Configurazione rapida dell'imaging di microarray tissutali e aree piastrellate sul microscopio multiplexed Ion Beam Imaging utilizzando l'interfaccia Tile/SED/Array

Riepilogo

L'imaging a fascio ionico multiplexato (MIBI) viene spesso utilizzato per l'imaging di microarray di tessuti e aree di tessuto contigue e piastrellate, ma l'attuale software per l'impostazione di questi esperimenti è ingombrante. L'interfaccia tile/SED/array è uno strumento grafico intuitivo e interattivo sviluppato per semplificare e accelerare notevolmente l'impostazione dell'esecuzione MIBI.

Abstract

L'imaging a fascio ionico multiplexato (MIBI) è una tecnica di microscopia basata sulla spettrometria di massa di nuova generazione che genera 40+ immagini plex dell'espressione proteica nei tessuti istologici, consentendo una dissezione dettagliata dei fenotipi cellulari e dell'organizzazione istoarchitettonica. Un collo di bottiglia chiave durante il funzionamento si verifica quando gli utenti selezionano le posizioni fisiche sul tessuto per l'imaging. Con l'aumento della portata e della complessità degli esperimenti MIBI, l'interfaccia fornita dal produttore e gli strumenti di terze parti sono diventati sempre più ingombranti per l'imaging di microarray di tessuti di grandi dimensioni e aree di tessuto piastrellate. Pertanto, è stato sviluppato un livello di interfaccia grafica WYSIWYG (Wide-You-See-is-What-You-Get) basato sul Web - l'interfaccia TSAI (tile/SED/array Interface) - per consentire agli utenti di impostare le posizioni di imaging utilizzando gesti del mouse familiari e intuitivi come il trascinamento della selezione, il clic e il trascinamento e il disegno poligonale. Scritto secondo gli standard web già integrati nei moderni browser web, non richiede l'installazione di programmi esterni, estensioni o compilatori. Di interesse per le centinaia di utenti MIBI attuali, questa interfaccia semplifica e accelera notevolmente l'impostazione di esecuzioni MIBI grandi e complesse.

Introduzione

L'imaging a fascio ionico multiplexato (MIBI) è una tecnica per l'imaging simultaneo di 40+ proteine su sezioni istologiche di tessuto con una risoluzione fino a 250 nm ^1,2,3. Dopo che una sezione istologica di tessuto è stata colorata utilizzando anticorpi marcati con metalli elementari isotopicamente puri, lo strumento MIBI esegue la spettrometria di massa di ioni secondari per quantificare simultaneamente tutti gli isotopi - e quindi l'espressione di tutti i 40+ antigeni - in singoli punti del tessuto. Eseguite su griglie di milioni di spot, le 40+ immagini plex risultanti dell'espressione proteica consentono la delineazione dei confini cellulari e l'identificazione di specifici tipi di cellule, preservando il contesto spaziale 1,2,3,4. Questa tecnica è stata utilizzata da centinaia di utenti in circa 20 siti per studiare la composizione cellulare, i profili metabolici e / o l'architettura di dozzine di tipi di tessuto come parte dell'esame della risposta immunitaria ai tumori, dell'infiammazione dei tessuti causata da agenti infettivi, della neuropatologia della demenza e della tolleranza immunitaria in gravidanza 5,6,7,8,9^{, 10,11}.

Un collo di bottiglia chiave nel funzionamento degli strumenti MIBI è l'impostazione dei campi visivi (FOV) - da 200 x 200 μm² a 800 x 800 μm² aree del tessuto - per l'imaging. Il MIBI visualizza un FOV alla volta, fino a 800 x 800 μm², quindi l'imaging di aree più grandi richiede l'unione di più FOV insieme. L'imaging di un microarray di tessuti (ad esempio, otto tessuti circolari nella Figura 1A) comporta il posizionamento di più FOV distanziati tra loro. Per impostare i FOV, l'interfaccia del produttore fornisce 1) un'immagine della telecamera ottica del vetrino con un mirino che corrisponde all'incirca alla coordinata di imaging specificata (Figura 1A) e 2) un'immagine del rivelatore di elettroni secondari (SED) che mostra l'area esatta alla coordinata, con una precisione di 0,1 μm (Figura 1B). Innanzitutto, l'utente posiziona approssimativamente un singolo FOV utilizzando l'immagine ottica. Poiché la risoluzione dell'immagine è solo di circa 60 μm per pixel, se il posizionamento è sfasato di due pixel (2 pixel x 60 μm per pixel), un FOV standard di 400 μm sarà sfasato del 30%. Pertanto, l'utente deve utilizzare l'immagine SED per mettere a punto la posizione: una noiosa sequenza di una dozzina di passaggi che coinvolgono più finestre popup, digitando le coordinate nelle caselle di testo, spingendo lentamente il SED con pulsanti di controllo direzionali e spesso anche scrivendo le coordinate su carta (Figura 1 supplementare). Questo processo deve essere ripetuto per ogni punto di un microarray di tessuto centrale (TMA) 100+. Alcuni strumenti di terze parti possono aiutare con il posizionamento approssimativo iniziale¹². Tuttavia, richiedono ancora alcune conoscenze di programmazione e il posizionamento finale viene ancora eseguito attraverso il processo in dozzine di passaggi. È anche molto problematico posizionare griglie di FOV adiacenti, che verranno successivamente cuciti insieme in un'immagine panoramica affiancata.

Pertanto, l'interfaccia tile/SED/array (TSAI) è stata sviluppata con l'obiettivo di consentire agli utenti di posizionare rapidamente un gran numero di FOV utilizzando un'interfaccia grafica intuitiva e interattiva. TSAI è costituito da due componenti principali: 1) un'interfaccia utente grafica basata sul web (web UI) per posizionare rapidamente i punti TMA e le tessere di tessuto, e 2) integrazioni nell'interfaccia di controllo utente MIBI per generare un'immagine SED affiancata e regolare le posizioni del FOV. Se si utilizza solo l'immagine ottica, è possibile posizionare approssimativamente molti FOV e quindi regolarli rapidamente utilizzando gli strumenti di navigazione/regolazione FOV (Figura 2, TSAI, ramo sinistro). Tuttavia, se viene eseguita la piastrellatura SED, i FOV possono essere posizionati con precisione sull'immagine SED affiancata senza bisogno di ulteriori regolazioni in modalità SED (Figura 2, TSAI, ramo destro). Di interesse generale per centinaia di utenti MIBI attuali, questi strumenti rendono l'affiancamento e il posizionamento TMA molto semplici anche per i principianti e riducono le complesse configurazioni di esecuzione MIBI da diverse ore a poche decine di minuti.

Protocollo

1. Caricamento del TSAI

1. Eseguire TSAI aprendo https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai nel browser Web del computer di controllo utente MIBI.
   1. Questa istanza di TSAI contiene preset personalizzati che non si applicano a tutti gli strumenti. Quando lo si utilizza, creare riquadri solo dai FOV dei modelli, come generato di seguito nel passaggio 2.6. TSAI viene eseguito localmente all'interno del browser Web e nessun dato di immagine, .json o nome file viene inviato o archiviato sul server.
2. In alternativa, configura TSAI su qualsiasi sito Web con preset personalizzati per qualsiasi strumento.
   1. Vai su https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai e scarica la directory mibi_tsai_standalone. In alternativa, scaricare il file di .zip Supplementary Coding File 1 e decomprimere il contenuto in una directory denominata mibi_tsai_standalone.
   2. Apri mibi_tsai_standalone/_resources/index.js in qualsiasi editor di testo.
   3. Se necessario, modificare la dimensione del FOV, la scelta del tempo/temporizzazione di permanenza, la dimensione del raster, il FOV JSON e le impostazioni preimpostate consigliate in index.js in modo che corrispondano alle impostazioni dello strumento. Questo vale principalmente per gli strumenti personalizzati, ma le coppie di scelta tempo/tempo di sosta devono essere controllate a prescindere. Risparmia index.js.
   4. Caricare mibi_tsai_standalone su qualsiasi server Web accessibile tramite Internet, ad esempio un sito Web di laboratorio o un sito Web ospitato da un'università.
   5. Aprire mibi_tsai_standalone/index.html nel browser Web del computer di controllo utente MIBI.

2. Caricamento della diapositiva MIBI e creazione di un file modello

1. Accedi al tracker degli esperimenti MIBI (interfaccia Web fornita dal produttore per la gestione dei metadati relativi alla scansione) nel browser Web.
2. Nella scheda Diapositive , aggiungere una nuova diapositiva e aggiungere una nuova sezione (Figura supplementare 2A-B). Nella scheda Risorse , selezionare o creare un pannello di marcatura (Figura 2C supplementare).
3. Nella scheda Sezioni , aggiungere la nuova sezione al pannello (Figura 2D supplementare).
4. Accedi all'interfaccia di controllo utente MIBI nel browser web. Caricare la diapositiva MIBI facendo clic su Scambia campione e selezionando la nuova diapositiva (Figura 3A supplementare).
5. Per creare un FOV modello, fare clic su Aggiungi FOV (Figura 3B supplementare) e impostare le dimensioni del fotogramma, le dimensioni del FOV, il tempo di permanenza, la modalità di imaging e l'ID sezione.
6. Esporta (scarica) l'elenco FOV in un file .json (Figura 3C supplementare). Scaricare l'immagine ottica come file .png (Figura supplementare 3D).

3. Coregistrazione ottica del motore dello stadio di immagine

1. Aprire l'interfaccia utente Web TSAI nel browser Web. Se la coregistrazione non è stata eseguita in precedenza, il menu di coregistrazione ottica dovrebbe aprirsi automaticamente. Se è stato eseguito ed è adeguato, non ripetere questi passaggi.
2. Aprire il menu Coregistrazione ottica . Fare clic su Copia codice di coregistrazione automatica negli Appunti (Figura 4A supplementare).
3. Aprire l'interfaccia di controllo utente MIBI nel browser Web. Premere CTRL+MAIUSC+J per aprire la console del browser oppure fare clic con il pulsante destro del mouse sulla pagina e scegliere Ispeziona, quindi aprire la scheda Console (Figura 4B supplementare).
4. Incolla il codice nella console e premi Invio. Fare clic sul collegamento generato nella console (Figura 4C supplementare). In questo modo la coregistrazione verrà caricata nell'interfaccia utente Web TSAI e salvata come cookie, in modo che persista e non debba essere ripetuta a meno che non venga apportata una modifica all'hardware dello strumento.

4. Scansione SED affiancata

1. Caricare l'immagine ottica .png e i file .json dal passaggio 2.6 trascinandoli e rilasciandoli nell'interfaccia utente Web TSAI.
2. Aprire il menu SED Tiler e fare clic su una casella di testo nella riga superiore (Figura supplementare 5A).
3. Fare clic (± trascinare) sull'immagine ottica per selezionare l'angolo in alto a sinistra per la scansione SED (Figura 5B supplementare).
4. Premere il tasto D o fare clic su una casella di testo nella seconda riga del menu TED Tiler.
5. Fare clic (± trascinare) sull'immagine ottica per selezionare l'angolo in basso a destra per la scansione SED.
6. Nel menu Piastrellista SED , fare clic su Copia il codice di correzione SED Scan and Shift negli Appunti (Figura 5C supplementare).
7. Aprire l'interfaccia di controllo utente MIBI nel browser Web. Incollare il codice nella console e premere Invio (Figura 5D supplementare).
8. Mettere il MIBI in modalità SED sull'impostazione QC - 300 μm, spostarsi in un'area che non verrà acquisita e regolare il guadagno, la messa a fuoco e lo stigma.
   1. Regola la luminosità e il contrasto dell'immagine SED senza modificare il guadagno. Premere B per aumentare la luminosità o Maiusc+B per diminuirla. Premere C per aumentare il contrasto o Maiusc+C per diminuirlo. Premere Maiusc+V per ripristinare sia la luminosità che il contrasto.
9. Premere Maiusc+T per avviare la scansione SED affiancata.
10. Al termine, dovrebbe salvare automaticamente un nuovo file .png dell'immagine SED affiancata (Figura 3). I caratteri possono essere aggiunti all'inizio del nome del file, ma non modificano altre parti del nome del file.
11. Se riquadri specifici non sono a fuoco o vengono scansionati in modo errato, eseguirne nuovamente la scansione.
    1. Premere MAIUSC+R per aggiungere un riquadro alla coda di ripetizione dell'analisi. Si aprirà una finestra di dialogo che richiede all'utente la riga e la colonna del riquadro. I numeri sono indicizzati a zero, quindi inserendo 8,0 si mette in coda la nona riga, la prima colonna.
    2. Dopo aver aggiunto tutti i riquadri pertinenti alla coda, premere Maiusc+T per ripetere la scansione. Al termine, dovrebbe salvare automaticamente un nuovo file .png dell'immagine SED affiancata.
12. Passaggio critico: ispezionare la scansione SED piastrellata per verificare la presenza di grandi disallineamenti (Figura 3C-D). Se presente, contattare l'assistenza del produttore per regolare il motore e il raggio di imaging o tentare la correzione manuale del software utilizzando i controlli della tastiera nei passaggi da 4.12.1 a 4.12.9 (Figura 6A supplementare).
    1. Per controllare l'allineamento del motore del tavolino SED, spostarsi in un'area del vetrino priva di tessuto. Premere Maiusc+5 per masterizzare cinque FOV da 400 μm in uno schema a scacchiera (Figura supplementare 6B-C) o Maiusc+9 per stampare un modello 3 x 3 di FOV da 400 μm (Figura supplementare 6D-E).
    2. Se le colonne FOV sono troppo distanti, premere 1 e impostare il valore x f(x) su un decimale negativo, in genere compreso tra -0,0025 e -0,1.
    3. Se i campi visivi della terza riga vengono spostati verso sinistra rispetto ai campi visivi della prima riga, premere 2 e impostare il valore x f(y) su un decimale positivo, in genere compreso tra 0,0025 e 0,1.
    4. Se i FOV della terza colonna sono spostati verso il basso rispetto ai FOV della prima colonna, premere 3 e impostare il valore y f(x) su un decimale negativo, in genere compreso tra -0,0025 e -0,1.
    5. Se le righe FOV sono troppo distanti, premere 4 e impostare il valore y f(y) su un decimale negativo, in genere compreso tra -0,0025 e -0,1.
    6. Ripetere iterativamente i passaggi da 4.12.1 a 4.12.5 fino a quando la scacchiera e i modelli 3 x 3 formano una griglia approssimativamente diritta (Figura 6C, E supplementare).
    7. Premere S per salvare un'immagine .png del motivo con i valori di correzione nel nome del file.
    8. Trascinare il file .png nell'interfaccia utente Web di TSAI per caricare i valori e salvarli nel cookie del browser.
    9. Eseguire scansioni SED piastrellate per verificare i coefficienti. Sulla base degli stessi principi dei passaggi da 4.12.2 a 4.12.5, apportare ulteriori regolazioni ai coefficienti per correggere eventuali disallineamenti nelle immagini SED affiancate.
13. Se il SED affiancato è adeguato, premere Esc. Tornare all'interfaccia utente Web di TSAI.
14. Trascinare e rilasciare il file .png SED affiancato nell'interfaccia utente Web TSAI (Figura 5E supplementare).
15. Fare clic sulla scheda SED e regolare lo zoom (Figura supplementare 5F).
16. Per regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine e/o le opzioni di disegno, come lo spessore della linea e la dimensione del cursore, utilizzare il menu delle opzioni della diapositiva sopra l'immagine SED.
17. Le scorciatoie da tastiera sono disponibili e la maggior parte viene mostrata accanto ai controlli dell'immagine: premi Z per ingrandire e Maiusc+Z per ridurre. Premere B per aumentare la luminosità o Maiusc+B per diminuirla. Premere C per aumentare il contrasto o Maiusc+C per diminuirlo. Premere Maiusc+V per ripristinare sia la luminosità che il contrasto. Premere L per alternare le etichette sopra le tessere. Premere O per alternare i cerchi con raggio di 5 mm disegnati attorno ai siti di messa a fuoco.

5. Microarray tissutale (TMA)

1. Se si impostano i FOV per una griglia di spot TMA, impostare prima il modello di FOV da replicare. Nel riquadro pertinente della colonna Piastrelle, regolare le colonne e le righe (Figura 4A) e selezionare/deselezionare le caselle nella mappa (Figura 4B), oltre a regolare altre impostazioni FOV se necessario.
2. Nel riquadro pertinente, fare clic su TMA per aprire il menu delle opzioni TMA (Figura 4C). Impostare il numero di righe e colonne di spot TMA (Figura 4D). Se necessario, aggiungere un prefisso di denominazione (Figura 4E) e modificare la numerazione iniziale delle righe e delle colonne (Figura 4F).
3. Nell'immagine della diapositiva, fare clic sui quattro angoli del TMA (Figura 4G-J). Fare clic e trascinare gli angoli cerchiati per regolare il posizionamento del mirino in modo che corrispondano al meglio ai punti TMA.
4. Fare clic su Crea TMA dal menu delle opzioni TMA (Figura 4K).
5. Passa il mouse su ogni tessera nella colonna delle tessere per verificarne il posizionamento. Per eseguire la regolazione, fare clic su Sposta (Figura 4L). Quindi fare clic e trascinare sull'immagine della diapositiva o premere i tasti freccia della tastiera.
   1. Tieni premuto il tasto Maiusc mentre premi i tasti freccia per spostarti di una distanza maggiore. Tieni premuto il tasto Alt (Windows) o Opzione (Mac) mentre premi i tasti freccia per spostarti di una distanza più breve.
   2. Quando è selezionata l'opzione Sposta , premere T per deselezionare la casella di controllo accanto al nome del riquadro, rimuoverlo dalla visualizzazione e ometterlo da tutti i file di .json generati successivamente. In alternativa, deselezionare la casella di controllo direttamente con il mouse (Figura 4M) o rimuoverla completamente facendo clic su Elimina.
   3. Quando si seleziona sposta, premere 2, 4 o 8 per impostare la dimensione FOV rispettivamente su 200 μm, 400 μm o 800 μm e le dimensioni raster verranno ridimensionate proporzionalmente in modo tale che la risoluzione dell'immagine rimanga invariata.
   4. Quando è selezionata l'opzione Sposta , premere A per passare alla tessera precedente o premere D per passare alla tessera successiva.
   5. Per regolare altre impostazioni del riquadro, fare clic sul pulsante ≡ per espandere il menu delle impostazioni se non è visibile.

6. Tessera area/poligono

1. Se si impostano i campi visivi in modo che coprano un'area contigua di tessuto, regolare prima le impostazioni del campo visivo in base alle esigenze nel riquadro pertinente della colonna Riquadri.
2. Nel riquadro pertinente, fare clic su Poligono (Figura 5A). Fare clic sull'immagine della diapositiva per impostare i vertici/angoli dell'area da affiancare (Figura 5B-C). Fare doppio clic per chiudere il poligono e coprire l'area con FOV (Figura 5D).
3. Scorrere fino alla fine della colonna Tile e fare clic sul pulsante ≡ (^ quando espanso, Figura 5E) nel nuovo riquadro poligonale per visualizzare la mappa dei riquadri.
4. Attivare o disattivare le singole tessere facendo clic sulla mappa delle tessere (Figura 5F) o facendo clic su Clicker (Figura 5G) e facendo clic sui FOV affiancati nell'immagine della diapositiva.
5. Per disattivare più FOV, fare clic su Gomma , quindi fare clic e trascinare sui FOV affiancati nell'immagine della diapositiva (Figura 5H).
6. Per attivare più FOV, fare clic su Clicker (Figura 5G), quindi fare clic e trascinare sulle aree vuote nell'immagine della diapositiva coperta dalla mappa delle tessere.
7. Per inserire le righe sopra, fare clic sul pulsante ▲ (Figura 5I). Per inserire le colonne a sinistra, fare clic sul pulsante ◄ (Figura 5J).
8. Per regolare il posizionamento delle tessere, fare clic su Sposta (Figura 5K). Quindi fare clic e trascinare sull'immagine della diapositiva, premere i tasti freccia della tastiera o utilizzare altri controlli descritti nei passaggi da 5.5.1 a 5.5.5.

7. Navigazione e regolazione FOV

1. Se la tassellatura SED non è allineata o il mirino ottico dell'immagine non riflette l'effettiva posizione del motore del tavolino, regolare le posizioni FOV in modalità SED nell'interfaccia di controllo utente MIBI con l'aiuto dei seguenti controlli da tastiera.
2. Aprire il menu di navigazione/regolazione FOV sotto l'immagine della diapositiva (ottica o SED). Fare clic su Copia codice di navigazione FOV negli Appunti.
3. Aprire l'interfaccia di controllo utente MIBI nel browser Web. Metti il MIBI in modalità SED e regola il guadagno, la messa a fuoco e lo stigma.
4. Premere CTRL+MAIUSC+J per aprire la console del browser oppure fare clic con il pulsante destro del mouse sulla pagina e scegliere Ispeziona, quindi aprire la scheda Console.
5. Incolla il codice nella console e premi Invio. Il codice passerà automaticamente al primo FOV e all'esatto posizionamento del FOV visualizzato nell'immagine SED dell'interfaccia di controllo utente MIBI.
6. Regola la luminosità e il contrasto dell'immagine SED senza modificare il guadagno. Premere B per aumentare la luminosità o Maiusc+B per diminuirla. Premere C per aumentare il contrasto o Maiusc+C per diminuirlo. Premere Maiusc+V per ripristinare sia la luminosità che il contrasto.
7. Per regolare l'ingrandimento SED, premere i tasti M (200 μm), , (400 μm), . (800 μm) o / (massimo).
8. Per spostare il campo visivo, premere i tasti freccia della tastiera. Salvare la posizione premendo W. Tieni premuto il tasto Maiusc mentre premi i tasti freccia per spostarti di una distanza maggiore. Tieni premuto il tasto Alt (Windows) o Opzione (Mac) mentre premi i tasti freccia per spostarti di una distanza più breve. Si noti che solo R1C1 di una determinata tessera può essere spostato.
9. Per attivare o disattivare un FOV, premere T. Per modificare la dimensione del campo visivo, premere 2 (200 μm), 4 (400 μm) o 8 (800 μm). Le dimensioni raster verranno scalate proporzionalmente in modo che la risoluzione dell'immagine rimanga la stessa.
10. Per salvare un file immagine dell'immagine SED e del mirino sovrapposto, premere S. Per salvare una bozza delle regolazioni in un file .txt, premere X.
11. Quando sei soddisfatto, premi D per passare al campo visivo successivo o A per tornare al campo visivo precedente. Ripetere i passaggi da 7.6 a 7.11 per tutti i campi visivi.
12. Al termine di tutti i campi visivi, premi X o Esc. Le regolazioni verranno salvate in un file .txt e copiate negli appunti.
13. Tornare all'interfaccia utente Web di TSAI. Trascina e rilascia il file .txt nell'interfaccia utente Web TSAI o incolla le regolazioni nella casella di testo nel menu di navigazione/regolazione FOV.
14. Fare clic su Regola per applicare le regolazioni ai riquadri nella colonna Riquadri.

8. JSON generazione e importazione di file

1. Sotto la colonna Riquadri, in Output, controllare l'elenco dei riquadri e il tempo di esecuzione stimato (Figura 7A supplementare).
2. In Gruppo, selezionare un'opzione per il raggruppamento FOV (Figura 7B supplementare). Il raggruppamento non ha alcun effetto sul file .json ordinato in sequenza.
   1. Per il file di .json randomizzato, il raggruppamento dei FOV per riquadro ordinerà i FOV in modo tale che tutti i FOV all'interno di un determinato riquadro rimangano insieme, anche se i riquadri sono in ordine casuale.
   2. Per il file .json randomizzato, i FOV non raggruppare ordineranno in modo casuale i FOV in modo tale che i FOV di tessere diverse vengano mescolati.
   3. Se è stata specificata la messa a fuoco automatica in esecuzione, i FOV verranno automaticamente raggruppati in base al sito di messa a fuoco automatica più vicino.
3. In Dividi, selezionare un'opzione per la suddivisione in più file .json (Figura 7C supplementare).
   1. Non dividere manterrà tutti i FOV in un solo file .json.
   2. Dividi per ogni # FOV dividerà i FOV su più file .json, dove ogni file contiene il numero specificato di FOV.
   3. Dividi per ogni # ore # minuti suddividerà i FOV su più file .json, dove il tempo di esecuzione stimato di ciascun file è all'incirca la quantità di tempo specificata.
4. Visualizzare e riorganizzare l'ordine dei FOV nei file .json aprendo il menu Riordina (Figura 7D supplementare). Per spostare un campo visivo, fare clic e trascinarlo nella posizione desiderata. Gli altri FOV si riorganizzeranno in modo interattivo attorno al FOV trascinato.
5. Per salvare i file .json, fai clic sui pulsanti FOV sotto il menu di ridisposizione. Il .json sequenziale mette i FOV in ordine per riquadro, poi riga, poi colonna (Figura 7E supplementare). Il .json casuale randomizza i FOV all'interno dei gruppi selezionati nel passaggio 8.2 (Figura 7F supplementare).
6. Per salvare un'immagine del tessuto con i FOV e le opzioni di visualizzazione applicate (etichette delle piastrelle, luminosità, contrasto, ecc.), fare clic su Salva immagine affiancata (Figura 7G supplementare). Questo è spesso utile per la tenuta dei registri e la condivisione con i collaboratori.
7. Tornare all'interfaccia di controllo utente MIBI. Fare clic su Importa FOV e selezionare il file .json generato. Regolare lo stato attivo, lo stigma e la corrente in base alle esigenze e fare clic su Avvia esecuzione.

Risultati

TSAI fornisce due metodi per l'impostazione dei FOV (Figura 2). Si utilizza solo l'immagine ottica (Figura 2, TSAI, ramo sinistro), in modo simile ad altri metodi esistenti. Il secondo metodo, ovvero la generazione di un'immagine SED affiancata, è univoco per TSAI (Figura 2, TSAI, ramo destro). TSAI disegna i FOV in modo accurato su questa immagine, eliminando la necessità di passare ore a spinger...

Discussione

L'imaging a fascio ionico multiplexato (MIBI) è una potente tecnica per sezionare fenotipi cellulari dettagliati e istoarchitettura tissutale 5,6,7,8,9,10,11. Gli sforzi computazionali relativi a MIBI si sono in gran parte concentrati sull'elaborazione dei...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIBI computer	Ionpath
MIBIcontrol (software)	Ionpath
MIBIscope	Ionpath		Multiplexed Ion Beam Imaging (MIBI) microscope
MIBIslide	Ionpath	567001	Conductive slide for MIBI
Tile/SED/Array Interface (TSAI) (software)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/