Configuration rapide de l’imagerie des microréseaux de tissus et des zones en mosaïque sur le microscope d’imagerie à faisceau d’ions multiplexé à l’aide de l’interface Tile/SED/Array

Résumé

L’imagerie par faisceau d’ions multiplexés (MIBI) est souvent utilisée pour imager des microréseaux de tissus et des zones de tissus contiguës en mosaïques, mais les logiciels actuels pour mettre en place ces expériences sont lourds. L’interface tile/SED/array est un outil graphique intuitif et interactif développé pour simplifier et accélérer considérablement la configuration de l’exécution MIBI.

Résumé

L’imagerie par faisceau d’ions multiplexés (MIBI) est une technique de microscopie basée sur la spectrométrie de masse de nouvelle génération qui génère 40+ images plex de l’expression des protéines dans les tissus histologiques, permettant une dissection détaillée des phénotypes cellulaires et de l’organisation histoarchitecturale. Un goulot d’étranglement clé dans le fonctionnement se produit lorsque les utilisateurs sélectionnent les emplacements physiques sur le tissu pour l’imagerie. À mesure que l’échelle et la complexité des expériences MIBI ont augmenté, l’interface fournie par le fabricant et les outils tiers sont devenus de plus en plus difficiles à manier pour l’imagerie de grandes puces à tissus et de zones de tissus en mosaïque. Ainsi, une couche d’interface graphique interactive basée sur le Web, basée sur le Web, est ce que vous obtenez (WYSIWYG) - l’interface TILE/SED/array (TSAI) - a été développée pour que les utilisateurs puissent définir des emplacements d’imagerie à l’aide de gestes de souris familiers et intuitifs tels que le glisser-déposer, le cliquer-glisser et le dessin de polygones. Écrit selon les normes Web déjà intégrées dans les navigateurs Web modernes, il ne nécessite aucune installation de programmes externes, d’extensions ou de compilateurs. D’intérêt pour les centaines d’utilisateurs actuels de MIBI, cette interface simplifie et accélère considérablement la configuration d’exécutions MIBI volumineuses et complexes.

Introduction

L’imagerie par faisceau d’ions multiplexés (MIBI) est une technique permettant d’imager simultanément 40+ protéines sur des coupes de tissus histologiques à^{une résolution allant} jusqu’à 250 nm ^1,2,3. Après la coloration d’une coupe de tissu histologique à l’aide d’anticorps marqués avec des métaux élémentaires isotopiquement purs, l’instrument MIBI effectue une spectrométrie de masse d’ions secondaires pour quantifier simultanément tous les isotopes - et donc l’expression de tous les antigènes 40+ - à des endroits individuels du tissu. Réalisées sur des grilles de millions de points, les 40+ images plex résultantes de l’expression des protéines permettent la délimitation des limites cellulaires et l’identification de types cellulaires spécifiques tout en préservant le contexte spatial 1,2,3,4. Cette technique a été utilisée par des centaines d’utilisateurs sur environ 20 sites pour étudier la composition cellulaire, les profils métaboliques et/ou l’architecture de dizaines de types de tissus dans le cadre de l’examen de la réponse immunitaire aux tumeurs, de l’inflammation tissulaire causée par des agents infectieux, de la neuropathologie de la démence et de la tolérance immunitaire pendant la grossesse ^{5,6,7,8,9, 10,11}.

L’un des principaux goulets d’étranglement dans le fonctionnement de l’instrument MIBI est la configuration des champs de vision (FOV) - 200 x 200^{μm 2} à 800 x 800 μm² zones du tissu - pour l’imagerie. Le MIBI image un FOV à la fois, jusqu’à 800 x 800 μm², de sorte que l’imagerie de zones plus grandes nécessite l’assemblage de plusieurs FOV. L’imagerie d’une puce à tissus (p. ex., huit tissus circulaires dans la figure 1A) implique de placer plusieurs champs de vision espacés. Pour configurer les champs de vision, l’interface du fabricant fournit 1) une image de caméra optique de la lame avec un réticule qui correspond à peu près à la coordonnée d’imagerie spécifiée (Figure 1A) et 2) une image de détecteur d’électrons secondaires (SED) qui montre la zone exacte aux coordonnées, avec une précision de 0,1 μm près (Figure 1B). Tout d’abord, l’utilisateur positionne grossièrement un seul champ de vision à l’aide de l’image optique. Étant donné que la résolution de l’image n’est que d’environ 60 μm par pixel, si le placement est décalé de deux pixels (2 pixels x 60 μm par pixel), un FOV standard de 400 μm sera décalé de 30 %. Ainsi, l’utilisateur doit utiliser l’image SED pour affiner la position - une séquence fastidieuse d’une douzaine d’étapes impliquant plusieurs fenêtres contextuelles, la saisie des coordonnées dans des zones de texte, le coup de pouce lent du SED avec des boutons de contrôle directionnel et souvent même l’écriture des coordonnées sur papier (Figure supplémentaire 1). Ce processus doit être répété pour chaque point d’une micropuce à tissus (TMA) de 100+ cœurs. Certains outils tiers peuvent aider au positionnement approximatif initial¹². Cependant, ils nécessitent toujours des connaissances en programmation, et le positionnement final se fait toujours par le biais du processus en douze étapes. Il est également très difficile de positionner des grilles de champs de vision adjacents, qui seront ensuite assemblées en une image panoramique en mosaïque.

Ainsi, l’interface tuile/SED/matrice (TSAI) a été développée dans le but de permettre aux utilisateurs de positionner rapidement un grand nombre de FOV à l’aide d’une interface graphique intuitive et interactive. TSAI se compose de deux composants principaux : 1) une interface utilisateur graphique basée sur le Web (Web UI) pour placer rapidement les points TMA et les tuiles de tissu, et 2) les intégrations dans l’interface de contrôle utilisateur MIBI pour générer une image SED en mosaïque et ajuster les positions FOV. Si l’on n’utilise que l’image optique, de nombreux FOV peuvent être positionnés grossièrement, puis rapidement ajustés à l’aide des outils de navigation/réglage du FOV (Figure 2, TSAI, branche gauche). Cependant, si la mosaïque SED est effectuée, les champs de vision peuvent être positionnés avec précision sur l’image SED en mosaïque sans qu’il soit nécessaire d’effectuer d’autres ajustements en mode SED (Figure 2, TSAI, branche droite). D’intérêt général pour des centaines d’utilisateurs actuels de MIBI, ces outils simplifient considérablement la mosaïque et le positionnement TMA, même pour les novices, et réduisent les configurations complexes d’exécution MIBI de plusieurs heures à quelques dizaines de minutes.

Protocole

1. Chargement de TSAI

1. Exécutez TSAI en ouvrant https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai dans le navigateur Web de l’ordinateur de contrôle de l’utilisateur MIBI.
   1. Cette instance de TSAI contient des préréglages personnalisés qui ne s’appliquent pas à tous les instruments. Lorsque vous l’utilisez, construisez des tuiles uniquement à partir du ou des FOV du modèle, comme généré ci-dessous à l’étape 2.6. TSAI s’exécute localement dans le navigateur Web, et aucune image, .json ou nom de fichier n’est envoyée ou stockée sur le serveur.
2. Vous pouvez également configurer TSAI sur n’importe quel site Web avec des préréglages personnalisés pour n’importe quel instrument.
   1. Allez dans https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai et téléchargez le répertoire mibi_tsai_standalone. Vous pouvez également télécharger le fichier de codage supplémentaire 1 .zip fichier et décompresser le contenu dans un répertoire intitulé mibi_tsai_standalone.
   2. Ouvrez mibi_tsai_standalone/_resources/index.js dans n’importe quel éditeur de texte.
   3. Si nécessaire, modifiez la taille du champ de vision, le choix du temps de séjour/synchronisation, la taille du raster, le JSON du champ de vision et les paramètres prédéfinis recommandés dans index.js pour correspondre aux paramètres de l’instrument. Cela s’applique principalement aux instruments personnalisés, mais les paires de choix de temps d’arrêt/synchronisation doivent être vérifiées de toute façon. Économisez index.js.
   4. Téléchargez mibi_tsai_standalone sur n’importe quel serveur Web accessible via Internet, par exemple, un site Web de laboratoire ou un site Web hébergé par une université.
   5. Ouvrez mibi_tsai_standalone/index.html dans le navigateur Web de l’ordinateur de contrôle de l’utilisateur MIBI.

2. Chargement de la diapositive MIBI et création d’un fichier modèle

1. Connectez-vous au suivi de l’expérience MIBI (interface Web fournie par le fabricant pour la gestion des métadonnées liées à l’analyse) dans le navigateur Web.
2. Dans l’onglet Diapositives , ajoutez une nouvelle diapositive et ajoutez une nouvelle section (Figure supplémentaire 2A-B). Dans l’onglet Ressources , sélectionnez ou créez un panneau de marqueurs (Figure supplémentaire 2C).
3. Dans l’onglet Sections , ajoutez la nouvelle section au panneau (Figure supplémentaire 2D).
4. Connectez-vous à l’interface de contrôle utilisateur MIBI dans le navigateur Web. Chargez la diapositive MIBI en cliquant sur Exchange Sample (Échanger l’échantillon) et en sélectionnant la nouvelle diapositive (Figure 3A supplémentaire).
5. Créez un modèle FOV en cliquant sur Ajouter un FOV (Figure supplémentaire 3B) et en définissant les dimensions de l’image, la taille du FOV, le temps d’arrêt, le mode d’imagerie et l’ID de section.
6. Exportez (téléchargez) la liste FOV dans un fichier .json (figure supplémentaire 3C). Téléchargez l’image optique sous forme de fichier .png (figure supplémentaire 3D).

3. Co-enregistrement du moteur de l’étage d’image optique

1. Ouvrez l’interface utilisateur Web TSAI dans le navigateur Web. Si le co-enregistrement n’a pas été effectué auparavant, le menu de co-enregistrement optique devrait s’ouvrir automatiquement. Si cela a été effectué et qu’il est adéquat, ne répétez pas ces étapes.
2. Ouvrez le menu Coregistration optique . Cliquez sur Copier le code de coregistration automatique dans le presse-papiers (Figure 4A supplémentaire).
3. Ouvrez l’interface de contrôle utilisateur MIBI dans le navigateur Web. Appuyez sur Ctrl+Maj+J pour ouvrir la console du navigateur, ou cliquez avec le bouton droit de la souris sur la page et cliquez sur Inspecter, puis ouvrez l’onglet Console (Figure supplémentaire 4B).
4. Collez le code dans la console et appuyez sur Entrée. Cliquez sur le lien généré dans la console (Figure 4C supplémentaire). Cela chargera le co-enregistrement dans l’interface utilisateur Web TSAI et l’enregistrera en tant que cookie, de sorte qu’il persiste et n’a pas besoin d’être répété à moins qu’il n’y ait une modification du matériel de l’instrument.

4. Balayage SED en mosaïque

1. Chargez le .png d’image optique et .json fichiers à partir de l’étape 2.6 en les faisant glisser et en les déposant sur l’interface utilisateur Web TSAI.
2. Ouvrez le menu SED Tiler et cliquez sur une zone de texte dans la rangée supérieure (Figure supplémentaire 5A).
3. Cliquez (± faites glisser) sur l’image optique pour sélectionner le coin supérieur gauche pour le balayage SED (Figure supplémentaire 5B).
4. Appuyez sur la touche D ou cliquez sur une zone de texte dans la deuxième rangée du menu SED Tiler.
5. Cliquez (± faites glisser) sur l’image optique pour sélectionner le coin inférieur droit pour le balayage SED.
6. Dans le menu Mosaïque SED , cliquez sur Copier la numérisation SED et Décaler le code de correction dans le Presse-papiers (Figure 5C supplémentaire).
7. Ouvrez l’interface de contrôle utilisateur MIBI dans le navigateur Web. Collez le code dans la console et appuyez sur Entrée (Figure supplémentaire 5D).
8. Mettez le MIBI en mode SED sur le réglage QC - 300 μm, déplacez-vous vers une zone qui ne sera pas acquise et ajustez le gain, la mise au point et la stigmatisation.
   1. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image SED sans modifier le gain. Appuyez sur B pour augmenter la luminosité ou sur Maj+B pour la diminuer. Appuyez sur C pour augmenter le contraste ou sur Maj+C pour le diminuer. Appuyez sur Maj+V pour réinitialiser la luminosité et le contraste.
9. Appuyez sur Maj+T pour démarrer l’analyse SED en mosaïque.
10. Une fois l’opération terminée, elle doit enregistrer automatiquement un nouveau fichier .png de l’image SED en mosaïque (Figure 3). Des caractères peuvent être ajoutés au début du nom de fichier, mais ne modifient aucune autre partie du nom de fichier.
11. Si des tuiles spécifiques sont floues ou mal numérisées, numérisez-les à nouveau.
    1. Appuyez sur Maj+R pour ajouter une tuile à la file d’attente de réanalyse. Une boîte de dialogue s’ouvre, invitant l’utilisateur à saisir la ligne et la colonne de la tuile. Les numéros sont indexés par zéro, ce qui permet d’entrer dans les files d’attente 8,0 de la neuvième ligne, de la première colonne.
    2. Après avoir ajouté toutes les tuiles pertinentes à la file d’attente, appuyez sur Maj+T pour relancer. Une fois terminé, il devrait enregistrer automatiquement un nouveau fichier .png de l’image SED en mosaïque.
12. Étape critique : Inspectez le balayage SED en mosaïque pour détecter les désalignements importants (Figure 3C-D). Le cas échéant, contactez l’assistance du fabricant pour régler le moteur et le faisceau d’imagerie ou essayez la correction logicielle manuelle à l’aide des commandes du clavier aux étapes 4.12.1 à 4.12.9 (Figure supplémentaire 6A).
    1. Pour vérifier l’alignement du moteur de l’étage SED, déplacez-vous vers une zone de la glissière sans tissu. Appuyez sur Maj+5 pour graver cinq champs de vision de 400 μm en damier (Figure supplémentaire 6B-C) ou sur Maj+9 pour graver un motif 3 x 3 de 400 μm FOV (Figure supplémentaire 6D-E).
    2. Si les colonnes FOV sont trop éloignées, appuyez sur 1 et définissez la valeur x f(x) sur une décimale négative, généralement comprise entre -0,0025 et -0,1.
    3. Si les champs de vision de la troisième rangée sont décalés vers la gauche par rapport aux champs de vision de la première rangée, appuyez sur 2 et réglez la valeur x f(y) sur une décimale positive, généralement comprise entre 0,0025 et 0,1.
    4. Si les champs de vision de la troisième colonne sont décalés vers le bas par rapport aux champs de vision de la première colonne, appuyez sur 3 et définissez la valeur y f(x) sur une décimale négative, généralement comprise entre -0,0025 et -0,1.
    5. Si les lignes du champ de vision sont trop éloignées, appuyez sur 4 et définissez la valeur y f(y) sur une décimale négative, généralement comprise entre -0,0025 et -0,1.
    6. Répétez de manière itérative les étapes 4.12.1 à 4.12.5 jusqu’à ce que le damier et les motifs 3 x 3 forment une grille à peu près droite (figure supplémentaire 6C, E).
    7. Appuyez sur S pour enregistrer une image .png du motif avec les valeurs de correction dans le nom de fichier.
    8. Faites glisser et déposez ce fichier .png sur l’interface utilisateur Web TSAI pour charger les valeurs et les enregistrer dans le cookie du navigateur.
    9. Effectuez des balayages SED en mosaïque pour vérifier les coefficients. Sur la base des mêmes principes qu’aux étapes 4.12.2 à 4.12.5, ajustez davantage les coefficients pour corriger les désalignements dans les images SED en mosaïque.
13. Si le SED en mosaïque est adéquat, appuyez sur Échap. Revenez à l’interface utilisateur Web de TSAI.
14. Faites glisser et déposez le fichier SED .png en mosaïque sur l’interface utilisateur Web TSAI (Figure 5E supplémentaire).
15. Cliquez sur l’onglet SED et ajustez le zoom (Figure supplémentaire 5F).
16. Pour régler la luminosité et le contraste de l’image et/ou les options de dessin telles que l’épaisseur des lignes et la taille du curseur, utilisez le menu des options de la diapositive situé au-dessus de l’image SED.
17. Les raccourcis clavier sont disponibles et les plus affichés à côté des commandes de l’image : Appuyez sur Z pour effectuer un zoom avant et Maj+Z pour effectuer un zoom arrière. Appuyez sur B pour augmenter la luminosité ou sur Maj+B pour la diminuer. Appuyez sur C pour augmenter le contraste ou sur Maj+C pour le diminuer. Appuyez sur Maj+V pour réinitialiser la luminosité et le contraste. Appuyez sur L pour basculer les étiquettes au-dessus des tuiles. Appuyez sur O pour basculer les cercles de 5 mm de rayon dessinés autour des sites de mise au point.

5. Microréseau de tissus (TMA)

1. Si vous définissez des champs de vision pour une grille de points TMA, définissez d’abord le motif de champs de vision à répliquer. Dans la tuile appropriée de la colonne Tuiles, ajustez les colonnes et les rangées (Figure 4A) et cochez/décochez les cases de la carte (Figure 4B), ainsi que d’autres paramètres de FOV si nécessaire.
2. Dans la vignette appropriée, cliquez sur TMA pour ouvrir le menu des options TMA (Figure 4C). Définissez le nombre de lignes et de colonnes de points TMA (Figure 4D). Si nécessaire, ajoutez un préfixe de nommage (Figure 4E) et modifiez la numérotation des lignes et des colonnes de début (Figure 4F).
3. Sur l’image de la diapositive, cliquez sur les quatre coins de l’AMT (Figure 4G-J). Cliquez et faites glisser les coins cerclés pour ajuster le positionnement du réticule afin qu’il corresponde au mieux aux points TMA.
4. Cliquez sur Build TMA dans le menu des options TMA (Figure 4K).
5. Passez la souris sur chaque tuile de la colonne des tuiles pour vérifier son positionnement. Pour ajuster, cliquez sur Déplacer (Figure 4L). Cliquez ensuite sur l’image de la diapositive et faites-la glisser ou appuyez sur les touches fléchées du clavier.
   1. Maintenez la touche Maj enfoncée tout en appuyant sur les touches fléchées pour vous déplacer sur une plus grande distance. Maintenez la touche Alt (Windows) ou Opt (Mac) enfoncée tout en appuyant sur les touches fléchées pour vous déplacer sur une distance plus courte.
   2. Lorsque déplacer est sélectionné, appuyez sur T pour décocher la case en regard du nom de la tuile, la supprimer de la vue et l’omettre de tous les fichiers .json générés par la suite. Vous pouvez également décocher la case directement à l’aide de la souris (Figure 4M) ou la supprimer complètement en cliquant sur Supprimer.
   3. Lorsque l’option Déplacer est sélectionnée, appuyez sur 2, 4 ou 8 pour définir la taille du champ de vision sur 200 μm, 400 μm ou 800 μm, respectivement, et les dimensions raster seront mises à l’échelle proportionnellement de sorte que la résolution d’imagerie reste inchangée.
   4. Lorsque déplacer est sélectionné, appuyez sur A pour accéder à la tuile précédente ou appuyez sur D pour passer à la tuile suivante.
   5. Pour ajuster d’autres paramètres de vignette, cliquez sur le bouton ≡ pour développer le menu des paramètres s’il n’est pas visible.

6. Tuile surfacique/polygonale

1. Si vous réglez les champs de vision pour couvrir une zone contiguë de tissu, ajustez d’abord les paramètres de champ de vision si nécessaire dans la tuile appropriée de la colonne Tuiles.
2. Dans la tuile appropriée, cliquez sur Polygone (Figure 5A). Cliquez sur l’image de la diapositive pour définir les sommets/coins de la zone à mosaïque (Figure 5B-C). Double-cliquez pour fermer le polygone et couvrir la zone avec des champs de vision (Figure 5D).
3. Faites défiler la page jusqu’au bas de la colonne Tiles et cliquez sur le bouton ≡ (^ lorsqu’il est développé, Figure 5E) dans la nouvelle tuile polygonale pour afficher la carte des tuiles.
4. Activez ou désactivez des tuiles individuelles en cliquant sur la carte des tuiles (Figure 5F), ou en cliquant sur Clicker (Figure 5G) et en cliquant sur les champs de vision en mosaïque dans l’image de la diapositive.
5. Pour désactiver plusieurs champs de vision, cliquez sur Gomme , puis cliquez et faites glisser les champs de vision en mosaïque dans l’image de la diapositive (Figure 5H).
6. Pour activer plusieurs champs de vision, cliquez sur Clicker (Figure 5G), puis cliquez et faites glisser le curseur sur les zones vides de l’image de la diapositive couvertes par la carte de mosaïque.
7. Pour insérer les rangées ci-dessus, cliquez sur le bouton ▲ (Figure 5I). Pour insérer des colonnes à gauche, cliquez sur le bouton ◄ (Figure 5J).
8. Pour ajuster le positionnement des tuiles, cliquez sur Déplacer (Figure 5K). Cliquez ensuite sur l’image de la diapositive et faites-la glisser, appuyez sur les touches fléchées du clavier ou utilisez d’autres commandes décrites aux étapes 5.5.1 à 5.5.5.

7. Navigation et réglage du FOV

1. Si la mosaïque SED n’est pas alignée ou si le réticule de l’image optique ne reflète pas la position réelle du moteur de la scène, ajustez les positions du champ de vision en mode SED dans l’interface de contrôle utilisateur MIBI à l’aide des commandes clavier ci-dessous.
2. Ouvrez le menu de navigation/réglage du champ de vision sous l’image de la diapositive (optique ou SED). Cliquez sur Copier le code de navigation FOV dans le presse-papiers.
3. Ouvrez l’interface de contrôle utilisateur MIBI dans le navigateur Web. Mettez le MIBI en mode SED et ajustez le gain, la mise au point et la stigmatisation.
4. Appuyez sur Ctrl+Maj+J pour ouvrir la console du navigateur, ou cliquez avec le bouton droit de la souris sur la page et cliquez sur Inspecter, puis ouvrez l’onglet Console.
5. Collez le code dans la console et appuyez sur Entrée. Le code naviguera automatiquement vers le premier FOV et le positionnement exact du FOV affiché dans l’image SED de l’interface de contrôle utilisateur MIBI.
6. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image SED sans modifier le gain. Appuyez sur B pour augmenter la luminosité ou sur Maj+B pour la diminuer. Appuyez sur C pour augmenter le contraste ou sur Maj+C pour le diminuer. Appuyez sur Maj+V pour réinitialiser la luminosité et le contraste.
7. Pour régler le grossissement SED, appuyez sur les touches M (200 μm), , (400 μm), . (800 μm) ou / (maximum).
8. Pour déplacer le FOV, appuyez sur les touches fléchées du clavier. Enregistrez la position en appuyant sur W. Maintenez la touche Maj enfoncée tout en appuyant sur les touches fléchées pour vous déplacer sur une plus grande distance. Maintenez la touche Alt (Windows) ou Opt (Mac) enfoncée tout en appuyant sur les touches fléchées pour vous déplacer sur une distance plus courte. Notez que seul R1C1 d’une tuile donnée peut être déplacé.
9. Pour activer ou désactiver un champ de vision, appuyez sur T. Pour modifier la taille du champ de vision, appuyez sur 2 (200 μm), 4 (400 μm) ou 8 (800 μm). Les dimensions raster seront mises à l’échelle proportionnellement de sorte que la résolution de l’image reste la même.
10. Pour enregistrer un fichier image de l’image SED et du réticule superposé, appuyez sur S. Pour enregistrer un brouillon des ajustements dans un fichier .txt, appuyez sur X.
11. Lorsque vous êtes satisfait, appuyez sur D pour passer au FOV suivant, ou sur A pour revenir au FOV précédent. Répétez les étapes 7.6 à 7.11 pour tous les FOV.
12. Lorsque vous avez terminé avec tous les FFO, appuyez sur X ou Échap. Les ajustements seront enregistrés dans un fichier .txt et copiés dans le presse-papiers.
13. Revenez à l’interface utilisateur Web de TSAI. Faites glisser et déposez le fichier .txt sur l’interface utilisateur Web TSAI ou collez les ajustements dans la zone de texte du menu de navigation/réglage du champ de vision.
14. Cliquez sur Ajuster pour appliquer des ajustements aux vignettes de la colonne Vignettes.

8. JSON génération et importation de fichiers

1. Sous la colonne Tuiles, sous Sortie, vérifiez la liste des tuiles et la durée d’exécution estimée (Figure supplémentaire 7A).
2. Sous Groupe, sélectionnez une option pour le regroupement du champ de vision (Figure supplémentaire 7B). Le regroupement n’a aucun effet sur le fichier .json ordonné séquentiellement.
   1. Pour le fichier .json aléatoire, le regroupement des champs de vision par vignette ordonne les champs de vision de sorte que tous les champs de vision d’une vignette donnée restent ensemble, même si les vignettes sont dans un ordre aléatoire.
   2. Pour le fichier .json aléatoire, ne pas regrouper les champs de vision ordonnera de manière aléatoire les champs de sorte que les champs de vision de différentes tuiles soient mélangés.
   3. Si l’autofocus en cours d’exécution a été spécifié, les champs de vision seront automatiquement regroupés par le site de mise au point automatique le plus proche.
3. Sous Fractionnement, sélectionnez une option de fractionnement en plusieurs fichiers .json (Figure supplémentaire 7C).
   1. Ne pas diviser conservera tous les champs de vision dans un seul fichier .json.
   2. Divisé par tous les # FOVs divisera les FOV sur plusieurs fichiers .json, où chaque fichier contient le nombre spécifié de FOV.
   3. Divisé par toutes les # heures # minutes divisera les FOV sur plusieurs fichiers .json, où le temps d’exécution estimé de chaque fichier est à peu près la durée spécifiée.
4. Affichez et réorganisez l’ordre des FOV dans les fichiers .json en ouvrant le menu Réorganiser (Figure supplémentaire 7D). Pour déplacer un FOV, cliquez dessus et faites-le glisser vers la position souhaitée. Les autres FOV se réorganiseront de manière interactive autour du FOV déplacé.
5. Pour enregistrer le(s) fichier(s) .json, cliquez sur le(s) bouton(s) FOVs sous le menu de réorganisation. Le .json séquentiel classe les champs de vision par tuile, puis par ligne, puis par colonne (figure supplémentaire 7E). Le .json aléatoire randomise les champs de vision au sein des groupes sélectionnés à l’étape 8.2 (figure supplémentaire 7F).
6. Pour enregistrer une image du tissu avec les champs de vision et les options d’affichage appliquées (étiquettes de tuiles, luminosité, contraste, etc.), cliquez sur Enregistrer l’image en mosaïque (Figure supplémentaire 7G). Ceci est souvent utile pour la tenue de dossiers et le partage avec les collaborateurs.
7. Revenez à l’interface de contrôle utilisateur MIBI. Cliquez sur Importer les champs de vision et sélectionnez le fichier .json généré. Ajustez le focus, la stigmatisation et le courant si nécessaire, puis cliquez sur Démarrer l’exécution.

Résultats

TSAI propose deux méthodes pour configurer les FOV (Figure 2). L’une d’entre elles n’utilise que l’image optique (Figure 2, TSAI, branche de gauche), à l’instar d’autres méthodes existantes. La deuxième méthode, qui consiste à générer une image SED en mosaïque, est propre à TSAI (Figure 2, TSAI, branche de droite). TSAI dessine les FOV avec précision sur cette image, éliminan...

Discussion

L’imagerie par faisceau d’ions multiplexés (MIBI) est une technique puissante pour disséquer des phénotypes cellulaires détaillés et l’histoarchitecture tissulaire 5,6,7,8,9,10,11. Les efforts de calcul autour de MIBI se sont largement concentrés...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIBI computer	Ionpath
MIBIcontrol (software)	Ionpath
MIBIscope	Ionpath		Multiplexed Ion Beam Imaging (MIBI) microscope
MIBIslide	Ionpath	567001	Conductive slide for MIBI
Tile/SED/Array Interface (TSAI) (software)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/