JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

غالبا ما يستخدم التصوير بالحزمة الأيونية المتعددة (MIBI) لتصوير المصفوفات الدقيقة للأنسجة ومناطق الأنسجة المتجانبة والمتجاورة ، لكن البرامج الحالية لإعداد هذه التجارب مرهقة. واجهة البلاط / SED / الصفيف هي أداة رسومية تفاعلية بديهية تم تطويرها لتبسيط وتسريع إعداد تشغيل MIBI بشكل كبير.

Abstract

التصوير بالحزمة الأيونية المتعددة (MIBI) هو تقنية مجهرية قائمة على قياس الطيف الكتلي من الجيل التالي تولد 40+ صورة plex للتعبير البروتيني في الأنسجة النسيجية ، مما يتيح تشريحا مفصلا للأنماط الظاهرية الخلوية والتنظيم النسيجي. يحدث عنق الزجاجة الرئيسي في العملية عندما يختار المستخدمون المواقع المادية على الأنسجة للتصوير. مع زيادة حجم وتعقيد تجارب MIBI ، أصبحت الواجهة التي توفرها الشركة المصنعة وأدوات الجهات الخارجية غير عملية بشكل متزايد لتصوير المصفوفات الدقيقة للأنسجة الكبيرة ومناطق الأنسجة المتجانبة. وهكذا ، تم تطوير طبقة واجهة رسومية تفاعلية قائمة على الويب ، ما تراه هو ما تحصل عليه (WYSIWYG) - واجهة البلاط / SED / الصفيف (TSAI) - للمستخدمين لتعيين مواقع التصوير باستخدام إيماءات الماوس المألوفة والبديهية مثل السحب والإفلات والنقر والسحب والرسم المضلع. مكتوب وفقا لمعايير الويب المضمنة بالفعل في متصفحات الويب الحديثة ، ولا يتطلب تثبيت برامج أو ملحقات أو برامج تحويل برمجي خارجية. تهم هذه الواجهة المئات من مستخدمي MIBI الحاليين ، وهي تبسط بشكل كبير وتسرع إعداد عمليات تشغيل MIBI الكبيرة والمعقدة.

Introduction

التصوير بالحزمة الأيونية المتعددة (MIBI) هو تقنية لتصوير 40+ بروتينات في وقت واحد على أقسام الأنسجة النسيجية بدقة تصل إلى 250 نانومتر1،2،3. بعد تلطيخ قسم الأنسجة النسيجية باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بمعادن عنصرية نقية نظائريا ، تقوم أداة MIBI بإجراء قياس طيف الكتلة الأيونية الثانوية لتحديد جميع النظائر في وقت واحد - وبالتالي التعبير عن جميع مستضدات 40+ - في البقع الفردية على الأنسجة. يتم إجراؤها عبر شبكات من ملايين البقع ، وتمكن صور 40+ plex الناتجة عن تعبير البروتين من ترسيم حدود الخلايا وتحديد أنواع معينة من الخلايا مع الحفاظ على السياق المكاني1،2،3،4. تم استخدام هذه التقنية من قبل مئات المستخدمين في ما يقرب من 20 موقعا لدراسة التركيب الخلوي ، والملامح الأيضية ، و / أو بنية العشرات من أنواع الأنسجة كجزء من فحص الاستجابة المناعية للأورام ، والتهاب الأنسجة الناجم عن العوامل المعدية ، وعلم الأمراض العصبية للخرف ، والتسامح المناعي في الحمل5،6،7،8،9 ، 10,11.

يتمثل عنق الزجاجة الرئيسي في تشغيل أداة MIBI في إعداد مجالات الرؤية (FOVs) - 200 × 200 ميكرومتر2 إلى 800 × 800 ميكرومتر2 مناطق الأنسجة - للتصوير. يقوم MIBI بتصوير مجال رؤية واحد في كل مرة ، حتى 800 × 800 ميكرومتر2 ، وبالتالي فإن تصوير مساحات أكبر يتطلب خياطة العديد من FOVs معا. يتضمن تصوير مصفوفة الأنسجة الدقيقة (على سبيل المثال ، ثمانية أنسجة دائرية في الشكل 1 أ) وضع العديد من FOVs متباعدة. لإعداد FOVs ، توفر واجهة الشركة المصنعة 1) صورة كاميرا بصرية للشريحة مع تقاطع يتوافق تقريبا مع إحداثيات التصوير المحددة (الشكل 1A) و 2) صورة كاشف الإلكترون الثانوي (SED) التي تظهر المنطقة الدقيقة عند الإحداثيات ، يقال إنها دقيقة في حدود 0.1 ميكرومتر (الشكل 1 ب). أولا ، يضع المستخدم تقريبا مجال رؤية واحد باستخدام الصورة البصرية. نظرا لأن دقة الصورة تبلغ حوالي 60 ميكرومتر فقط لكل بكسل ، إذا تم إيقاف الموضع بمقدار بكسلين (2 بكسل × 60 ميكرومتر لكل بكسل) ، إيقاف تشغيل مجال الرؤية القياسي 400 ميكرومتر بنسبة 30٪. وبالتالي ، يجب على المستخدم استخدام صورة SED لضبط الموضع - تسلسل ممل من عشرات الخطوات التي تتضمن نوافذ منبثقة متعددة ، وكتابة الإحداثيات في مربعات النص ، ودفع SED ببطء باستخدام أزرار التحكم في الاتجاه ، وغالبا ما يتم تدوين الإحداثيات على الورق (الشكل التكميلي 1). يجب تكرار هذه العملية لكل بقعة من 100+ ميكروأري الأنسجة الأساسية (TMA). يمكن أن تساعد بعض أدوات الجهات الخارجية في تحديد المواقع الأوليةالتقريبية 12. ومع ذلك ، فإنها لا تزال تتطلب بعض المعرفة البرمجية ، ولا يزال تحديد المواقع النهائي يتم من خلال عملية عشرات الخطوات. كما أنه من المزعج للغاية وضع شبكات من FOVs المجاورة ، والتي سيتم خياطتها لاحقا معا في صورة بانورامية مبلطة.

وهكذا ، تم تطوير واجهة البلاط / SED / الصفيف (TSAI) بهدف تمكين المستخدمين من وضع أعداد كبيرة من FOVs بسرعة باستخدام واجهة رسومية تفاعلية بديهية. يتكون TSAI من مكونين رئيسيين: 1) واجهة مستخدم رسومية قائمة على الويب (واجهة مستخدم الويب) لوضع نقاط TMA ومربعات الأنسجة بسرعة ، و 2) عمليات التكامل في واجهة تحكم مستخدم MIBI لإنشاء صورة SED مبلطة وضبط مواضع FOV. إذا كنت تستخدم الصورة البصرية فقط ، فيمكن وضع العديد من FOVs تقريبا ثم تعديلها بسرعة باستخدام أدوات التنقل / الضبط FOV (الشكل 2 ، TSAI ، الفرع الأيسر). ومع ذلك ، إذا تم إجراء تجانب SED ، فيمكن وضع FOVs بدقة على صورة SED المتجانبة دون الحاجة إلى مزيد من التعديلات في وضع SED (الشكل 2 ، TSAI ، الفرع الأيمن). من الأمور ذات الأهمية العامة لمئات مستخدمي MIBI الحاليين ، تجعل هذه الأدوات التجانب وتحديد مواقع TMA أمرا بسيطا للغاية حتى بالنسبة للمبتدئين وتقلل من إعدادات تشغيل MIBI المعقدة من عدة ساعات إلى بضع عشرات من الدقائق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تحميل TSAI

  1. قم بتشغيل TSAI عن طريق فتح https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai في مستعرض الويب الخاص بكمبيوتر التحكم في مستخدم MIBI.
    1. يحتوي مثيل TSAI هذا على إعدادات مسبقة مخصصة لا تنطبق على جميع الأدوات. عند استخدامه ، قم ببناء المربعات فقط من قالب FOV (s) كما تم إنشاؤه أدناه في الخطوة 2.6. يعمل TSAI محليا داخل متصفح الويب ، ولا يتم إرسال أي صورة أو .json أو بيانات اسم ملف إلى الخادم أو تخزينها عليه.
  2. بدلا من ذلك ، قم بإعداد TSAI على أي موقع ويب بإعدادات مسبقة مخصصة لأي أداة.
    1. انتقل إلى https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai وقم بتنزيل دليل mibi_tsai_standalone. بدلا من ذلك ، قم بتنزيل ملف الترميز التكميلي 1 .zip ملف وفك ضغط المحتويات إلى دليل بعنوان mibi_tsai_standalone.
    2. افتح mibi_tsai_standalone/_resources/index.js في أي محرر نصوص.
    3. إذا لزم الأمر، قم بتحرير حجم مجال الرؤية، واختيار الوقت/التوقيت، وحجم البيانات النقطية، ومجال الرؤية JSON، والإعدادات المضبوطة مسبقا الموصى بها في index.js لمطابقة إعدادات الأداة. ينطبق هذا بشكل أساسي على الأدوات المخصصة ، ولكن يجب التحقق من أزواج اختيار الوقت / التوقيت بغض النظر. وفر index.js.
    4. قم بتحميل mibi_tsai_standalone إلى أي خادم ويب يمكن الوصول إليه عبر الإنترنت ، على سبيل المثال ، موقع ويب للمختبر أو موقع ويب تستضيفه الجامعة.
    5. افتح mibi_tsai_standalone/index.html في مستعرض الويب الخاص بكمبيوتر التحكم في مستخدم MIBI.

2. تحميل شريحة MIBI وإنشاء ملف قالب

  1. سجل الدخول إلى أداة تعقب تجربة MIBI (واجهة الويب التي توفرها الشركة المصنعة لإدارة البيانات الوصفية المتعلقة بالفحص) في متصفح الويب.
  2. في علامة التبويب الشرائح ، أضف شريحة جديدة وأضف قسما جديدا (الشكل التكميلي 2A-B). في علامة التبويب الموارد ، حدد أو أنشئ لوحة علامة (الشكل التكميلي 2C).
  3. في علامة التبويب الأقسام ، أضف القسم الجديد إلى اللوحة (الشكل التكميلي 2D).
  4. قم بتسجيل الدخول إلى واجهة تحكم مستخدم MIBI في متصفح الويب. قم بتحميل شريحة MIBI بالنقر فوق نموذج Exchange وتحديد الشريحة الجديدة (الشكل التكميلي 3A).
  5. قم بإنشاء قالب مجال الرؤية بالنقر فوق إضافة مجال الرؤية (الشكل التكميلي 3 ب) وتعيين أبعاد الإطار وحجم مجال الرؤية ووقت الإقامة ووضع التصوير ومعرف القسم.
  6. تصدير (تنزيل) قائمة FOV إلى ملف .json (الشكل التكميلي 3C). قم بتنزيل الصورة البصرية كملف .png (الشكل التكميلي 3D).

3. التسجيل المشترك لمحرك مرحلة الصورة البصرية

  1. افتح واجهة مستخدم الويب TSAI في متصفح الويب. إذا لم يتم إجراء التسجيل المشترك مسبقا ، فيجب فتح قائمة التسجيل المشترك البصري تلقائيا. إذا تم تنفيذه وكان كافيا ، فلا تكرر هذه الخطوات.
  2. افتح قائمة التسجيل المشترك البصري . انقر فوق نسخ رمز التسجيل المشترك التلقائي إلى الحافظة (الشكل التكميلي 4 أ).
  3. افتح واجهة تحكم مستخدم MIBI في مستعرض الويب. اضغط على Ctrl + Shift + J لفتح وحدة تحكم المتصفح ، أو انقر بزر الماوس الأيمن على الصفحة وانقر فوق فحص ، ثم افتح علامة التبويب وحدة التحكم (الشكل التكميلي 4B).
  4. الصق الرمز في وحدة التحكم واضغط على Enter. انقر فوق الارتباط الذي تم إنشاؤه في وحدة التحكم (الشكل التكميلي 4C). سيؤدي هذا إلى تحميل التسجيل المشترك في واجهة مستخدم الويب TSAI وحفظه كملف تعريف ارتباط ، لذلك يستمر ولا يحتاج إلى تكرار ما لم يكن هناك تغيير في أجهزة الجهاز.

4. مسح SED المبلط

  1. قم بتحميل .png الصور البصرية والملفات .json من الخطوة 2.6 عن طريق سحبها وإفلاتها في واجهة مستخدم الويب TSAI.
  2. افتح قائمة SED Tiler وانقر على مربع نص في الصف العلوي (الشكل التكميلي 5A).
  3. انقر (± السحب) على الصورة البصرية لتحديد الزاوية العلوية اليسرى لمسح SED (الشكل التكميلي 5B).
  4. اضغط على المفتاح D أو انقر فوق مربع نص في الصف الثاني في قائمة SED Tiler.
  5. انقر فوق (± السحب) على الصورة البصرية لتحديد الزاوية اليمنى السفلية لمسح SED.
  6. في قائمة SED Tiler ، انقر فوق نسخ مسح SED وتحويل رمز التصحيح إلى الحافظة (الشكل التكميلي 5C).
  7. افتح واجهة تحكم مستخدم MIBI في مستعرض الويب. الصق الرمز في وحدة التحكم واضغط على Enter (الشكل التكميلي 5D).
  8. ضع MIBI في وضع SED على إعداد QC - 300 μm ، وانتقل إلى منطقة لن يتم الحصول عليها ، واضبط الكسب والتركيز والوصمة.
    1. اضبط سطوع وتباين صورة SED دون تغيير الكسب. اضغط على B لزيادة السطوع أو Shift + B لتقليله. اضغط على C لزيادة التباين أو Shift+C لتقليله. اضغط على Shift + V لإعادة تعيين كل من السطوع والتباين.
  9. اضغط على Shift+T لبدء فحص SED المتجانب.
  10. عند الانتهاء ، يجب أن يحفظ تلقائيا ملف .png جديد لصورة SED المتجانبة (الشكل 3). يمكن إضافة الأحرف إلى بداية اسم الملف ولكن لا تقم بتعديل أي جزء آخر من اسم الملف.
  11. إذا كانت لوحات معينة خارج نطاق التركيز البؤري أو تم مسحها ضوئيا بشكل غير صحيح، فقم بإعادة فحصها.
    1. اضغط على Shift+R لإضافة لوحة إلى قائمة انتظار إعادة الفحص. سيتم فتح مربع حوار ، يطالب المستخدم بصف وعمود اللوحة. الأرقام مفهرسة صفريا ، وبالتالي تدخل 8,0 قائمة انتظار في الصف التاسع ، العمود الأول.
    2. بعد إضافة جميع اللوحات ذات الصلة إلى قائمة الانتظار ، اضغط على Shift + T لإعادة المسح. عند الانتهاء ، يجب أن يحفظ تلقائيا ملف .png جديد لصورة SED المتجانبة.
  12. خطوة حاسمة: افحص فحص SED المتجانب بحثا عن اختلالات كبيرة (الشكل 3C-D). في حالة وجوده، اتصل بدعم الشركة المصنعة لضبط المحرك وشعاع التصوير أو حاول تصحيح البرنامج يدويا باستخدام عناصر التحكم في لوحة المفاتيح في الخطوات من 4.12.1 إلى 4.12.9 (الشكل التكميلي 6A).
    1. للتحقق من محاذاة محرك مرحلة SED ، انتقل إلى منطقة من الشريحة بدون نسيج. اضغط على Shift + 5 لحرق خمسة مجالات FOVs 400 ميكرومتر في نمط رقعة الشطرنج (الشكل التكميلي 6B-C) أو Shift + 9 لحرق نمط 3 × 3 من 400 ميكرومتر FOVs (الشكل التكميلي 6D-E).
    2. إذا كانت أعمدة FOV متباعدة جدا ، فاضغط على 1 وقم بتعيين قيمة x f (x) إلى رقم عشري سالب ، عادة بين -0.0025 و -0.1.
    3. إذا تم إزاحة FOVs للصف الثالث إلى اليسار بالنسبة إلى FOVs للصف الأول ، فاضغط على 2 واضبط قيمة x f (y) على رقم عشري موجب ، عادة بين 0.0025 و 0.1.
    4. إذا تم إزاحة FOVs للعمود الثالث لأسفل بالنسبة إلى FOVs في العمود الأول ، فاضغط على 3 واضبط قيمة y f (x) على رقم عشري سالب ، عادة بين -0.0025 و -0.1.
    5. إذا كانت صفوف FOV متباعدة جدا ، فاضغط على 4 واضبط قيمة y f (y) على رقم عشري سالب ، عادة بين -0.0025 و -0.1.
    6. كرر الخطوات 4.12.1 إلى 4.12.5 بشكل متكرر حتى تشكل رقعة الشطرنج وأنماط 3 × 3 شبكة مستقيمة تقريبا (الشكل التكميلي 6C ، E).
    7. اضغط على S لحفظ صورة .png للنموذج مع قيم التصحيح في اسم الملف.
    8. اسحب ملف .png هذا وأفلته في واجهة مستخدم الويب TSAI لتحميل القيم وحفظها في ملف تعريف ارتباط المتصفح.
    9. قم بإجراء عمليات مسح SED المتجانبة للتحقق من المعاملات. استنادا إلى نفس المبادئ الواردة في الخطوات من 4.12.2 إلى 4.12.5، قم بإجراء المزيد من التعديلات على المعاملات لتصحيح أي اختلالات في صور SED المتجانبة.
  13. إذا كان SED المتجانب مناسبا ، فاضغط على Escape. ارجع إلى واجهة مستخدم الويب TSAI.
  14. اسحب ملف SED .png المتجانب وأفلته في واجهة مستخدم الويب TSAI (الشكل التكميلي 5E).
  15. انقر فوق علامة التبويب SED واضبط التكبير (الشكل التكميلي 5F).
  16. لضبط سطوع الصورة وتباينها و/أو خيارات الرسم مثل سمك الخط وحجم المؤشر، استخدم قائمة خيارات الشريحة أعلى صورة SED.
  17. تتوفر اختصارات لوحة المفاتيح ويظهر معظمها بجوار عناصر التحكم في الصورة: اضغط على Z للتكبير واضغط على Shift+Z للتصغير. اضغط على B لزيادة السطوع أو Shift + B لتقليله. اضغط على C لزيادة التباين أو Shift+C لتقليله. اضغط على Shift + V لإعادة تعيين كل من السطوع والتباين. اضغط على L لتبديل التسميات فوق اللوحات. اضغط على O لتبديل دوائر نصف قطرها 5 مم مرسومة حول مواقع التركيز البؤري.

5. ميكروأري الأنسجة (TMA)

  1. في حالة تعيين FOVs لشبكة من بقع TMA ، قم أولا بتعيين نمط FOVs ليتم تكراره. في البلاط ذي الصلة من عمود المربعات ، اضبط الأعمدة والصفوف (الشكل 4 أ) وحدد / ألغ تحديد المربعات في الخريطة (الشكل 4 ب) ، بالإضافة إلى ضبط إعدادات FOV الأخرى حسب الضرورة.
  2. في اللوحة ذات الصلة، انقر فوق التحليل الحراري الميكانيكي (TMA ) لفتح قائمة خيارات التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) (الشكل 4C). اضبط عدد صفوف وأعمدة بقع التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) (الشكل 4D). إذا لزم الأمر ، أضف بادئة تسمية (الشكل 4E) وقم بتحرير ترقيم صف البداية والأعمدة (الشكل 4F).
  3. في صورة الشريحة ، انقر فوق الزوايا الأربع ل TMA (الشكل 4G-J). انقر واسحب الزوايا المحاطة بدائرة لضبط موضع الشعيرات المتصالبة بحيث تتطابق بشكل أفضل مع بقع التحليل الحراري الميكانيكي (TMA).
  4. انقر فوق إنشاء TMA من قائمة خيارات TMA (الشكل 4K).
  5. مرر مؤشر الماوس فوق كل لوحة في عمود اللوحات للتحقق من موضعها. للضبط ، انقر فوق نقل (الشكل 4L). ثم انقر واسحب على صورة الشريحة أو اضغط على مفاتيح أسهم لوحة المفاتيح.
    1. اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift أثناء الضغط على مفاتيح الأسهم للتحرك لمسافة أبعد. اضغط مع الاستمرار على مفتاح Alt (في Windows) أو Opt (في نظام التشغيل Mac) أثناء الضغط على مفاتيح الأسهم لتحريك مسافة أقصر.
    2. عند تحديد نقل، اضغط على T لإلغاء تحديد خانة الاختيار الموجودة بجوار اسم اللوحة، وإزالتها من العرض، وحذفها من أي ملفات .json تم إنشاؤها لاحقا. بدلا من ذلك ، قم بإلغاء تحديد مربع الاختيار مباشرة باستخدام الماوس (الشكل 4M) أو قم بإزالته بالكامل بالنقر فوق حذف.
    3. عند تحديد الحركة، اضغط على 2 أو 4 أو 8 لضبط حجم مجال الرؤية على 200 ميكرومتر أو 400 ميكرومتر أو 800 ميكرومتر على التوالي، وسيتم قياس أبعاد البيانات النقطية بشكل متناسب بحيث تظل دقة التصوير دون تغيير.
    4. عند تحديد نقل، اضغط على A للانتقال إلى اللوحة السابقة أو اضغط على D للانتقال إلى اللوحة التالية.
    5. لضبط إعدادات التجانب الأخرى، انقر فوق الزر ≡ لتوسيع قائمة الإعدادات إذا لم تكن مرئية.

6. المنطقة / بلاط المضلع

  1. في حالة ضبط FOVs لتغطية منطقة متجاورة من الأنسجة ، اضبط أولا إعدادات FOV حسب الضرورة في البلاط ذي الصلة من عمود البلاط.
  2. في اللوحة ذات الصلة ، انقر فوق مضلع (الشكل 5 أ). انقر فوق صورة الشريحة لتعيين رؤوس / زوايا المنطقة المراد تبليطها (الشكل 5B-C). انقر نقرا مزدوجا لإغلاق المضلع وتغطية المنطقة باستخدام FOVs (الشكل 5D).
  3. قم بالتمرير إلى أسفل عمود المربعات وانقر فوق الزر ≡ (^ عند التوسيع ، الشكل 5E) في بلاط المضلع الجديد لرؤية خريطة التجانب.
  4. قم بتبديل المربعات الفردية ON أو OFF بالنقر فوق خريطة البلاط (الشكل 5F) ، أو بالنقر فوق Clicker (الشكل 5G) والنقر فوق FOVs المتجانبة في صورة الشريحة.
  5. لإيقاف تشغيل العديد من FOVs ، انقر فوق Eraser ثم انقر واسحب على FOVs المتجانبة في صورة الشريحة (الشكل 5H).
  6. للتبديل بين FOVs المتعددة ، انقر فوق Clicker (الشكل 5G) ثم انقر واسحب المناطق الفارغة في صورة الشريحة التي تغطيها خريطة التجانب.
  7. لإدراج الصفوف أعلاه ، انقر فوق الزر ▲ (الشكل 5I). لإدراج أعمدة إلى اليسار ، انقر فوق الزر ◄ (الشكل 5J).
  8. لضبط موضع التجانب، انقر فوق نقل (الشكل 5K). ثم انقر فوق صورة الشريحة واسحبها، أو اضغط على مفاتيح الأسهم بلوحة المفاتيح، أو استخدم عناصر التحكم الأخرى الموضحة في الخطوات من 5.5.1 إلى 5.5.5.

7. الملاحة FOV والتعديل

  1. إذا كان تجانب SED غير محاذ أو إذا كان تقاطع الصورة البصرية لا يعكس موضع محرك المرحلة الفعلي ، فاضبط مواضع FOV في وضع SED في واجهة تحكم مستخدم MIBI بمساعدة عناصر التحكم في لوحة المفاتيح أدناه.
  2. افتح قائمة التنقل / الضبط FOV أسفل صورة الشريحة (البصرية أو SED). انقر فوق نسخ رمز التنقل FOV إلى الحافظة.
  3. افتح واجهة تحكم مستخدم MIBI في مستعرض الويب. ضع MIBI في وضع SED واضبط الكسب والتركيز والوصم.
  4. اضغط على Ctrl+Shift+J لفتح وحدة تحكم المتصفح، أو انقر بزر الماوس الأيمن على الصفحة وانقر على فحص، ثم افتح علامة التبويب وحدة التحكم.
  5. الصق الرمز في وحدة التحكم واضغط على Enter. سينتقل الرمز تلقائيا إلى مجال الرؤية الأول وموضع FOV الدقيق المعروض في صورة SED لواجهة تحكم مستخدم MIBI.
  6. اضبط سطوع وتباين صورة SED دون تغيير الكسب. اضغط على B لزيادة السطوع أو Shift + B لتقليله. اضغط على C لزيادة التباين أو Shift+C لتقليله. اضغط على Shift + V لإعادة تعيين كل من السطوع والتباين.
  7. لضبط تكبير SED، اضغط على مفاتيح M (200 μm) أو (400 μm) أو . (800 μm) أو / (الحد الأقصى).
  8. لتحريك مجال الرؤية ، اضغط على مفاتيح الأسهم بلوحة المفاتيح. احفظ المركز بالضغط على W. اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift أثناء الضغط على مفاتيح الأسهم للتحرك لمسافة أبعد. اضغط مع الاستمرار على مفتاح Alt (في Windows) أو Opt (في نظام التشغيل Mac) أثناء الضغط على مفاتيح الأسهم لتحريك مسافة أقصر. لاحظ أنه يمكن نقل R1C1 فقط من أي تجانب معين.
  9. لتبديل FOV ON أو OFF ، اضغط على T. لتغيير حجم مجال الرؤية ، اضغط على 2 (200 ميكرومتر) أو 4 (400 ميكرومتر) أو 8 (800 ميكرومتر). سيتم قياس أبعاد البيانات النقطية بشكل متناسب بحيث تظل دقة التصوير كما هي.
  10. لحفظ ملف صورة لصورة SED والتقاطع المتراكب، اضغط على S. لحفظ مسودة التعديلات على ملف .txt، اضغط على X.
  11. عند الرضا ، اضغط على D للانتقال إلى FOV التالي ، أو A للعودة إلى FOV السابق. كرر الخطوات من 7.6 إلى 7.11 لجميع مجالات الرؤية.
  12. عند الانتهاء من جميع FOVs ، اضغط على X أو Escape. سيتم حفظ التعديلات في ملف .txt ونسخها إلى الحافظة.
  13. ارجع إلى واجهة مستخدم الويب TSAI. اسحب ملف .txt وأفلته في واجهة مستخدم الويب TSAI أو الصق التعديلات في مربع النص في قائمة التنقل / التعديل FOV.
  14. انقر فوق ضبط لتطبيق المعايرات على الإطارات المتجانبة في عمود البلاطات.

8. JSON إنشاء الملفات واستيرادها

  1. أسفل عمود المربعات ، ضمن الإخراج ، تحقق من قائمة التجانبات ووقت التشغيل المقدر (الشكل التكميلي 7 أ).
  2. ضمن المجموعة ، حدد خيارا لتجميع مجال الرؤية (الشكل التكميلي 7 ب). التجميع ليس له أي تأثير على ملف .json مرتب بالتسلسل.
    1. بالنسبة لملف .json العشوائي ، سيؤدي تجميع FOVs حسب البلاط إلى ترتيب FOVs بحيث تظل جميع FOVs داخل تجانب معين معا ، على الرغم من أن المربعات بترتيب عشوائي.
    2. بالنسبة لملف .json العشوائي ، لا تقم بتجميع FOVs سوف تطلب بشكل عشوائي FOVs بحيث يتم خلط FOVs من مربعات مختلفة.
    3. إذا تم تحديد التركيز البؤري التلقائي قيد التشغيل، تجميع مجالات الرؤية تلقائيا حسب أقرب موقع تركيز بؤري تلقائي.
  3. ضمن تقسيم ، حدد خيارا للتقسيم إلى ملفات .json متعددة (الشكل التكميلي 7C).
    1. عدم الانقسام سيحتفظ بجميع FOVs في ملف .json واحد فقط.
    2. سيؤدي التقسيم حسب كل # FOVs إلى تقسيم FOVs عبر ملفات .json متعددة ، حيث يحتوي كل ملف على العدد المحدد من FOVs.
    3. سيؤدي التقسيم حسب كل # ساعات # دقيقة إلى تقسيم FOVs عبر ملفات .json متعددة ، حيث يكون وقت التشغيل المقدر لكل ملف هو مقدار الوقت المحدد تقريبا.
  4. عرض وإعادة ترتيب FOVs في ملفات .json عن طريق فتح قائمة إعادة الترتيب (الشكل التكميلي 7D). لنقل مجال الرؤية ، انقر واسحبه إلى الموضع المطلوب. سيتم إعادة ترتيب FOVs الأخرى بشكل تفاعلي حول FOV المسحوب.
  5. لحفظ ملف (ملفات) .json ، انقر فوق زر (أزرار ) FOVs أسفل قائمة إعادة الترتيب. يضع .json المتسلسل FOVs بالترتيب حسب البلاط ، ثم الصف ، ثم العمود (الشكل التكميلي 7E). تقوم .json العشوائية بتوزيع FOVs عشوائيا داخل المجموعات كما هو محدد في الخطوة 8.2 (الشكل التكميلي 7F).
  6. لحفظ صورة للأنسجة باستخدام FOVs وخيارات العرض المطبقة (تسميات البلاط ، السطوع ، التباين ، إلخ) ، انقر فوق حفظ الصورة المتجانبة (الشكل التكميلي 7G). غالبا ما يكون هذا مفيدا لحفظ السجلات ومشاركتها مع المتعاونين.
  7. العودة إلى واجهة تحكم مستخدم MIBI. انقر فوق استيراد FOVs وحدد ملف .json الذي تم إنشاؤه. اضبط التركيز والوصمة والحالية حسب الضرورة وانقر فوق بدء التشغيل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يوفر TSAI طريقتين لإعداد FOVs (الشكل 2). يستخدم المرء فقط الصورة البصرية (الشكل 2 ، TSAI ، الفرع الأيسر) ، على غرار الطرق الأخرى الموجودة. الطريقة الثانية - إنشاء صورة SED متجانبة - فريدة من نوعها ل TSAI (الشكل 2 ، TSAI ، الفرع الأيمن). يرسم T...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يعد التصوير بالحزمة الأيونية المتعددة (MIBI) تقنية قوية لتشريح الأنماط الظاهرية الخلوية التفصيلية والهندسة النسيجيةللأنسجة 5،6،7،8،9،10،11. ركزت ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم H. Piyadasa من قبل زمالة المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) (MFE-176490). تم دعم B. Oberlton من قبل زمالة المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) (2020298220). تم دعم A. Tsai من قبل زمالة مؤسسة دامون رونيون لأبحاث السرطان (DRCRF) (DRG-118-16) ، وقسم علم الأمراض في ستانفورد ، وصندوق Annelies Gramberg ، و NIH 1U54HL165445-01. شكر وتقدير إضافي للدكتور أفيري لام والدكتور دافيدي فرانشينا وماكو غولدستون للمساعدة في اختبار البرنامج وتصحيحه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MIBI computerIonpath
MIBIcontrol (software)Ionpath
MIBIscopeIonpathMultiplexed Ion Beam Imaging (MIBI) microscope
MIBIslideIonpath567001Conductive slide for MIBI
Tile/SED/Array Interface (TSAI) (software)https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/

References

  1. Liu, C. C., et al. Multiplexed Ion Beam Imaging: Insights into Pathobiology. Annu Rev Pathol. 17, 403-423 (2022).
  2. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Sci Adv. 5 (10), 1-16 (2019).
  3. Elhanani, O., Keren, L., Angelo, M. High-Dimensional Tissue Profiling by Multiplexed Ion Beam Imaging. Methods Mol Biol. 2386, 147-156 (2022).
  4. Greenwald, N. F., et al. Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning. Nat Biotechnol. 40 (4), 555-565 (2022).
  5. Risom, T., et al. Transition to invasive breast cancer is associated with progressive changes in the structure and composition of tumor stroma. Cell. 185 (2), 299.e18-310.e18 (2022).
  6. McCaffrey, E. F., et al. The immunoregulatory landscape of human tuberculosis granulomas. Nat. Immunol. 23 (2), 318-329 (2022).
  7. Greenbaum, S., et al. A spatially resolved timeline of the human maternal–fetal interface. Nature. 619 (7970), 595-605 (2023).
  8. Hartmann, F. J., et al. Single-cell metabolic profiling of human cytotoxic T cells. Nat Biotechnol. 39 (2), 186-197 (2021).
  9. Patwa, A., et al. Multiplexed imaging analysis of the tumor-immune microenvironment reveals predictors of outcome in triple-negative breast cancer. Commun Biol. 4 (1), 852(2021).
  10. Keren, L., et al. A Structured Tumor-Immune Microenvironment in Triple Negative Breast Cancer Revealed by Multiplexed Ion Beam Imaging. Cell. 174 (6), 1373.e19-1387.e19 (2018).
  11. Vijayaragavan, K., et al. Single-cell spatial proteomic imaging for human neuropathology. Acta Neuropathol. Commun. 10 (1), 158(2022).
  12. GitHub - angelolab/toffy: Scripts for interacting with and generating data from the commercial MIBIScope. (n.d.). , https://github.com/angelolab/toffy (2023).
  13. Web Hypertext Application Technology Working Group (WHATWG). (n.d.). HTML Living Standard. , from https://html.spec.whatwg.org/multipage (2023).
  14. ECMA International. (n.d.). ECMAScript 2022 Language Specification. , https://www.ecma-international.org/publications-and-standards/standards/ecma-262 (2023).
  15. World Wide Web Consortium (W3C). (n.d.). Cascading Style Sheets (CSS). , from https://www.w3.org/Style/CSS/Overview.en.html (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MIBI WYSIWYG SED TSAI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved