大きく、火力が強く、高温であるという特徴があります4。システマティックレビューとメタアナリシスは、灸がAS5の効果的な補完療法であることを示唆しています。最近の研究では、AS患者の臨床症状といくつかの炎症因子が灸によって改善されたことが確認されました6。研究によると、Du-hoxibustionはβエンドルフィンの脳内含有量を増加させ、中枢鎮痛効果を発揮し7、HLA-B27遺伝子8の発現をダウンレギュレートし、ASの再発率を遅らせることができることが明らかになっています。また、Du-hoxibustionは、炎症性指数ESR(ESR)とC反応性タンパク質(CRP)、I型コラーゲンのC末端ペプチド(CTX-I)、およびDickkopf1タンパク質(DKK1)のレベルを低下させることにより、ASの進行を改善する効果があります9,10。

別の臨床研究では、Du-hoxibustionが、免疫機構のバランスをとるために、無秩序なT細胞サブセットであるIgと補体C3をさらに調整できることが示されました11。骨代謝に関しては、灸は血清アルカリホスファターゼ(ALP)と血清リン(S-P)の上昇を抑制し、血清カルシウム(S-Ca)、骨密度(BMD)、骨強度を増加させることができます12。さらに、Du-hoxibustionは、AS患者の倦怠感症状を和らげるために、複数のポイントで脊椎機能を修復することができます13。いくつかの動物実験では、ASの治療におけるお灸の潜在的なメカニズムが明らかになっています。ある研究では、灸が全体的な健康状態を有意に改善し、足の厚さのレベルを下げ、脊椎の靭帯組織サンプル中のIL-1β、PGE2、IL-6、およびTNF-αのレベルを低下させることが示されました。代謝経路分析により、同定された代謝物は、脂質、アミノ酸、腸内細菌叢、プリン代謝と同様にTCAサイクルに関連づけられました14。別の研究では、灸が炎症誘発性サイトカイン、IL-1β、TNF-α、IL-17、およびIL-6の発現を抑制することが示されました。 RANKL、RANK、ALP、および OCNのmRNAレベルを低下させました。ASマウスの病理組織学的特徴を改善した15。

これらの研究は、お灸がASの治療に有効である可能性を示唆しているが、これらの知見を確認し、AS患者の灸に対する最適な治療プロトコルを決定するには、さらなる研究が必要である。私たちのチームは、35年以上にわたって中国の臨床現場で広く実施され、適用されてきた伝統的な中国のお灸の基礎理論と実践的な操作に基づいて、灸療法を作成および修正しました。Du-hoxibustionによるASの治療に関する質の高い研究はほとんどありませんが、ASの治療における適応症は証拠によって裏付けられています。しかし、Du-duxibustionでASを治療するメカニズムは、さらなる研究に値します。動物実験は、ASの治療におけるDu-hoxibustionのメカニズムを探るための重要な方法です。Du-hoxibustionの臨床操作は比較的成熟していますが、動物実験でのメカニズムの研究に使用されることはめったにありません。本稿では、AS実験マウスの治療におけるDu-moxibustionの操作と注意点について詳細に述べる。

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プロトコル

すべての動物実験は、山東中医薬大学の実験動物福祉倫理審査委員会(No.SDUTCM20230831301)です。

1.動物の調製

  1. 実験グループとグループごとの動物数を事前に決定します。
  2. 雄のBALb/cマウスを選択し、22±1°Cの一定温度、60±5%の一定湿度、および12時間の日周期の光環境で飼育します。

2. ASマウスモデルの確立

注:ASモデルは、古典的なモデリング方法である軟骨プロテオグリカン(PG)で誘導されました16、17、18、19、20、21。BALB/c系統マウスにPGを繰り返し免疫し、腱炎と脊椎炎を誘発した。このプロトコルで使用される材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。

  1. 200 μLのピペットを使用して、200 μLのPGおよびCFA(またはIFA)を1.5 mLの遠心分離チューブに吸い込みます。静かに振とうして、遠心分離管内の液体を混合します。
  2. 遠心分離チューブを組織粉砕機に入れて均質化した後、氷上で4分間インキュベートします。組織グラインダーで次のパラメータを設定します: 60 Hz、粉砕30秒、間隔10秒 、合計 6サイクル。
  3. 1 mLのシリンジで遠心分離管から0.2 mLの乳化PGタンパク質を抽出します。
  4. 左手でマウスをつかんで固定します。マウスを仰臥位に置き、注射器を挿入したときに腹部臓器が損傷するのを防ぐために、頭を尾よりも低く保ちます。
  5. 右手でアルコール綿棒で腹部を消毒します。
  6. 注射器を右手に持って、腹部の下半分の腹側線の左右に針をわずかに皮下に挿入します。
  7. 針を中腹部線と平行に皮下3〜5mm押してから、針を皮膚に対して45°の角度で腹腔に押し込みます。
  8. 腹膜を貫通し、針プラグを抜いて、乳化したPGタンパク質をゆっくりと注入します。

3.デュお灸

注:Du-moxibustionの最も重要な3つの原材料を事前に準備します(図1)。

  1. お灸コーンを準備します。ベルベットを手に持ち、2つの手のひらを反対方向に向けてねじる力を加え、ベルベットを紡錘形にこすります(図2)
  2. 生姜を細かく切り、ジューサーでピューレにします(図3)。生姜のピューレを綿ガーゼでろ過します。生姜ジュースと生姜泥を生姜ピューレから分離して、次のステップの準備をします。
  3. 生姜泥10gと生姜ジュース20mLを用意し、後で使用するために紙コップに入れます。
  4. 0.1 gのTCM粉末(シナモン粉末、クローブ粉末、ノトプテリギウム粉末、アンタリジン粉末、人工ムスクの混合物)22 を秤量し、乳鉢で粉砕します。
  5. マウスを動物麻酔器の麻酔誘導ボックスに入れ、2〜3%イソフルランと酸素の混合物で2L / minの流量で麻酔します。
  6. 最初に驚愕反射がないことを観察して麻酔の深さを評価し、つま先を軽くつまむことに反応してペダル反射がないことを確認して外科的麻酔のレベルを確認します。
  7. マウスが手術平面麻酔に達したら、箱から取り出し、手術台に腹臥位で固定します。マウスの口と鼻を麻酔薬の出口に合わせます。
  8. 麻酔器に取り付けられたマスクを介して麻酔を投与し、そこからイソフルランと酸素が非再呼吸回路を介して供給されます。手術手順全体を通して、麻酔を維持し、マウスを37°Cの加熱パッドの上に置いたままにします。乾燥を防ぐために目に潤滑剤を塗布します。
  9. ツボの位置を特定し、刺激領域を特定します(図4)。
  10. マウスの背中の肌色の皮膚が見えるまで、マウスの背中の毛を剃ります。脱毛の幅が~1.5cmで、長さが第7頸椎から尾椎までであることを確認してください(図5A)。
  11. 準備した生姜ジュースを綿ガーゼで削った部分に塗ります(図3)。
  12. マウスの背面の中央線に筆記筆でTCMパウダーを均等に振りかけ、桑紙で覆います(図5B-D)。
  13. 長さ6cm、幅1.5cm、厚さ3mmの台形の生姜柱を生姜泥で作ります。生姜柱を桑紙に固定します(図5E)。
  14. 生姜柱の正中線の上に溝を作り(図3)、生姜柱の上にお灸を置きます。
  15. お灸コーンに火をつけ、前のお灸が燃え尽きた後に新しいお灸コーンを配置します。マウスの火傷を防ぐために生姜柱の硬さを確認し、合計3つのコーンを燃やします(図5F)。
  16. お灸を燃やした後、生姜とTCMパウダーを拭き取り、マウスの背面を清掃します。この時点で麻酔を中止します。
  17. ネズミが意識を取り戻すのを、餌と水に制限のない新しいケージに入れます。ケージを加熱パッドの上に置き、回復プロセスを支援します。動物が十分な意識を取り戻すまで監視します。
  18. マウスが完全に回復したら、矯正反射の存在を確認してから、通常のハウジングに戻します。
    注:手術中は、呼吸が弱くならないようにマウスの精神状態を監視する必要があります。やけどを防ぎますが、マウスを暖かく保ち、爪と尾の打撲傷を避けてください。

4.関節炎指数(AI)の評価

  1. AI スコアを、モデリング前、モデリング後、処理後の 3 回評価します。評価基準は次のとおりです:0、赤みや腫れはありません。1、いくつかのつま先にわずかな発赤または腫れ。2、ほとんどのつま先の関節とつま先の発赤と腫れ。3、足と足首関節の下の深刻な発赤と腫れ。4、足と足首関節の発赤と腫れ23。
  2. 4 つの足すべての AI スコアを計算し、最大値は 16 です。

5. Rotarodテスト

注:ロータロッドテストは、マウスが回転ドラムに費やす時間を記録することにより、運動の協調とバランスを評価するために使用されます。この実験は、20分間隔で区切られた3つの試行で構成されていました。公式の試験データは3回目の試験で記録され、最初の2回は訓練用として使われた。

  1. 300秒24で4〜40rpmの連続加速で回転する回転ドラムにマウスを置きます。
  2. レイテンシー時間(マウスがロッドから落ちるまでの時間)を測定します。脱落時の怪我を防ぐために、パッドを用意してください。

6. オープンフィールドテスト(OFT)

注:OFTは、自律神経運動の状態を評価するために使用され、病理学的行動を特定することを目的としています。4つの正方形のオープンフィールドアリーナ(50 cm x 50 cm x 40 cm)を一緒に配置して装置を形成しました。箱の底は9つの等しい正方形に分割されました。

  1. 実験室のバックグラウンドノイズを65dB未満に制御します。
  2. 各試験の前に、装置全体を75%エタノールで拭いてください。
  3. すべてのマウスを試験の1時間前に試験室に置き、環境に適応できるようにします。
  4. ネズミを四角いオープンフィールドアリーナに置き、10分間探索させます。
  5. 10分間の合計距離と移動速度を記録します。

7. 安楽死と検体採取

  1. マウスを麻酔誘導ボックスに入れ、2〜3%のイソフルランと酸素の混合物で2 L / minの流量で麻酔します。マウスがペダル反射の欠如によって確認された深い麻酔の状態に入ったら、維持麻酔のために手術台に移します。
  2. 利き手ではない方の手でマウスをつかんで固定します。
  3. 目の周りを軽く押すと、眼球がうっ血して突出します。
  4. ハサミを使用してマウスのひげを切り取り、毛による溶血を防ぎます。
  5. つま先をつまんだときにペダル反射がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。鉗子を使用して眼球をつかみ、すばやく取り除き、眼窩から微量遠心チューブに血液を流します。
    注:心臓穿刺などの代替採血方法も使用できます。
  6. 血液の滴出速度が遅くなったら、マウスの心臓部分を軽く押して血液の送り出しを速め、より多くの血液を得ます。次に、子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます。
  7. 利き手ではない方の手で鉗子を使って、足首関節のすぐ上で脚を持ちます。次に、足首関節のすぐ上の脚をハサミで切ります。

8.組織学的分析

  1. 足首の標本を4%パラホルムアルデヒドに24時間以上浸します。10%EDTA(pH = 7.4)で1ヶ月間脱灰します。
  2. 検体を4%パラホルムアルデヒドに2時間浸します。
  3. 次に、エタノール濃度を上げるグラジエント(70%、80%、90%、100%、100%、100%)に検体を浸します。各エタノール濃度を1時間浸します。
  4. 試料をキシレンに3時間浸します。
  5. 足首の標本をパラフィンに7時間浸します。パラフィンブロックを4°Cの冷蔵庫に置いておきます。
  6. 半自動パラフィン切片化機を使用して、パラフィンブロックを6μmの厚さにスライスします。
  7. スライスをキシレンに4 x 5分間浸して、脱ワックスを完了します。
  8. スライスをエタノール濃度が下がるグラジエント(100%、100%、95%、75%)にそれぞれ2分間浸します。蒸留水に2分間浸します。
  9. スライスをヘマトキシリンで10分間染色し、蒸留水で5秒間すすぎます。
  10. スライスを分化液に30秒間浸し、蒸留水で5秒間すすぎます。
  11. スライスをエオシンで1分間染色し、蒸留水で3分間すすぎます。
  12. エタノール濃度(80%、95%、100%、100%)をそれぞれ1分間ずつグラジエントに浸します。キシレンに3 x 3分間浸し、スライス25を密封します。

9. 酵素結合免疫吸着法(ELISA)

  1. 血漿中のIL-17およびTNF-α濃度は、メーカーの指示に従って、それぞれのキットを使用して測定します。

10. 統計解析

  1. データを平均±平均の標準誤差(SEM)として表します。
  2. 一元配置分散分析 (ANOVA) または二元配置反復測定 ANOVA と、それに続く Bonferroni または Tamhane T2 の事後検定によって有意性を判断します。
  3. P < 0.05 が統計的に有意であると考えてください。

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結果

PG誘発モデルマウスは、四肢や足の指の発赤や腫れを特徴とする末梢関節炎の症状を呈し、早くも14週目には徐々に軸性関節炎を発症したが、これはASの症状と非常によく似ていた。したがって、ASマウスモデルは、最後の注射から14週間後に関節炎指数(AI)が3ポイントを超えていれば成功したと見なされました22。マウスの足が腫れているように見えたら、週に1回、合計3回、...

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ディスカッション

ASは、背中、腰椎、関節の腫れの痛みとして臨床的に現れ、重症の場合、脊椎の変形と関節の硬直が発生することがあります26。早期の診断と治療により、AS患者の生活の質が向上し、障害率が低下し、予後が改善されます。中国伝統医学(TCM)によると、ASは腎臓と杜経絡の陽の欠乏、および内部に冷え性の蓄積によって引き起こされると考えられています。TCMは、経絡の概念...

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開示事項

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会の一般プログラム(No.82174491)とQilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project(No.Lu Weihan [2020]132)。実験条件を提供してくれた山東中医薬大学実験動物センターに感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10% EDTAShanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China
alcohol padsHYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China
anesthesia machineMedical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK
centrifuge tubesAxygen, Corning, NewYork, UAS
complete Frech's adjuvant (CFA)aladdin,Shanghai, ChinaF393378
cotton ballHenan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cotton gauzeHenan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China
cutting boardself-preparation
decorin from bovine articular cartilageSigma-Aldrich, MO, USAD8428
depilatory creamVeet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China
electronic scaleShanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China
Eppendorf tubeAxygen, Corning, NewYork, UAS
eye lubricantBeijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China
gingerself-preparation
GraphPad Prism 7 softwareGraphPad Software,Boston, USA
hair clipperSuper human Group CO LTD, Jinhua, China
heating padsShenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China
incomplete Freund’s adjuvant (IFA)aladdin,Shanghai, ChinaF393371
injection syringeShandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China
isofluraneShenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, ChinaR510-22-10
joss stickShijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China
juicerBraun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China
knifeself-preparation
lighterZhejiang tiger-lighter Co. LTD
mortarLuoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China
Mouse IL-17 ELISA Kitabsin, Shanghai, Chinaabs520009-96T
Mouse TNF-α ELISA KitWuhan Sanying, Wuhan, ChinaKE10002
mulberry paperYishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China
OFTXinruan,Shanghai, ChinaXR-XZ301
paper cupself-preparation
pipettesOXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK
refined moxa velvetself-preparation
rotarodXinruan,Shanghai, ChinaXR-6C
scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinderNingbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD
scissorsShandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China
semi-automatic paraffin sectioning machineLeica Camera AG, Watznach, Germany
SPSS 25.0 softwareInternational Business Machines Corporation, NewYork, UAS
TCM powderself-preparation
tipsBiosharp, Labgic, Beijing, China
writing brushYishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China

参考文献

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